Name: Imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato Cardiomyocytes seguito Adenoviral e lentivirali trasduzione Uso confocale Spinning Disk Microscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Impara l'imaging cellulare dal vivo di cardiomiociti neonatali di ratto primari dopo trasduzione lentivirale e adenovirale usando microscopia confocale a disco rotante. Questo metodo consente l'osservazione in tempo reale delle dinamiche cellulari cardiache.

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Vorremmo ringraziare il Dr. Alengo Nyamay'antu e la Dr. Ilse Timmerman per i loro consigli sul confezionamento dei lentivirali. Questo lavoro è supportato da una sovvenzione per lo sviluppo degli scienziati dell'American Heart Association 10SDG4170137.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Cardiomiociti primari isolati da ratti neonati sono stati a lungo utilizzati per studiare le funzioni dei cardiomiociti in vitro. Questo protocollo descrive un metodo per l&#39;isolamento di cardiomiociti neonatali di cuccioli di ratto utilizzando un metodo di digestione enzimatica in due fasi, prima digestione con tripsina O / N a 4 ° C e poi collagenasi purificata. Un vantaggio di impiegare il passo collagenasi purificata è che lo stesso grado di enzima viene utilizzato per tutte isolamenti. Pertanto, la qual...

Ratto cardiomiociti neonatali primari sono stati a lungo utilizzati per indagare la funzione dei cardiomiociti in vitro 1. Sono facili da isolare da cuccioli di ratto da diversi metodi ben consolidati 2-4. Il metodo più comune impiega collagenasi o tripsina per digerire tessuto connettivo del cuore prima isolamento cellulare. I ricercatori hanno anche sviluppato metodi per isolare cardiomiociti da roditori adulti 5-8 così come topi neonati 9,10. Questo protocollo descrive un metodo per isolare cardiomiociti da cuccioli di ratto neonatale, impiegando una procedura in due fasi digestione enzimatica. Tripsina prima utilizzazione O / N a 4 ° C, e poi collagenasi purificata a 37 ° C. L&#39;incubazione del tessuto cardiaco con tripsina O / N a 4 ° C riduce i passi necessari per cellule raccolto rispetto ai metodi mediante incubazioni sequenziali in soluzione enzimatica caldo 2. Inoltre, utilizzando co purificatallagenase piuttosto che gli enzimi greggio, la variabilità da lotto a lotto può essere eliminato, fornendo così una maggiore riproducibilità. Studi funzionali di una particolare proteina spesso utilizzano un sistema di espressione della proteina utilizzando un adenovirus 11-13 e / o un lentivirus 14-16. [Nota cautelativa] La produzione virale e la manipolazione devono essere eseguite secondo le linee guida NIH. L&#39;adenovirus non si integra nel genoma dell&#39;ospite. Ha una altissima efficienza di trasduzione nella maggior parte dei tipi cellulari, tra cui cellule in divisione e le cellule che non si dividono, così come le cellule primarie e linee cellulari stabilizzate. Questo rende l&#39;adenovirus un vettore affidabile per l&#39;espressione genica. Alti livelli della proteina codificata dal vettore adenovirus sviluppano in 48 hr seguente trasduzione, e possono durare per diverse settimane 17. Tuttavia, uno svantaggio di utilizzare un adenovirus per l&#39;espressione proteica è che lo sviluppo di un ade ricombinantenovirus è sia complicato e richiede tempo. Questo inconveniente spiega in parte perché molti ricercatori sono state girando a lentivirus per l&#39;espressione del gene ricombinante. A differenza dei costrutti adenovirali, generando un costrutto lentivirale è semplice e veloce. Sebbene lentivirus hanno generalmente inferiori efficienze di trasduzione di adenovirus, in entrambe le cellule in divisione e non si dividono, esse integrarsi nel genoma dell&#39;ospite. Di conseguenza, l&#39;espressione del gene trasdotto è più stabile per lentivirus che per adenovirus. Grazie ai progressi tecnologici nel campo della microscopia, è molto più facile per catturare immagini di cellule in vivo di cellule esprimenti proteine ​​ricombinanti. Questo vale anche a velocità di tasso di video di acquisizione. Questo permette al ricercatore di determinare come particolari alterazioni nella proteina di interesse impatto funzionalmente cella in tempo reale. Il microscopio confocale disco rotante ha diverse caratteristiche chiave che rendono una tecnica ottimale per livl&#39;imaging cellulare e 18,19. Il disco rotante Yokogawa consente molto più rapida acquisizione delle immagini, mentre allo stesso tempo utilizzano energia laser molto meno di scansione punto microscopi confocali. Entrambe queste particolarità sono dovute al disco rotante, che contiene numerosi fori confocali attraverso cui il laser passa contemporaneamente ai campioni. Durante l&#39;acquisizione, il disco stesso gira velocemente e 18-20. Utilizzando il sistema autofocus del microscopio, messa a fuoco stabile viene mantenuta per lunghi periodi di tempo. Questo permette ai ricercatori di scattare immagini di cellule vive ben focalizzati. Immagini acquisite vengono riprodotti come file di filmato. Le immagini sono analizzate utilizzando il software di analisi delle immagini, come ImageJ 21,22, FIJI 23, o altri software disponibili in commercio.

