Name: Rapida identificazione dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura Uso MALDI-TOF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: Scopri l'identificazione rapida dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura usando MALDI-TOF MS. Questo metodo accelera la diagnosi di batteriemie e supporta decisioni terapeutiche tempestive in microbiologia clinica.

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<html> 1. Sangue Cultura Brodi Segnala come &quot;Positive&quot; <ol><li> Rimuovere il flacone cultura sangue segnalata dal cabinet monitoraggio incubazione continuo e posizionarlo in una cappa di sicurezza biologica. Nota: Le bottiglie possono contenere microrganismi pericolosi e precauzioni universali devono essere seguite. A causa del rischio di aerosol infettivi di campionamento, tutte le procedure di campionamento devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare sicurezza biologica di classe II. </li></ol> 2. Gram Stain è preparato <ol><li> Preparare una colorazione di Gram dal segnalata brodo di coltura del sangue come da protocolli istituzionali locali. Nota: Quando microrganismi Gram-negativi sono identificati in microscopia brodo di coltura del sangue viene elaborata secondo il metodo seguente. Quando organismi Gram-positivi sono identificati, un metodo alternativo di targeting molecolare identificazione genetica e marcatori di resistenza viene applicata al brodo (non affrontato in questo articolo) 13. </li></ol>e &quot;&gt; 3. Trasferimento Segnalato Sangue brodo di coltura per una separazione tubo Serum <ol><li> Mescolare delicatamente il flacone cultura sangue invertendo 2-3x. </li><li> All&#39;interno dell&#39;armadio biosicurezza allegare una siringa da 10 ml per un dispositivo di trasferimento di sangue sicurezza. </li><li> Fissare il dispositivo di trasferimento di sangue al flacone di coltura sangue e prelevare 5 ml di brodo nella siringa. Trasferire il BC brodo aspirato in un tubo separazione del siero. </li></ol> 4. Concentrazione di Sangue brodo di coltura <ol><li> Centrifugare la provetta separazione del siero a 1.250 xg per 15 min che rimuove un grande volume di globuli rossi. </li><li> Aspirare e scartare il surnatante con una pipetta di trasferimento sterile facendo attenzione a lasciare circa 1 ml di buffy coat immediatamente sopra l&#39;interfaccia gel / liquido. Nota: Le bottiglie aerobici mostrano una netta separazione dei globuli rossi al fondo del tubo con l&#39;interfaccia gel / liquido apparire un colore bianco opaco. Al contrario, quandoapplicata al brodo di coltura anaerobica litico sangue dell&#39;interfaccia gel / liquido appare come un colore rosso intenso, grazie ai componenti di globuli rossi lisati rimanendo sospesi nel supernatante. </li></ol> 5. Ripetere centrifugazione Lavare Steps <ol><li> Mescolare delicatamente ultimi 1 ml di buffy coat fluido sopra l&#39;interfaccia gel con una pipetta sterile e poi trasferire l&#39;intero volume in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Centrifugare la nuova provetta a 288 xg per 30 sec. </li><li> Trasferire il surnatante con una usa e getta 1 ml pipetta di plastica in una nuova provetta da 1,5 ml e scartare il tubo con il pellet. Nota: è fondamentale in questa fase che si ha cura di evitare il trasferimento del pellet. Ciò è particolarmente importante per un campione da lavorare dalla bottiglia BC anaerobica come il surnatante rimane pigmentata e il pellet non è sempre chiaramente visibile. </li></ol> 6. Lisi di cellule residue </p&gt; <ol><li> Centrifugare il campione a 18.407 xg per 1 min e poi aspirare (e scarti), il surnatante con una multa pipetta di trasferimento a punta di lasciare come poco liquido residuo possibile senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere il pellet residuo in 1 ml di DNAse sterile e RNAsi acqua gratuita pipettando su e giù. Nota: Alcuni autori hanno descritto l&#39;uso di soluzioni alcoliche in luogo di acqua sterile per risospendere il pellet che rende batteri non vitali. </li><li> Centrifugare la soluzione risospeso a 18.407 xg per 1 min. </li></ol> 7. Estrazione di proteine ​​batteriche <ol><li> Aspirare e scartare il surnatante, sempre con l&#39;aspirazione con una pipetta punta fine in modo che quanto più liquido possibile, viene rimosso. </li><li> Risospendere il pellet in 10 ml di acido formico (70% v / v). Nota: Acido formico può influenzare il corpo se viene inalato o se non viene a contatto con la pelle. Durante la preparazione o soluzioni manipolazione è recommended che il personale utilizza un aspiratore oltre a dispositivi di protezione individuale. </li><li> Mescolare bene con la pipetta per garantire una soluzione risospeso omogenea. Utilizzando la punta della pipetta per interrompere fisicamente il pellet può essere necessaria per garantire una soluzione più omogenea. </li></ol> 8. Preparazione di MALDI-TOF target Piatto <ol><li> Seminare una piastra segnale MALDI-TOF pulita con 2 ml di sospensione preparata per ogni posto di destinazione. Preparare