Name: Imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato Cardiomyocytes seguito Adenoviral e lentivirali trasduzione Uso confocale Spinning Disk Microscopia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Impara l'imaging cellulare dal vivo di cardiomiociti neonatali di ratto primari dopo trasduzione lentivirale e adenovirale usando microscopia confocale a disco rotante. Questo metodo consente l'osservazione in tempo reale delle dinamiche cellulari cardiache.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Vorremmo ringraziare il Dr. Alengo Nyamay'antu e la Dr. Ilse Timmerman per i loro consigli sul confezionamento dei lentivirali. Questo lavoro è supportato da una sovvenzione per lo sviluppo degli scienziati dell'American Heart Association 10SDG4170137.

<ol><li>Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+the+preparation+of+homogeneous+cultures+of+isolated+heart+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells.</a> Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).</li>
<li>Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+allylamine+and+acrolein+in+cultured+myocytes+and+fibroblasts+from+neonatal+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart.</a> Toxicology. 56, 107-117 (1989).</li>
<li>MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+plasminogen+activator+activity+from+neonatal+rat+heart+cells+is+regulated+by+hormones+and+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).</li>
<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+genetic+manipulation+of+adult+cardiac+myocytes+for+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging.</a> J Vis Exp. 31 (31), (2009).</li>
<li>Xu, X., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+adult+rat+heart+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of adult rat heart myocytes.</a> J Vis Exp. 28 (28), (2009).</li>
<li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).</li>
<li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.+In+vitro+cellular+%26+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology.</a> Animal. 44, 45-50 (2008).</li>
<li>Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Neonatal+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. 79 (79), (2013).</li>
<li>Kass-Eisler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+adenovirus-mediated+gene+delivery+to+rat+cardiac+myocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).</li>
<li>Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+heart+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">The evolution of heart gene delivery vectors.</a> The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).</li>
<li>Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMetzger%2C+JM+%22Cardiac+Cell+and+Gene+Transfer%3A+Principles%2C+Protocols%2C+and+Applications%22">Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. (2003).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+for+delivery+of+genes+into+neonatal+and+adult+ventricular+cardiac+myocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+research+in+cardiology%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo.</a> Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).</li>
<li>Bonci, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced%27+generation+lentiviruses+as+efficient+vectors+for+cardiomyocyte+gene+transduction+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo.</a> Gene therapy. 10, 630-636 (2003).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FGF+system+has+a+key+role+in+regulating+vascular+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The FGF system has a key role in regulating vascular integrity.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).</li>
<li>Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy+--+a+cutting-edge+tool+for+imaging+of+membrane+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+structure+and+function%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic.</a> Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).</li>
<li>Adams, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-speed+multispectral+spinning-disk+confocal+microscope+system+for+fluorescent+speckle+microscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%22%5BJournal%5D)">A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells.</a> Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).</li>
<li>Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+microscopy+systems.+Cold+Spring+Harbor+protocols%29%5BTitle%5D)+AND+%222010%2C+pdb+top88%2C+doi%3A10.1101%2Fpdb.top88%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols).</a> 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. 32 (32), (2009).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).</li>
<li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+and+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).</li>
<li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic acids research. 30, (2002).</li>
<li>Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+role+of+chloroquine+in+gene+transfer+into+a+human+hepatoma+cell+line+by+DNA%2Flactosylated+polylysine+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes.</a> Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).</li>
<li>McSharry, J., Benzinger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+purification+of+vesicular+stomatitis+virus+by+polyethylene+glycol+%27precipitation%27%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'.</a> Virology. 40, 745-746 (1970).</li>
<li>Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monte+Carlo+simulation+of+the+Spearman-Kaerber+TCID50%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical%22%5BJournal%5D)">Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50.</a> Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).</li>
<li>Kaerber, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaerber%2C+G+%22Beitrag+zur+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+Reihenversuche.+In%3A+Beitrag+zur+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+Reihenversuche.+162%22">Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162</a>. , Springer. Berlin, 480–483. (1931).</li>
<li>Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+FGF+signaling+is+required+for+Cx43+phosphorylation+and+cardiac+gap+junction+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance.</a> Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).</li>
<li>Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+form+of+fibroblast+growth+factor+receptor+1+inhibits+signal+transduction+by+multiple+types+of+fibroblast+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor.</a> The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).</li>
<li>Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transformation+by+fibroblast+growth+factors+can+be+suppressed+by+truncated+fibroblast+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors.</a> Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-dependent+regulation+of+VEGF+receptor+2+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice.</a> The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).</li>
<li>Bazan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+assessment+in+enzymatically+isolated+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+reviews%22%5BJournal%5D)">Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes.</a> Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).</li>
<li>Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+adult+cardiac+myocytes+maintain+protein+synthetic+capacity+of+intact+adult+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts.</a> The American journal of physiology. , 264-573 (1993).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Cardiomiociti primari isolati da ratti neonati sono stati a lungo utilizzati per studiare le funzioni dei cardiomiociti in vitro. Questo protocollo descrive un metodo per l&#39;isolamento di cardiomiociti neonatali di cuccioli di ratto utilizzando un metodo di digestione enzimatica in due fasi, prima digestione con tripsina O / N a 4 ° C e poi collagenasi purificata. Un vantaggio di impiegare il passo collagenasi purificata è che lo stesso grado di enzima viene utilizzato per tutte isolamenti. Pertanto, la qual...