<table><tbody><tr><td>1 Forbici per la decapitazione</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>Autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>1 Forbici fini per l'isolamento del cuore e il taglio</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>Autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>2 Pinze fini (Dumont n. 5)</td><td>Autoclave Sigma</td><td>F6521</td><td>prima dell'uso</td></tr><tr><td>3 Piatti di plastica sterilizzati da 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Per isolamento cardiaco</td></tr><tr><td>3,5 cm Fondo in vetro piastre di coltura</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Per la placcatura finale dei cardiomiociti per il futuro imaging di cellule vive. Le micro-piastre di ibidi sono un'alternativa accettabile.</td></tr><tr><td>Piastre di coltura con fondo in vetro da 3,5 cm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0,17-14-C</td><td>Per TIRF o immagine ad alta risoluzione</td></tr><tr><td>Soluzione di etanolo, 70% (v/v) in acqua</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>2% Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>1 Piatto di plastica sterilizzato da 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Per tripsinizzazione</td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Due piastre per colture cellulari in plastica da 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Per la selezione</td></tr><tr><td>Autopipetta</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-300</td><td>Per la triturazione</td></tr><tr><td>Contatore</td><td></td><td></td><td></td>cellulare</tr><tr><td>Cellometro, contatore cellulare automatizzato</td><td>nexcelom</td><td></td><td>Per controllare e contare le cellule</td></tr><tr><td>Microscopio ed ematocitometro</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Per controllare e contare le cellule</td></tr><tr><td>Soluzione di tripano blu, 0,4%</td> <td>invitrogeno</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubatore</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale di incubazione</td><td>Sigma</td><td>Z673129</td><td>Per agitare il tessuto cardiaco con collagenasi a 37 gradi; C a 170-200 giri/min</td></tr><tr><td>10 mg/ml soluzione di BrdU</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, invitrogeno ad alto contenuto di glucosio</td><td></td><td>41965039</td><td>Miscelare il terreno come indicato nel protocollo e riscaldare prima dell'uso</td></tr><tr><td>MEM</td><td>invitrogen</td><td>31095029</td><td>Miscelare il terreno come indicato nel protocollo e riscaldare prima dell'uso</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>invitrogeno</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (10.000 U/ml)&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sezione 2 Trasduzione</td><td></td><td></td><td></td>lentivirale</tr><tr><td>3 Impacchettamento plasmidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Il vettore di trasferimento lentivirale, pLVX-IRES-Puro</td><td>Clontech</td><td>632183</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (terreno senza siero)</td><td>invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Reagente</td><td></td><td></td><td></td>di trasfezione</tr><tr><td>polietilenimmina" Max", (MW 40.000) - PEI lineare ad alta potenza (equivalente a Mw 25.000 in forma base libera)&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>24765-2</td><td>Può essere sostituito con X-tremeGENE 9 di Roche</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td>sostituto del PEI come reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>Clorochina</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td>Sciogliere in acqua e fare 100 mM di soluzione madre. L'inibizione dell'acidificazione endosomiale può essere ottenuta con 10-100 &mu; M Clorochina.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Luer-Lok da 10 ml, sterilizzata</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m filters</td><td>Sigma</td><td>F8677</td><td>Utilizzare solo filtri in acetato di cellulosa o polietersulfone (PES) (a basso legame proteico). Non utilizzare filtri alla nitrocellulosa. La nitrocellulosa lega le proteine di superficie sull'involucro lentivirale e distrugge il virus.</td></tr><tr><td>Bromuro di esadimetrina</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>Sciogliere in acqua e fare 8 mg/ml di soluzione madre, quindi filtrarla per sterilizzare.</td></tr><tr><td>Polietilenglicole 6.000</td><td>Sigma</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sezione 3 Trasduzione</td><td></td><td></td><td></td>adenovirale</tr><tr><td>Cellule HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Alcune piastre per colture cellulari da 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra a 96 pozzetti con coperchio, fondo piatto, coltura tissutale, sterile</td><td>BD Falcon</td><td>353072</td><td>Per titolazione</td></tr><tr><td>Pipetta multicanale, 10-100 &; l, 8 canali</td><td>eppendorf</td><td>3122 000.035</td><td></td></tr><tr><td>Sezione 4 Imaging</td><td></td><td></td><td></td>di cellule vive</tr><tr><td>Microspopy confocale a disco rotante</td><td>PerkinElmer</td><td>L7267000</td><td></td></tr><tr><td>Una camera a temperatura controllata</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Per mantenere la temperatura a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>A Sistema ambientale CO2</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Opzionale per mantenere la concentrazione ottimale di CO<2 per mantenere la concentrazione ottimale</td></tr> di <tr><td>COsub>2 Mezzo indipendente, senza glutammina</td><td>invitrogen</td><td>18045-054&nbsp; &nbsp;</td><td>Per l'imaging time-lapse a lungo termine</td></tr><tr><td>DMEM, glicemia alta, HEPES, senza rosso fenolo</td><td>invitrogen</td><td>21063-029</td><td>Per l'imaging time-lapse a lungo termine</td></tr></tbody></table>

imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato cardiomyocytes seguito adenoviral e lentivirali trasduzione uso confocale spinning disk microscopia

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primario cardiomiociti neonatali di ratto sono utili in base nella ricerca cardiovascolare vitro perché possono essere facilmente isolati in gran numero in una singola procedura. Grazie ai progressi nella tecnologia del microscopio è relativamente facile per catturare immagini di cellule in vivo allo scopo di indagare eventi cellulari in tempo reale con una minima preoccupazione per quanto riguarda fototossicità alle cellule. Questo protocollo descrive come prendere le immagini timelapse cellule vive di ratto primaria cardiomiociti neonatali utilizzando un microscopio confocale disco rotante che segue la trasduzione lentivirale e adenoviral di modulare le proprietà della cella. L&#39;applicazione di due diversi tipi di virus rende più facile per raggiungere un adeguato livello dei tassi di trasduzione e di espressione di due geni diversi. Immagini di cellule vive bene focalizzate possono essere ottenuti utilizzando il sistema autofocus del microscopio, che mantiene a fuoco stabile per lunghi periodi di tempo. Applicando questo metodo, le funzioni di ingegnere esogenamenteproteine ​​di ed espressi in cellule primarie in coltura possono essere analizzati. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per esaminare la funzione dei geni attraverso l&#39;uso di siRNA nonché di modulatori chimici.

Per illustrare la tecnica, un EGFP lentivirus codifica (proteina fluorescente verde)-tag Cx43 (Connexin43) o un Cx43 mutato 32 è stato usato per esprimere le proteine ​​EGFP-tag nelle cellule, e una codifica adenovirus FGFR1DN (recettore del fattore di crescita dei fibroblasti 1 negativo dominante ) è stato utilizzato per arrestare la segnalazione FGF nella cella 33-35. Tre giorni dopo l&#39;isolamento di cardiomiociti, i cardiomiociti isolati state trasdotte con lentivirus per esprimere proteine ​...

Questo protocollo descrive un metodo di imaging di cellule vive utilizzando cardiomiociti neonatali primari di ratto dopo trasduzione lentivirale e adenovirale utilizzando la microscopia confocale a disco rotante. Ciò consente osservazioni dettagliate dei processi cellulari nei cardiomiociti viventi.

Imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato Cardiomyocytes seguito Adenoviral e lentivirali trasduzione Uso confocale Spinning Disk Microscopia

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere immagini in time-lapse di cardiomiociti primari da ratto neonati dopo la trasduzione con lentivirus e adenovirus, utilizzando una microscopia confocale a disco rotante. Questo viene realizzato innanzitutto isolando i cardiomiociti da cuccioli di ratto e seminando le cellule in piatti con fondo in vetro. Il passaggio successivo consiste nell'eseguire la trasduzione della Conexina 43 marcata con EGFP mediante lentivirus, seguita dalla trasduzione del recettore tirosina chinasi fibroblastico dominante negativo (fgfr) mediante adenovirus nei cardiomiociti.L'ultimo passaggio consiste nell'acquisire immagini in time-lapse mediante microscopia confocale a disco rotante. In definitiva, è possibile ottenere un filmato riprodotto a partire dalle immagini in time-lapse acquisite. Tale filmato mostra la distribuzione della proteina marcata con EGFP espressa da geni lentivirali in cardiomiociti primari vivi in condizioni cellulari alterate da una proteina espressa da adenovirus, dominante negativa per fgfr1.Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che consente di eseguire l'acquisizione temporale di cellule vive mediante un microscopio confocale a disco rotante in condizioni desiderate, seguendo l'espressione genica indotta da adenovirus o da successiva transfezione. Pertanto, questo metodo può fornire informazioni dettagliate sui cardiomiociti neonatali. Può inoltre essere applicato ad altri sistemi, come cardiomiociti primari di topo, cardiomiociti neonatali, cardiomiociti primari del ventricolo destro di topo, cardiomiociti adulti e altre cellule in coltura.Generalmente, le persone alle prime armi con la microscopia hanno difficoltà a ottenere immagini ben messe a fuoco a causa di un lieve spostamento del piano dello stage nel tempo. Utilizzando la funzione di messa a fuoco automatica della macchina, è possibile mantenere una messa a fuoco stabile, consentendo ai ricercatori di acquisire immagini ben focalizzate con maggiore facilità. I cardiomiociti neonatali utilizzati in questa procedura sono isolati da cuccioli di ratto di età compresa tra uno e due giorni.Rimuovere il cuore battente il più rapidamente possibile dall'animale eutanasizzato utilizzando strumenti sterilizzati e collocare il cuore in 30 millilitri di ghiaccio. Soluzione C-M-F-H-B-S-S raffreddata a ghiaccio in un tubo conico da 50 millilitri. Tipicamente, un totale di 10 cuori viene raccolto in due tubi conici da 50 millilitri, ciascuno contenente cinque cuori in 30 millilitri di soluzione C-M-F-H-B-S-S raffreddata a ghiaccio; ai fini della ripresa video, vengono raccolti due o tre cuori.Ruotare delicatamente il tubo per risciacquare i cuori. Tutte le procedure devono essere eseguite su ghiaccio e in una cappa a flusso laminare. Da questo punto in poi, eliminare il soprannatante e trasferire i cuori in una nuova piastra di plastica sterilizzata da 10 centimetri posta su ghiaccio.Attenzione a non aspirare i cuori con l'aspiratore. Rimuovere i vasi di grandi dimensioni e i tessuti non desiderati dai cuori. Aggiungere 10 millilitri di C-M-F-H-B-S-S freddo ghiacciato alla piastra per risciacquare i cuori.Successivamente, trasferire tutti i cuori in una nuova piastra di plastica sterilizzata da 10 centimetri posta sul ghiaccio. Tritare i cuori con le forbici in pezzi di dimensioni inferiori a un millimetro cubo. Aggiungere nove millilitri di C-M-F-H-B-S-S freddo ai cuori tritati.Aggiungere un millilitro di tripsina fredda. Ricostruita con C-M-F-H-B-S-S. Sigillare la piastra con paraform.Coprire con pellicola di alluminio e collocare in una stanza fredda per tutta la notte; il giorno seguente, trasferire tutti i tessuti cardiaci con tampone in un tubo conico da 50 millilitri su ghiaccio. Aggiungere un millilitro di inibitore della tripsina nel C-M-F-H-B-S-S. Chiudere ermeticamente il tubo conico