tre siti bersaglio per ogni campione per superare il problema occasionale di riuscita legge. </li><li> Lasciare che la piastra segnale MALDI-TOF ad asciugare. La velocità di essiccazione può essere aumentata inserendo la piastra sul bordo della cappa per massimizzare il flusso d&#39;aria attraverso la piastra. </li><li> Sovrapporre ogni spot essiccato con 1 ml di soluzione di matrice (/ ml di acido α-ciano-4-idrossicinnamico 10 mg (HCCA), 50% di acetonitrile, 2,5% di acido trifluoroacetico). Nota: la soluzione Matrix può influenzare il corpo se viene inalato o se entra in Contact con la pelle. Durante la preparazione o la manipolazione di soluzioni, si raccomanda che il personale utilizza un aspiratore oltre a dispositivi di protezione individuale. </li><li> Lasciare la piastra segnale MALDI-TOF asciugare sul bordo della cappa come descritto sopra. Assicurare un preparato omogeneo riempie ciascuno dei punti di riferimento sul piatto. </li></ol> 9. Luogo MALDI-TOF piastra bersaglio nello spettrometro di massa <ol><li> Inserire la piastra segnale MALDI-TOF nello spettrometro di massa MALDI-TOF. Assicurarsi che la piastra è seduto contatto con le piastre a molla. Nota: non inserire la piastra di mira fino a quando tutti i punti di riferimento sono asciutti. </li><li> Assicurarsi che la guarnizione in gomma sia pulita di lanugine, polvere e peli di consentire possono essere create le condizioni di vuoto richieste. </li><li> Chiudere il coperchio fase MALDI-TOF e quindi premere il tasto &quot;in / out&quot; sulla parte anteriore dello strumento. Il coperchio sarà ora bloccare e consentire il vuoto necessario da creare. </li></ol> 10. MALDI-TOF MS Spectra Acquisition <ol><li> Aprire il MALDI biotipizzazione e software FlexControl. </li><li> All&#39;interno del software Typing selezionare &quot;nuova classificazione&quot; dal menu a discesa intitolato &quot;file&quot;. Assegnare un nome al progetto e quindi selezionare &quot;nuovo&quot;. Selezionare &quot;Avanti&quot; per completare l&#39;installazione all&#39;interno del software Typing. </li><li> All&#39;interno della finestra del software di controllo di identificare l&#39;immagine sullo schermo della piastra di mira. Evidenziare i punti di destinazione MALDI-TOF che sono in uso spostando il mouse sopra i punti inoculati tenendo premuto il tasto sinistro del mouse. </li><li> Utilizzare il pulsante destro del mouse per fare clic su un punto qualsiasi delle posizioni di destinazione selezionati e quindi selezionare &quot;aggiungi analiti&quot; dal menu a discesa. </li><li> Aggiungi cultura del sangue estremi identificativi alla colonna &quot;ID&quot; per ciascuno dei luoghi di destinazione e fare clic su &quot;Avanti&quot; una volta completato. </li><li> Selezionare &quot;tassonomia&quot; banca dati spettri commerciali e selezionare &quot;Avanti&quot;. Nota: Laboratori possono utilizzare ulteriori internamente o database commerciali per aumentare il numero di spettri di riferimento. </li><li> Fare clic su &quot;Fine&quot; e il MALDI-TOF MS avrà inizio la generazione di spettri. Nota: le impostazioni MALDI-TOF erano per le impostazioni del produttore (in modalità lineare positiva, 60 di frequenza laser Hz, 20 kV tensione di accelerazione, 16,7 kV di tensione IS2, 170 di ritardo estrazione ns, e 2,000-20,137 gamma di m / z). </li><li> Se il software di controllo MALDI non riesce a generare picchi, acquisizione di spettri manuale può essere eseguita (metodo non descritto). </li></ol> 11. Analisi post Interpretazione dei MALDI-TOF MS Scores <ol><li> Una volta gli spettri vengono acquisiti e l&#39;analisi è completa, selezionare il pulsante &quot;+&quot; accanto alla identificazione delle specie sul software Typing per espandere l&#39;elenco di identificazione per ogni target. </li><li> Studiare i primi 5 identificazioni, notando se la top 5 sono simili. Discordanti primi 5 generi con punteggi ≥ 1.7 dello stesso obiettivopunto sollevato la possibilità di brodi misti. Nota: la tecnologia MALDI-TOF ha scarsa sensibilità per il rilevamento di brodi misti. Ad esempio, quando un brodo misto contiene specie un punteggio elevato fiducia può essere identificato solo per una delle specie miste. </li><li> Quando un punteggio ≥ 2.0 è nota per la partita più alta in un luogo di destinazione, riportare la specie. </li><li> Quando il punteggio più alto in un punto bersaglio è ≥ 1.7, ma &lt;2,0, riportano solo i generi. Se criteri aggiuntivi dei primi 5 identificazioni sono concordanti, poi riferire a livello di specie. </li></ol> 12. Rimozione di MALDI-TOF target Piatto <ol><li> Quando tutti gli spettri sono complete premere il tasto &quot;in / out&quot; sulla macchina MALDI-TOF. </li><li> Aprire la piastra di mira ricettacolo MALDI-TOF e rimuovere la piastra bersaglio MALDI-TOF. </li><li> Se si utilizza una piastra segnale MALDI-TOF riutilizzabili, puliti tutti i punti di destinazione utilizzando alcool e conservare la piastra MALDI-TOF a temperatura ambiente una volta che è pulita e asciutta. </li></ol>