Ratto cardiomiociti neonatali primari sono stati a lungo utilizzati per indagare la funzione dei cardiomiociti in vitro 1. Sono facili da isolare da cuccioli di ratto da diversi metodi ben consolidati 2-4. Il metodo più comune impiega collagenasi o tripsina per digerire tessuto connettivo del cuore prima isolamento cellulare. I ricercatori hanno anche sviluppato metodi per isolare cardiomiociti da roditori adulti 5-8 così come topi neonati 9,10. Questo protocollo descrive un metodo per isolare cardiomiociti da cuccioli di ratto neonatale, impiegando una procedura in due fasi digestione enzimatica. Tripsina prima utilizzazione O / N a 4 ° C, e poi collagenasi purificata a 37 ° C. L&#39;incubazione del tessuto cardiaco con tripsina O / N a 4 ° C riduce i passi necessari per cellule raccolto rispetto ai metodi mediante incubazioni sequenziali in soluzione enzimatica caldo 2. Inoltre, utilizzando co purificatallagenase piuttosto che gli enzimi greggio, la variabilità da lotto a lotto può essere eliminato, fornendo così una maggiore riproducibilità. Studi funzionali di una particolare proteina spesso utilizzano un sistema di espressione della proteina utilizzando un adenovirus 11-13 e / o un lentivirus 14-16. [Nota cautelativa] La produzione virale e la manipolazione devono essere eseguite secondo le linee guida NIH. L&#39;adenovirus non si integra nel genoma dell&#39;ospite. Ha una altissima efficienza di trasduzione nella maggior parte dei tipi cellulari, tra cui cellule in divisione e le cellule che non si dividono, così come le cellule primarie e linee cellulari stabilizzate. Questo rende l&#39;adenovirus un vettore affidabile per l&#39;espressione genica. Alti livelli della proteina codificata dal vettore adenovirus sviluppano in 48 hr seguente trasduzione, e possono durare per diverse settimane 17. Tuttavia, uno svantaggio di utilizzare un adenovirus per l&#39;espressione proteica è che lo sviluppo di un ade ricombinantenovirus è sia complicato e richiede tempo. Questo inconveniente spiega in parte perché molti ricercatori sono state girando a lentivirus per l&#39;espressione del gene ricombinante. A differenza dei costrutti adenovirali, generando un costrutto lentivirale è semplice e veloce. Sebbene lentivirus hanno generalmente inferiori efficienze di trasduzione di adenovirus, in entrambe le cellule in divisione e non si dividono, esse integrarsi nel genoma dell&#39;ospite. Di conseguenza, l&#39;espressione del gene trasdotto è più stabile per lentivirus che per adenovirus. Grazie ai progressi tecnologici nel campo della microscopia, è molto più facile per catturare immagini di cellule in vivo di cellule esprimenti proteine ​​ricombinanti. Questo vale anche a velocità di tasso di video di acquisizione. Questo permette al ricercatore di determinare come particolari alterazioni nella proteina di interesse impatto funzionalmente cella in tempo reale. Il microscopio confocale disco rotante ha diverse caratteristiche chiave che rendono una tecnica ottimale per livl&#39;imaging cellulare e 18,19. Il disco rotante Yokogawa consente molto più rapida acquisizione delle immagini, mentre allo stesso tempo utilizzano energia laser molto meno di scansione punto microscopi confocali. Entrambe queste particolarità sono dovute al disco rotante, che contiene numerosi fori confocali attraverso cui il laser passa contemporaneamente ai campioni. Durante l&#39;acquisizione, il disco stesso gira velocemente e 18-20. Utilizzando il sistema autofocus del microscopio, messa a fuoco stabile viene mantenuta per lunghi periodi di tempo. Questo permette ai ricercatori di scattare immagini di cellule vive ben focalizzati. Immagini acquisite vengono riprodotti come file di filmato. Le immagini sono analizzate utilizzando il software di analisi delle immagini, come ImageJ 21,22, FIJI 23, o altri software disponibili in commercio.