da 50 millilitri per evitare contaminazioni.Incubare il tubo per circa 30 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius per riscaldare il tessuto e il tampone a una temperatura compresa tra 30 e 37 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di collaghenasi in Liebovitz L 15 e incubare a 37 gradi Celsius per 45 minuti con agitazione delicata. Dopo 45 minuti, tritare i tessuti utilizzando una pipetta automatica, pipettando 20 volte a una velocità di tre millilitri al secondo.Lasciare sedimentare i residui di tessuto per tre minuti, quindi filtrare il sopranatante attraverso un filtro cellulare da 70 micron. Aggiungere cinque millilitri di Leibovitz L 15 agli aggregati di tessuto rimanenti, agitare e filtrare nuovamente il sopranatante. Lavare il filtro cellulare con due millilitri di Leibovitz L 15.Posizionare la soluzione cellulare filtrata in una cappa per 20-60 minuti, in modo da permettere alla collagenasi di digerire il sedimento di collagene parzialmente degradato. Centrifugare le cellule a 100 ×g per cinque minuti. Risospendere le cellule in 20 millilitri di DMEM contenente 10% di siero fetale bovino e 20 unità per millilitro.Incubare le cellule su due piatti di coltura cellulare in plastica da 10 centimetri in presenza di penicillina e streptomicina per un'ora a 37 gradi Celsius in un incubatore a CO2 per la selezione dei cardiomiociti; i fibroblasti si attaccheranno più facilmente sul fondo del piatto rispetto ai cardiomiociti. Dopo un'ora, agitare delicatamente i piatti e raccogliere il soprannatante contenente i cardiomiociti dai piatti. Sedimentare le cellule a 100 × g per cinque minuti. Risospendere le cellule in DMEM contenente 10% di FBS, 10 unità per millilitro di penicillina e streptomicina e 0,1 millimolare di bromodesossiuridina; piastrare le cellule a 2 × 10⁵ cellule per piatto in piatti da 3,5 centimetri con fondo in vetro rivestiti di gelatina per l'osservazione al microscopio, quindi incubare nell'incubatore a CO2 a 37 gradi Celsius.Non disturbare le cellule dopo il seeding per almeno 24 ore prima della trasduzione lentivirale dei cardiomiociti. I plasmidi lentivirali vengono impacchettati e la soluzione lentivirale viene raccolta seguendo le procedure descritte nel manoscritto allegato. Per iniziare la procedura di trasduzione lentivirale, rimuovere il mezzo da una piastra da 3,5 centimetri con fondo in vetro contenente cardiomiociti neonatali di ratto e aggiungere un millilitro di soluzione lentivirale filtrata.Incubare la piastra in un incubatore a CO₂ a 37 gradi Celsius per sei ore. Dopo sei ore, sostituire il mezzo con nuovo DMEM, con MEM contenente 5% di FBS e penicillina-streptomicina, e incubare in un incubatore a CO₂ a 37 gradi Celsius per tre giorni.L'integrazione del gene esogeno nel genoma dell'ospite mediante lentivirus si considera completa entro 72 ore prima della trasduzione adenovirale. La soluzione madre adenovirale deve essere titolata come descritto nel manoscritto allegato. Recuperare la piastra da 3,5 centimetri con fondo in vetro contenente i cardiomiociti neonatali di ratto sottoposti a trasduzione lentivirale.Sostituire il mezzo con 750 microlitri di soluzione di adenovirus diluita. La riduzione del volume del mezzo durante la trasduzione a circa il 50% del volume originale è fondamentale per ottenere un'elevata efficienza di trasduzione. Incubare nell'incubatore a CO2 a 37 gradi Celsius per quattro a otto ore.Successivamente, sostituire il mezzo con mezzo fresco e incubare per 24-48 ore prima di utilizzare le cellule per esperimenti di imaging su cellule vive. L'acquisizione delle immagini, mediante un microscopio confocale a disco rotante dotato di camera controllata in temperatura e sistema ambientale per la CO2, verrà dimostrata almeno un'ora prima dell'imaging. Accendere il sistema di controllo della temperatura in modo che tutti i dispositivi raggiungano l'equilibrio a 37 gradi Celsius.Accendere il sistema del microscopio confocale a disco rotante. Posizionare la piastra da 3,5 centimetri con fondo