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<li>Moussaoui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+identifies+90%25+of+bacteria+directly+from+blood+culture+vials%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials.</a> Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).</li>
<li>Novel,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((improved+sample+preparation+for+rapid%2C+direct+identification+from+positive+blood+cultures+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+%28MALDI-TOF%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry.</a> J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

E &#39;importante quando si applica MALDI-TOF MS alla cultura del sangue brodo che le operazioni di post centrifugazione vengono eseguite con sufficiente attenzione a non rimescolare i componenti separati. È particolarmente importante rimuovere i componenti di coltura sangue e proteine ​​cellulari umani, compresi emoglobina, che possono produrre picchi interferenti con gli spettri MALDI-TOF. Anche se MS produce consiglia di tagliare punteggio ≥ 2.0 per le specie e ≥ 1.7 per l&#39;identificaz...

I pazienti con infezione sangue (BSI) a causa di batteri continuano ad avere alta mortalità in ospedale, che vanno 6-48% 1. La consegna di un adeguato antibiotica empirica promuove la sopravvivenza e nel sottogruppo di pazienti con sepsi grave, ogni ora di ritardo alla terapia appropriata è correlato alla diminuzione della sopravvivenza 2,3. Di conseguenza, un obiettivo chiave del laboratorio clinico è quello di rilevare rapidamente, identificare e comunicare la presenza di batteri nelle colture di sangue per informare le decisioni cliniche. È stato dimostrato che il laboratorio microbiologia ha la più grande influenza sulla terapia antimicrobica al momento di segnalare la colorazione di Gram 4 e recentemente, uno studio d&#39;osservazione ha dimostrato che il tempo desorbimento laser assistita dalla matrice / ionizzazione di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS) eseguita direttamente sul brodi di coltura di sangue influenzare la prescrizione in oltre un terzo di BSI causate da batteri Gram-negativi 5. 6,7. La tecnologia è ormai ben consolidata ed è stato integrato in molti laboratori per l&#39;identificazione rapida e accurata dei microrganismi isolati su supporti 6,8 solida. L&#39;applicazione diretta di MALDI-TOF MS alla cultura del sangue (BC) brodo che hanno segnalato &quot;positivo&quot; per i microrganismi appello a entrambi i medici e responsabili di laboratorio a causa della possibilità di ottenere la tempestiva individuazione dei microrganismi a basso costo. L&#39;utilità clinica di applicazione diretta di MALDI-TOF MS alla cultura del sangue brodo è stato limitato dalla vasta gamma di sensibilità osservati rispetto ai metodi di coltura fenotipica standard di base di identificazione, con i rapporti di identificazione successo dei batteri Gram-negativi che vanno 47-98,9 9-11%. La variazione di sensibilità probabilesi riferisce alla composizione aC brodo, concentrazione batterica iniziale, variazione nei metodi di preparazione del campione e la gamma di microrganismi Gram-negativi riscontrati in popolazioni di studio 9. Rispetto a questi altri protocolli pubblicati il ​​metodo qui presentato evita l&#39;uso di etanolo, cloruro di ammonio o aggiuntivo (non a matrice) acetonitrile. Come risultato il pellet batterico rimanere vitali (fino al punto di estrazione delle proteine) consentendo potenziali metodi di prova sensibilità fenotipica da applicare direttamente a questi organismi in brodo. Inoltre, il metodo presentato ha dimostrato di essere poco costoso, affidabile e rapido con identificazione batterica disponibile entro 25 min delle emocolture Gram risultati della colorazione, con minime &#39;mani&#39; tempo 12. Questo metodo è un semplice protocollo spin-lisi in casa utilizzando estrazione acido formico applicato direttamente positivi brodi di coltura sangue per identificare Gram negativi bacteria con la tecnologia MALDI-TOF MS.