<table><tbody><tr><td>1 Forbici per la decapitazione</td><td>WPI</td><td>501749</td><td>Autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>1 Forbici fini per l'isolamento del cuore e il taglio</td><td>WPI</td><td>14393</td><td>Autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>2 Pinze fini (Dumont n. 5)</td><td>Autoclave Sigma</td><td>F6521</td><td>prima dell'uso</td></tr><tr><td>3 Piatti di plastica sterilizzati da 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Per isolamento cardiaco</td></tr><tr><td>3,5 cm Fondo in vetro piastre di coltura</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Per la placcatura finale dei cardiomiociti per il futuro imaging di cellule vive. Le micro-piastre di ibidi sono un'alternativa accettabile.</td></tr><tr><td>Piastre di coltura con fondo in vetro da 3,5 cm</td><td>MatTek</td><td>P35G-0,17-14-C</td><td>Per TIRF o immagine ad alta risoluzione</td></tr><tr><td>Soluzione di etanolo, 70% (v/v) in acqua</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>2% Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>1 Piatto di plastica sterilizzato da 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Per tripsinizzazione</td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Due piastre per colture cellulari in plastica da 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Per la selezione</td></tr><tr><td>Autopipetta</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-300</td><td>Per la triturazione</td></tr><tr><td>Contatore</td><td></td><td></td><td></td>cellulare</tr><tr><td>Cellometro, contatore cellulare automatizzato</td><td>nexcelom</td><td></td><td>Per controllare e contare le cellule</td></tr><tr><td>Microscopio ed ematocitometro</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Per controllare e contare le cellule</td></tr><tr><td>Soluzione di tripano blu, 0,4%</td> <td>invitrogeno</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubatore</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale di incubazione</td><td>Sigma</td><td>Z673129</td><td>Per agitare il tessuto cardiaco con collagenasi a 37 gradi; C a 170-200 giri/min</td></tr><tr><td>10 mg/ml soluzione di BrdU</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, invitrogeno ad alto contenuto di glucosio</td><td></td><td>41965039</td><td>Miscelare il terreno come indicato nel protocollo e riscaldare prima dell'uso</td></tr><tr><td>MEM</td><td>invitrogen</td><td>31095029</td><td>Miscelare il terreno come indicato nel protocollo e riscaldare prima dell'uso</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>invitrogeno</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina (10.000 U/ml)&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sezione 2 Trasduzione</td><td></td><td></td><td></td>lentivirale</tr><tr><td>3 Impacchettamento plasmidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Il vettore di trasferimento lentivirale, pLVX-IRES-Puro</td><td>Clontech</td><td>632183</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (terreno senza siero)</td><td>invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Reagente</td><td></td><td></td><td></td>di trasfezione</tr><tr><td>polietilenimmina" Max", (MW 40.000) - PEI lineare ad alta potenza (equivalente a Mw 25.000 in forma base libera)&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>24765-2</td><td>Può essere sostituito con X-tremeGENE 9 di Roche</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td>sostituto del PEI come reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>Clorochina</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td>Sciogliere in acqua e fare 100 mM di soluzione madre. L'inibizione dell'acidificazione endosomiale può essere ottenuta con 10-100 &mu; M Clorochina.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Luer-Lok da 10 ml, sterilizzata</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m filters</td><td>Sigma</td><td>F8677</td><td>Utilizzare solo filtri in acetato di cellulosa o polietersulfone (PES) (a basso legame proteico). Non utilizzare filtri alla nitrocellulosa. La nitrocellulosa lega le proteine di superficie sull'involucro lentivirale e distrugge il virus.</td></tr><tr><td>Bromuro di esadimetrina</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>Sciogliere in acqua e fare 8 mg/ml di soluzione madre, quindi filtrarla per sterilizzare.</td></tr><tr><td>Polietilenglicole 6.000</td><td>Sigma</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sezione 3 Trasduzione</td><td></td><td></td><td></td>adenovirale</tr><tr><td>Cellule HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Alcune piastre per colture cellulari da 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra a 96 pozzetti con coperchio, fondo piatto, coltura tissutale, sterile</td><td>BD Falcon</td><td>353072</td><td>Per titolazione</td></tr><tr><td>Pipetta multicanale, 10-100 &; l, 8 canali</td><td>eppendorf</td><td>3122 000.035</td><td></td></tr><tr><td>Sezione 4 Imaging</td><td></td><td></td><td></td>di cellule vive</tr><tr><td>Microspopy confocale a disco rotante</td><td>PerkinElmer</td><td>L7267000</td><td></td></tr><tr><td>Una camera a temperatura controllata</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Per mantenere la temperatura a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>A Sistema ambientale CO2</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Opzionale per mantenere la concentrazione ottimale di CO<2 per mantenere la concentrazione ottimale</td></tr> di <tr><td>COsub>2 Mezzo indipendente, senza glutammina</td><td>invitrogen</td><td>18045-054&nbsp; &nbsp;</td><td>Per l'imaging time-lapse a lungo termine</td></tr><tr><td>DMEM, glicemia alta, HEPES, senza rosso fenolo</td><td>invitrogen</td><td>21063-029</td><td>Per l'imaging time-lapse a lungo termine</td></tr></tbody></table>

imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato cardiomyocytes seguito adenoviral e lentivirali trasduzione uso confocale spinning disk microscopia

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Primario cardiomiociti neonatali di ratto sono utili in base nella ricerca cardiovascolare vitro perché possono essere facilmente isolati in gran numero in una singola procedura. Grazie ai progressi nella tecnologia del microscopio è relativamente facile per catturare immagini di cellule in vivo allo scopo di indagare eventi cellulari in tempo reale con una minima preoccupazione per quanto riguarda fototossicità alle cellule. Questo protocollo descrive come prendere le immagini timelapse cellule vive di ratto primaria cardiomiociti neonatali utilizzando un microscopio confocale disco rotante che segue la trasduzione lentivirale e adenoviral di modulare le proprietà della cella. L&#39;applicazione di due diversi tipi di virus rende più facile per raggiungere un adeguato livello dei tassi di trasduzione e di espressione di due geni diversi. Immagini di cellule vive bene focalizzate possono essere ottenuti utilizzando il sistema autofocus del microscopio, che mantiene a fuoco stabile per lunghi periodi di tempo. Applicando questo metodo, le funzioni di ingegnere esogenamenteproteine ​​di ed espressi in cellule primarie in coltura possono essere analizzati. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per esaminare la funzione dei geni attraverso l&#39;uso di siRNA nonché di modulatori chimici.

Per illustrare la tecnica, un EGFP lentivirus codifica (proteina fluorescente verde)-tag Cx43 (Connexin43) o un Cx43 mutato 32 è stato usato per esprimere le proteine ​​EGFP-tag nelle cellule, e una codifica adenovirus FGFR1DN (recettore del fattore di crescita dei fibroblasti 1 negativo dominante ) è stato utilizzato per arrestare la segnalazione FGF nella cella 33-35. Tre giorni dopo l&#39;isolamento di cardiomiociti, i cardiomiociti isolati state trasdotte con lentivirus per esprimere proteine ​...

Questo protocollo descrive un metodo di imaging di cellule vive utilizzando cardiomiociti neonatali primari di ratto dopo trasduzione lentivirale e adenovirale utilizzando la microscopia confocale a disco rotante. Ciò consente osservazioni dettagliate dei processi cellulari nei cardiomiociti viventi.

Imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato Cardiomyocytes seguito Adenoviral e lentivirali trasduzione Uso confocale Spinning Disk Microscopia

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere immagini in time-lapse di cardiomiociti primari da ratto neonati dopo la trasduzione con lentivirus e adenovirus, utilizzando una microscopia confocale a disco rotante. Questo viene realizzato innanzitutto isolando i cardiomiociti da cuccioli di ratto e seminando le cellule in piatti con fondo in vetro. Il passaggio successivo consiste nell'eseguire la trasduzione della Conexina 43 marcata con EGFP mediante lentivirus, seguita dalla trasduzione del recettore tirosina chinasi fibroblastico dominante negativo (fgfr) mediante adenovirus nei cardiomiociti.L'ultimo passaggio consiste nell'acquisire immagini in time-lapse mediante microscopia confocale a disco rotante. In definitiva, è possibile ottenere un filmato riprodotto a partire dalle immagini in time-lapse acquisite. Tale filmato mostra la distribuzione della proteina marcata con EGFP espressa da geni lentivirali in cardiomiociti primari vivi in condizioni cellulari alterate da una proteina espressa da adenovirus, dominante negativa per fgfr1.Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che consente di eseguire l'acquisizione temporale di cellule vive mediante un microscopio

live-cell-imaging-primary-rat-neonatal-cardiomyocytes-following

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Adulti miociti cardiaci sono cellule primarie che possono essere isolati da cuori animali e coltivate per diversi giorni. In questo periodo la cultura trasferimento genico adenovirali possono essere usate per esprimere biosensori geneticamente codificato (GEBS) o proteine ​​di fusione fluorescenti. Entrambi gli approcci consentono indagini cellulari mediante microscopia confocale.