in vetro contenente cardiomiociti neonatali di ratto sul portacampioni del microscopio confocale a disco rotante all'interno di una camera controllata in temperatura. Accendere l'otturatore della sorgente luminosa fluorescente e individuare al microscopio attraverso l'oculare le cellule che esprimono proteine fluorescenti.Spegnere l'otturatore della sorgente luminosa fluorescente. Modificare il percorso della luce per passare al microscopio confocale a disco rotante. Regolare opportunamente le impostazioni per l'acquisizione utilizzando il software di funzionamento, controllando le immagini visualizzate sullo schermo e impostando i parametri per l'acquisizione dell'immagine fluorescente.Ad esempio, selezionare la modifica dei canali utilizzando i percorsi della luce e il canale uno EGFP per acquisire il segnale fluorescente da EGFP per il canale uno. Impostare la frequenza tra i punti temporali configurando le impostazioni dell'intervallo temporale al fine di acquisire immagini in intervallo temporale utilizzando il software di funzionamento. Ad esempio, per acquisire un punto temporale ogni cinque minuti, selezionare minuti per punto temporale dal menu a tendina e inserire cinque nel campo di testo.Avviare l'acquisizione in time lapse facendo clic sul pulsante di avvio per acquisire una sequenza di immagini. Al termine dell'acquisizione, le immagini possono essere riprodotte come file video e analizzate. Utilizzando il software di analisi, selezionare le immagini acquisite da includere in un filmato, se necessario.Ritaglia le aree di interesse dalle immagini e seleziona i punti temporali più significativi per ridurre le dimensioni del file del filmato; esporta le immagini come file video in formato VI o MOV. Scegli un formato video tra quelli disponibili e imposta la temporizzazione richiesta per il filmato finale. Quindi fai clic su esporta.In questo esperimento rappresentativo, i cardiomiociti neonatali di ratto sono stati trasdotti con un lentivirus codificante la CONNESINA 43 marcata con EGFP o una CONNESINA 43 mutata, e con un adenovirus codificante un recettore del fattore di crescita dei fibroblasti dominante negativo FGFR1 dn. L'espressione delle proteine marcate con EGFP è stata confermata mediante microscopia confocale a disco rotante, mentre l'espressione del recettore del fattore di crescita dei fibroblasti dominante negativo è stata verificata mediante immunoistochimica e western blot. Sono state acquisite immagini in time-lapse dei cardiomiociti e riprodotte sotto forma di filmato. In questo esempio, le immagini si sono spostate nel piano XY, probabilmente a causa di un'equilibratura termica non adeguata o di un malfunzionamento della modalità di acquisizione multipla.Queste immagini provengono da acquisizioni in time-lapse di cardiomiociti che esprimono la Connexina 43 mutata e FGFR1 dn. In questo caso, l'equilibrazione della temperatura è stata adeguata e è stata acquisita una sola regione di interesse, ottenendo immagini prive di movimento nel piano XY. Il battito dei cardiomiociti è stato valutato dopo l'acquisizione per confermare la vitalità cellulare.Questo filmato mostra che dopo 16 ore di acquisizione temporale, i cardiomiociti esprimenti EGFP hanno mantenuto le loro proprietà funzionali e battono in modo ritmico. Con questa tecnica, è possibile eseguire l'acquisizione in tempo reale di cardiomiociti primari. Si ricorda che lavorare con adenovirus e lentivirus può essere pericoloso e che precauzioni, come il controllo della contaminazione, devono essere sempre adottate quando si manipolano questi virus.

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Imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato Cardiomyocytes seguito Adenoviral e lentivirali trasduzione Uso confocale Spinning Disk Microscopia (Video) | JoVE Journal

Imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato Cardiomyocytes seguito Adenoviral e lentivirali trasduzione Uso confocale Spinning Disk Microscopia

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