<table><tbody><tr><td>BACTEC Plus Aerobico/F Medio</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>442192</td><td></td></tr><tr><td>BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F Medium</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, Stati Uniti</td><td>442265</td><td></td></tr><tr><td>BACTEC Peds Plus Medium</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, Stati Uniti</td><td>442194</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer - Dispositivo per il trasferimento del sangue</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>364880</td><td>Dispositivo di campionamento monouso che riduce il rischio di lesioni da aghi</td></tr><tr><td>Vacutainer SST 5,0 ml, Advance plus</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>367954</td><td>Tubo di separazione del siero Siringa</td></tr><tr><td>10 ml</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>302143</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento</td><td>Samco, USA</td><td>222-20S</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento (con punta fine)</td><td>Samco, USA</td><td>232-20S</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga (2,0 ml)</td><td>Eppendorf, Amburgo, Germania</td><td>0030.120.094</td><td></td></tr><tr><td>Acqua sterile (priva di DNAsi e RNAsi)</td><td>Life Technologies, Carlsbad, California, USA</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione a matrice&nbsp;</td><td>Bruker Daltonics, Brema Germania</td><td>285074</td><td>10 mg/ml di acido &alfa;-ciano-4-idrossicinnamico, 50% acetonitrile, 2,5% acido trifluoroacetico</td></tr><tr><td>Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS</td><td>Bruker Daltonics, Brema Germania</td><td></td><td>Utilizzando i software BioTyper 3.1 (Build 65) e FlexControl 3.3 (Build 99)</td></tr></tbody></table>

rapida identificazione dei batteri gram-negativi dal sangue brodo di coltura uso maldi-tof

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Un ruolo importante del laboratorio di microbiologia clinica è quello di fornire una rapida identificazione dei batteri che causano infezioni flusso sanguigno. L&#39;identificazione tradizionale richiede la sub-cultura del segnalato brodo di coltura di sangue con l&#39;identificazione disponibili solo dopo colonie su agar solido hanno maturato. MALDI-TOF MS è un metodo rapido affidabile per l&#39;identificazione della maggioranza dei batteri clinicamente rilevanti quando applicato colonie su supporti solidi. L&#39;applicazione di MALDI-TOF MS direttamente alla cultura del sangue brodo è un approccio interessante in quanto ha il potenziale di accelerare l&#39;identificazione delle specie di batteri e migliorare la gestione clinica. Tuttavia, un problema importante da superare è la rimozione pre-analisi di interferenti resine, proteine ​​e di emoglobina contenute nei campioni di sangue di cultura che, se non rimosso, interferiscono con la MS spettri e può portare a punteggi di identificazione discriminazione insufficienti o bassi. Inoltre è necessario concentrare Bacteria per sviluppare spettri di qualità sufficiente. Il metodo presentato descrive la concentrazione, la purificazione e l&#39;estrazione dei batteri Gram-negativi che consentano l&#39;identificazione precoce dei batteri da un segnalata cultura sangue brodo.