L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Qui sviluppiamo gli strumenti necessari...

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

Culture del mouse cardiomiociti primari sono uno degli strumenti cardine per l'indagine di organizzazione e la funzione miofibrillare. Il protocollo che segue descrive l'isolamento e la coltura di cardiomiociti primari di cuori neonatali mouse. Le risultanti colture di cardiomiociti possono successivamente essere utilizzati per una varietà di biomeccanici, saggi biochimici e cellule biologiche.

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

L'isolamento dei cardiomiociti neonatali di ratto è una procedura imprevedibile e dispendiosa in termini di tempo.  Questo studio descrive i metodi per la crioconservazione e lo scongelamento dei cardiomiociti neonatali di ratto che consentono un uso più efficiente delle cellule. Gli NRCM scongelati possono essere utilizzati per vari esperimenti senza la necessità di eseguire isolamenti ogni volta.

Isolamento e Crioconservazione di neonatali Rat Cardiomyocytes

Questo protocollo descrive un metodo passo-passo per l'isolamento riproducibile e la coltura a lungo termine di cardiomiociti di topo adulto con alta resa, purezza e vitalità.

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare nei cardiomiociti, presentiamo protocolli che utilizzano due linee di topi transgenici: Myh6-H2B-mCh topi transgenici, per l'identificazione inequivocabile dei nuclei dei cardiomiociti, e topi CAG-eGFP-anillina, per distinguere la divisione cellulare dalle variazioni del ciclo cellulare.

La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

Questo manoscritto descrive un protocollo passo-passo per la generazione e la quantificazione di diversi sottotipi cardiaci riprogrammati utilizzando una somministrazione mediata da retrovirus di Gata4, Hand2, Mef2c e Tbx5.

Valutare cardiomiociti sottotipi A seguito di riprogrammazione Fattore di trascrizione-mediata di fibroblasti embrionali di topo

Sono stati sviluppati e descritti diversi protocolli per l'isolamento di diversi tipi di cellule cardiache da un cuore del topo. Qui viene descritto un protocollo ottimizzato che consente l'isolamento di tipi di cellule cardiache di elevata qualità (cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti) da una singola preparazione, riducendo i costi sperimentali.

Isolamento simultaneo di cardiomiociti di alta qualità, cellule endoteliali e fibroblasti da un cuore di ratto adulto

Qui, presentiamo un metodo per studiare la morfogenesi dei neuriti negli espianti retinici postnatali di topo mediante microscopia confocale time-lapse. Descriviamo un approccio per l'etichettatura sparsa e l'acquisizione di tipi di cellule retiniche e dei loro processi fini utilizzando vettori virali adeno-associati ricombinanti che esprimono proteine fluorescenti mirate alla membrana in modo Cre-dipendente.

Imaging time-lapse dell'arborizzazione neuronale utilizzando l'etichettatura del virus adeno-associato sparso di popolazioni di cellule retiniche geneticamente mirate

Viene presentata una serie di protocolli che descrivono la misurazione della funzione contrattile tramite il rilevamento della lunghezza del sarcomero insieme alla misurazione transitoria del calcio (Ca2+) nei miociti isolati di ratto. È inclusa anche l'applicazione di questo approccio per studi su modelli animali di insufficienza cardiaca.

Analisi della disfunzione contrattile cardiaca e dei transitori Ca2+ nei miociti dei roditori

Il presente protocollo descrive i metodi per l'espressione transgenica nei cuori di ratto e topo mediante iniezione intramiocardica diretta del virus sotto guida ecocardiografica. Qui vengono spiegati anche i metodi per la valutazione della suscettibilità dei cuori alle aritmie ventricolari mediante la stimolazione elettrica programmata di cuori isolati perfusi da Langendorff.

Espressione del transgene virale nei cuori dei roditori e valutazione del rischio di aritmia cardiaca

Impara l'imaging cellulare dal vivo di cardiomiociti neonatali di ratto primari dopo trasduzione lentivirale e adenovirale usando microscopia confocale a disco rotante. Questo metodo consente l'osservazione in tempo reale delle dinamiche cellulari cardiache.

Imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato Cardiomyocytes seguito Adenoviral e lentivirali trasduzione Uso confocale Spinning Disk Microscopia (Video) | JoVE Journal

Imaging cellulare dal vivo di primaria ratto neonato Cardiomyocytes seguito Adenoviral e lentivirali trasduzione Uso confocale Spinning Disk Microscopia

Esplora altri video