Il generata MALDI-TOF MS spettri vengono confrontati con il database di riferimento integrato di spettri. Un punteggio logaritmica viene assegnato per la fiducia del match tra l&#39;isolato di prova e il database di riferimento isolati, con la raccomandazione di un punteggio ≥ 1.7 richiesto per probabile identificazione a livello di generi (figura 1) e ≥ 2.0 per probabile l&#39;identificazione di specie (Figura 2). Relazione al livello di specie quando il punteggio ≥ 1.7 e le prime 5 id...

L&#39;applicazione di desorbimento laser assistita da matrice tempo / ionizzazione di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa (MS) direttamente emocoltura brodo velocizza l&#39;identificazione dei batteri. Il metodo proposto è un metodo rapido e affidabile per l&#39;identificazione dei batteri Gram negativi direttamente dalla cultura sangue brodo.

Rapida identificazione dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura Uso MALDI-TOF

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare direttamente gli organismi Gram-negativi da un brodo di coltura ematica utilizzando la tecnologia maloff. A tale scopo, cinque millilitri di un brodo di coltura ematica positivo vengono trasferiti in un tubo con separatore di siero e centrifugati. Dopo la centrifugazione, lo strato liquido contenente i batteri viene trasferito in un tubo da microcentrifuga e quindi centrifugato a bassa velocità. Il soprannatante viene poi trasferito in un nuovo tubo da microcentrifuga e centrifugato ad alta velocità.Il pellet risultante viene risospeso in acido formico e analizzato mediante MALDI per identificare le specie batteriche presenti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la coltura tradizionale, è l'identificazione precoce dei batteri Gram-negativi. Le implicazioni di questa tecnica riguardano la microbiologia clinica, poiché la diagnosi di batteriemia influenza la scelta dell'antimicrobico prescritto dal clinico.A dimostrare questa procedura sarà Leonardo Bascu, uno dei tecnici del nostro dipartimento che esegue regolarmente tale procedura. I flaconi per emocoltura aerobici o anaerobici, raccolti a discrezione del personale clinico, solitamente in caso di malattia febbrile, vengono incubati in apparecchi automatici che monitorano continuamente la crescita batterica. Quando vi è evidenza di crescita in un flacone per emocoltura, l'apparecchio segnalerà il flacone interessato.Iniziare questa procedura rimuovendo la bottiglia di emocoltura segnalata dall'incubatore. Posizionarla all'interno di una cappa biologica. Preparare un colorazione di Gram dal brodo di emocoltura segnalato seguendo i protocolli istituzionali locali ed esaminarla al microscopio se vengono identificati organismi Gram-negativi.Processare il brodo di coltura seguendo il metodo descritto qui. Se vengono identificati organismi Gram-positivi, può essere utilizzato un metodo molecolare rapido alternativo. Capovolgere il flacone per coltura ematica da due a tre volte per mescolare.Quindi, all'interno della cappa a sicurezza biologica, collegare una siringa da 10 millilitri a un dispositivo di trasferimento sicuro del sangue. Fissare il dispositivo di trasferimento del sangue alla bottiglia per emocoltura ed estrarre cinque millilitri del brodo nella siringa mediante trasferimento.Centrifugare il brodo della coltura ematica aspirato in un tubo con gel separatore del siero a 1.250 ×g per 15 minuti, per rimuovere i globuli rossi. Dopo la centrifugazione, la coltura ematica proveniente dai flaconi aerobi mostra una chiara separazione dei globuli rossi in fondo al tubo, con l'interfaccia gel-fluido che appare di colore bianco opaco. Al contrario, la coltura ematica proveniente dal flacone anaerobio litico presenta un colore rosso scuro all'interfaccia gel-fluido. Poiché i componenti delle cellule rosse lisate rimangono sospesi nel soprannatante per entrambi i tipi di aspirato, rimuovere il soprannatante utilizzando una pipetta sterile per trasferimento, avendo cura di lasciare circa un millilitro del buffy coat immediatamente al di sopra dell'interfaccia con il gel. Successivamente, utilizzando una pipetta sterile, mescolare delicatamente l'ultimo millilitro di fluido del buffy coat presente al di sopra dell'interfaccia del gel, quindi trasferire l'intero volume in una provetta per microcentrifuga. Centrifugare la nuova provetta a 288 ×g per 30 secondi utilizzando una pipetta monouso in plastica da un millilitro. Trasferire il sopernatante in un nuovo tubo da microcentrifuga e scartare il tubo contenente il pellet. È fondamentale, in questo passaggio, evitare di trasferire il pellet. Questo aspetto è particolarmente importante nei campioni ematici per colture anaerobiche, poiché il sopernatante rimane pigmentato e il pellet non è sempre visibile chiaramente.Centrifugare il campione a 18.407 ×g per un minuto, quindi, utilizzando una pipetta con punta fine, aspirare e scartare il soprannatante lasciando il minor quantitativo possibile di liquido residuo senza disturbare il pellet. Aggiungere un millilitro di acqua sterile priva di DNA e RNA ed eseguire alcune pipettature su e giù per risospendere il pellet residuo. Centrifugare nuovamente la soluzione risospesa a 18.407 ×g per un minuto.Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta con punta fine per aspirare e rimuovere il soprannatante. Ancora una volta, avendo cura di eliminare quanta più quantità possibile di liquido. Risospendere il pellet in 10 microlitri di acido formico al 70%.Per pellet di grandi dimensioni, potrebbe essere necessario aumentare il volume di acido formico del 50-100%. Utilizzare la pipetta per miscelare accuratamente, al fine di ottenere una soluzione omogenea; se necessario, usare la punta della pipetta per interrompere fisicamente il pellet. La soluzione risultante contiene batteri concentrati isolati dal brodo di coltura ematica, relativamente priva di cellule umane e di resine della bottiglia per coltura ematica. Utilizzando una pipetta, inoculare una piastra MALDI TOF pulita con due microlitri della sospensione preparata per ogni spot. Preparare tre posizioni sulla piastra per ogni campione per ovviare al problema occasionale di letture non riuscite.Posizionare la piastra sul bordo della cappa per ottimizzare il flusso d'aria al di sopra di essa, in modo che si asciughi rapidamente; quindi applicare un microlitro di soluzione della matrice su ciascun punto precedentemente essiccato. Lasciare asciugare la piastra per Maldi-ToF sul bordo della cappa. Come in precedenza, assicurarsi che ogni punto della piastra sia uniformemente ricoperto.Inserire la piastra bersaglio nello spettrometro di massa maloff. Assicurarsi che la piastra sia perfettamente allineata con le piastre a molla. Non inserire la piastra bersaglio finché tutti i punti bersaglio non sono completamente asciutti.Controllare la guarnizione di gomma per assicurarsi che sia priva di pelucchi, polvere e capelli. Questo permetterà di creare le condizioni di vuoto richieste. Successivamente, chiudere il coperchio dello stadio maloff e premere il pulsante in-out situato sul lato anteriore dello strumento.Il coperchio si bloccherà e verrà creato un vuoto. Aprire il software di controllo maldi typ e flex all'interno del software typ. Dal menu a discesa denominato file, selezionare nuova classificazione, assegnare un nome al progetto, quindi selezionare nuovo.Selezionare Avanti. Per completare la configurazione nella finestra del software di controllo flex, identificare la grafica sullo schermo della piastra bersaglio tenendo premuto il pulsante sinistro del mouse. Spostare il mouse sopra le colonie inoculate ed evidenziare le posizioni bersaglio in uso.Fare clic con il tasto destro del mouse in un punto qualsiasi delle posizioni target selezionate, quindi scegliere aggiungi analiti dal menu a discesa. Per ciascun punto target, aggiungere i dettagli di identificazione della coltura ematica nella colonna ID e fare clic su successivo. Al termine, selezionare il database spettrale di tassonomia commerciale e fare clic su successivo; i laboratori possono utilizzare ulteriori database interni o commerciali per aumentare il numero di spettri di riferimento, quindi fare clic su fine e il sistema MALDI TOF MS inizierà a generare gli spettri.Occasionalmente, punteggi MALDI-TOF più elevati possono essere ottenuti utilizzando l'acquisizione manuale degli spettri MALDI-TOF all'interno del software Flex Control. Una volta acquisiti gli spettri e completata l'analisi nel software di stereotipizzazione, selezionare il pulsante più accanto all'identificazione della specie. Per espandere l'elenco di identificazione per ogni bersaglio, esaminare le prime cinque identificazioni osservando se queste prime cinque siano simili tra loro.Se i primi cinque generi presentano risultati discordanti con punteggi maggiori o uguali a 1,7 per lo stesso punto bersaglio, potrebbe essere presente una miscela di specie. Si noti che la tecnologia OV ha una sensibilità ridotta nella rilevazione di specie miste. Quando viene osservato un punteggio maggiore o uguale a 2,0 per la corrispondenza più alta in un punto bersaglio, riportare la specie; quando il punteggio più alto in un punto bersaglio è maggiore o uguale a 1,7 ma inferiore a 2,0, riportare il gene.Solo se ulteriori criteri delle prime cinque identificazioni sono concordanti, riportare a livello di specie. Quando tutti gli spettri sono completi, premere il pulsante in-out sulla macchina MALDI, aprire il vano del piatto target ed estrarre il piatto. Se si utilizza un piatto target MALDI TOF riutilizzabile, usare l’alcol per pulire tutti i punti di mira e conservare il piatto MALDI a temperatura ambiente una volta che è pulito e asciutto per identificare batteri Gram-negativi da brodo di coltura ematica; sono stati impiegati cicli di centrifugazione e lavaggio per concentrare e isolare i batteri, che sono stati successivamente analizzati mediante spettrometria di massa MALDI TOF.Come descritto in questo articolo video, qui mostrato c'è lo spettro generato da MALDI TOF MS per eureka coli con un punteggio logaritmico di 1,86. A destra sono riportate le prime cinque corrispondenze identificate dal software di tipizzazione. Si noti che la specie viene costantemente indicata come re coli con un punteggio di 1,861.Poiché le prime cinque corrispondenze sono E. coli, l'identificazione è considerata affidabile a livello di specie. Qui è mostrato lo spettro generato da MALDI-TOF MS per Pseudomonas aeruginosa. Il punteggio logaritmico è 2,216; a destra sono riportate le prime cinque corrispondenze identificate dal software di tipizzazione.Si noti che la specie viene riportata costantemente come pseudomonas aerogen con un punteggio elevato pari a 2,216. L'identificazione è considerata affidabile a livello di specie. Gli spettri generati da MALDI a MS per un brodo di coltura ematica mista contenente esia coli e SIO marsens sono mostrati qui a destra; si tratta dei primi cinque abbinamenti ottenuti dal software di tipizzazione, il quale riporta sia Reiki coli che SIO marsan.Nelle prime cinque spettri corrispondenti. Questo gene misto viene identificato solo in circa un terzo delle colture miste in brodo. Questa tabella riassume i risultati precedentemente pubblicati dello studio di verifica di questo metodo, in cui il 91,8% dei brodi monomicrobici ha ottenuto un punteggio maldi inferiore a 1,7, con un accordo del 100% e del 97% rispettivamente per genere e specie.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come preparare un flacone di emocoltura positivo per l'identificazione mediante MALDI-TOF. Seguendo questo metodo, possiamo utilizzare lo stesso pellet preparato per l'identificazione batterica per ottenere un'inoculo più standardizzato per i test automatizzati di suscettibilità. Ad esempio, questa tecnica consente ai laboratori di fornire una diagnosi precoce ai clinici, con un potenziale impatto sulla gestione del paziente.Non dimenticare che lavorare con flaconi per emocoltura può essere pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, tra cui l'uso di una cappa a sicurezza biologica, durante la manipolazione dei flaconi per emocoltura.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Una rapida preparazione pellet batterico da una emocoltura positiva può essere utilizzato come campione per le applicazioni quali l'identificazione mediante MALDI-TOF, colorazione di Gram, test di sensibilità agli antibiotici e test di PCR-based. I risultati possono essere tempestivamente ai medici di migliorare la prognosi dei pazienti affetti da infezioni del sangue.

Preparazione di un Sangue cultura pellet per il Rapid batterica identificazione e test di sensibilità agli antibiotici

Questo lavoro descrive in dettaglio le procedure per l'identificazione rapida dei batteri utilizzando MALDI-TOF MS. Le procedure di identificazione includono l'acquisizione dello spettro, la costruzione di database e le analisi di follow-up. Vengono presentati due metodi di identificazione, quelli basati sul coefficiente di somiglianza e quelli basati sui biomarcatori.

L&#39;uso di MALDI-TOF spettrometria di massa e un database personalizzato per caratterizzare batteri indigeni ad un unico ambiente di Cave (Kartchner Caverns, AZ, USA)

La spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF MS) e le tecniche molecolari (sequenziamento genico dell'rRNA 16S) consentono l'identificazione di patogeni batterici rari nella diagnostica di routine. L'obiettivo di questo protocollo risiede nella combinazione di entrambe le tecniche che porta a dati più accurati e affidabili.

Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

Massa phyloproteomics spettrometria-based (MSPP) è stato utilizzato per digitare una collezione di Campylobacter jejuni ssp. Doylei isolati a livello di sforzo rispetto a tipizzazione sequenza multilocus (MLST).

sottotipizzazione di<em&gt; Jejuni Campylobacter</em&gt; Ssp.<em&gt; doylei</em&gt; Isolati Utilizzando PhyloProteomics Spettrometria di Massa-based (MSPP)

IDBac è una pipeline di bioinformatica a base di spettrometria di massa open source che integra dati provenienti da proteine intatte e spettri di metaboliti specializzati, raccolti su materiale cellulare raschiato da colonie batteriche. La conduttura consente ai ricercatori di organizzare rapidamente centinaia di migliaia di colonie batteriche in gruppi tassonomici putativi e di differenziarle ulteriormente in base alla produzione specializzata di metaboliti.

Utilizzo della pipeline OPEN-Source MALDI TOF-MS IDBac per l'analisi dei dati sulle proteine microbiche e sui metaboliti specializzati

Qui presentiamo un protocollo per la rapida identificazione di proteine prodotte da batteri patogeni sequenziati genomicamente utilizzando la spettrometria di massa tandem MALDI-TOF-TOF e l'analisi proteomica top-down con software sviluppato internamente. Gli ioni proteici metastabili si frammentano a causa dell'effetto dell'acido aspartico e questa specificità viene sfruttata per l'identificazione delle proteine.

Identificazione di proteine immunitarie antibatteriche in Escherichia coli utilizzando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e analisi proteomica top-down

Viene dimostrato un nuovo metodo di preparazione del campione per l'analisi di macrocolonie batteriche a base di agar mediante spettrometria di massa con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice.

Studio della cooperazione microbica mediante spettrometria di massa per immagini Analisi di colonie batteriche cresciute su agar e nei tessuti durante l'infezione

EUCAST ha sviluppato un protocollo di test di suscettibilità antimicrobica (AST) diretto per le emocolture automatizzate. Tuttavia, la sua dipendenza dall'identificazione microbica basata sulla spettrometria di massa può essere ovviata utilizzando un protocollo di preparazione diretta dell'inoculo in un sistema automatizzato di identificazione microbica. Questo approccio può fornire rapporti AST entro 24 ore dalla raccolta del campione.

Identificazione microbica diretta utilizzando un sistema automatizzato di identificazione microbica per facilitare il metodo RAST EUCAST senza spettrometria di massa

Questo protocollo consente una valutazione rapida ed economica della composizione microbica nei prodotti lattiero-caseari combinando la culturromica con MALDI-TOF MS. Fornisce risultati di tassonomia paragonabili al sequenziamento dell'rRNA 16S con un tempo di risposta più breve rispetto ai metodi di coltura tradizionali.

Valutazione della Sicurezza Microbica dei Caseifici mediante Profilazione Proteomica Batterica tramite Approccio MALDI

Un protocollo rapido per l'identificazione diretta di Enterococcus faecalis ed Enterococcus altre specie da una emocoltura positiva con un Peptide Nucleic Acid test di ibridizzazione fluorescente in situ (FISH PNA).

Una procedura 1,5 ore per l&#39;identificazione di Enterococcus Specie Direttamente da emocolture

Scopri l'identificazione rapida dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura usando MALDI-TOF MS. Questo metodo accelera la diagnosi di batteriemie e supporta decisioni terapeutiche tempestive in microbiologia clinica.

Rapida identificazione dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura Uso MALDI-TOF

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