Un Isolato sistema Cuore di lavoro per i grandi modelli animali
11 giugno 2014
La maggior parte degli studi che coinvolgono l'apparato di Langendorff utilizzano modelli di piccoli animali a causa della maggiore complessità dei sistemi per mammiferi più grandi. Descriviamo un sistema di Langendorff per modelli animali di grandi dimensioni che ne consente l'uso in una vasta gamma di specie, compreso l'uomo, e l'acquisizione di dati relativamente facile.
L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la funzione cardiaca di animali di grandi dimensioni su un circuito ex vivo. Questo viene ottenuto innanzitutto assemblando l'apparato del cuore funzionante. Nel secondo passaggio, il sangue viene lavato, riconstituito con soluzione salina normale e, nell'ultimo passaggio, gli elettroliti vengono ottimizzati.
Il cuore viene collegato in modo da replicare i parametri emodinamici in vivo. In definitiva, un catetere a conduttanza inserito nel ventricolo può essere utilizzato per ottenere misurazioni quantitative della funzione ventricolare. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di modelli animali di piccola taglia, è che produce dati clinicamente rilevanti evitando al contempo i fattori di confondimento immunologici osservati nei trapianti su animali di grande taglia.
Per costruire l'apparato di Langendorff, iniziare collegando il serbatoio cardiaco al serbatoio del sangue mediante un tubo di tre ottavi di pollice, assicurandosi che il tubo passi attraverso una pompa a rulli. Successivamente, collegare il serbatoio del sangue all'ossigenatore-riscaldatore mediante un altro tubo di tre ottavi di pollice, quindi collegare l'ossigenatore-riscaldatore a un connettore a Y. Collegare uno dei rami del connettore a Y alla pompa centrifuga.
Quindi collegare la pompa centrifuga a un secondo connettore a Y per creare un trappola per bolle e un mezzo per inserire il trasduttore di pressione. Fissare un pezzo di tubo da tre ottavi di pollice per bloccare una valvola emostatica al braccio rivolto verso l'alto. Quindi fissare un pezzo di tubo da tre ottavi di pollice al braccio rivolto verso il basso e collegare l'altro braccio del connettore a Y all'ingresso della camera di pre-carico.
Assicurarsi che questo tubo passi attraverso la seconda pompa a rulli. Collegare prima la linea di pre-carico alla parte di efflusso della camera di pre-carico. Questa verrà infine collegata all'atrio sinistro.
Collegare il tubo da tre ottavi di pollice in eccesso all'uscita di questa camera, quindi collegare la bombola di ossigeno e l'apparecchio di riscaldamento all'ossigenatore-riscaldatore. Infine, chiudere con una molletta la linea che va dal connettore a Y alla camera di pre-carico, poiché questa linea non verrà utilizzata fino a quando il cuore non sarà messo in funzione. A questo punto, accendere l'apparecchio di riscaldamento della bombola di ossigeno, la pompa a rulli, collegare i due serbatoi e la pompa centrifuga, e lavare il sangue seguendo le istruzioni del produttore.
Successivamente, ricostituire i globuli rossi lavati con soluzione fisiologica alla concentrazione di ematocrito desiderata. Aggiungere il sangue diluito all'apparato langor e verificare l'ematocrito. Regolare le velocità delle due pompe per avviare il flusso sanguigno attraverso il sistema, escludendo la camera di pre-carico.
Verificare il pH e gli elettroliti della miscela di sangue e regolare fino a valori fisiologici per la specie utilizzata, per prevenire un ingresso dannoso di calcio durante la riperfusione. Mantenere inizialmente il livello di calcio sull'apparato di Langendorff tra 0,3 e 0,5 millimoli per litro. Dopo aver calibrato l'apparato di Langendorff, rimuovere rapidamente un cuore adeguatamente riposato dal contenitore di conservazione.
Versare fuori qualsiasi soluzione di conservazione dai ventricoli. Asciugare delicatamente il tessuto e pesarlo. Quindi reinserire il cuore nel contenitore di conservazione e orientarlo in modo che l'aorta sia rivolta verso l'alto, per aiutare a mantenere una temperatura miocardica fredda.
Successivamente, inserire un cannula di tre ottavi di pollice nell'aorta e fissarla con un serracavo. Ridurre la pompa centrifuga fino a ottenere un flusso lento e gocciolare il sangue nell'aorta finché non sarà piena e completamente priva di aria. Quando l'aorta sarà piena di sangue, collegare con attenzione la cannula aortica al tubo aortico sull'apparato L endorf, annotando l'orario di collegamento.
Inserire quindi il trasduttore di pressione calibrato attraverso la valvola di emostasi nell'aorta nativa. Iniziare le misurazioni della pressione e regolare la velocità della pompa centrifuga fino al raggiungimento della pressione di ripristino del flusso desiderata. Monitorare attentamente la pressione aortica, in particolare durante la fase iniziale di ripristino del flusso, e aumentare progressivamente la temperatura dell'unità di riscaldamento fino a quando la temperatura intramiocardica raggiunge 37 gradi Celsius.
Prelevare un campione basale al tempo zero dal serbatoio di sangue venoso per misurare il pH, gli elettroliti e altre misurazioni biochimiche. Inserire quindi una sonda termica nel settum e monitorare la temperatura miocardica. Prelevare campioni di sangue ogni 15 minuti, aggiustando i parametri fisiologici secondo le esigenze dell'esperimento, e aggiungere circa un millimole di calcio alla soluzione ematica ogni cinque minuti.
Assicurarsi che il calcio ionico sia superiore a 0,8 millimoli per litro prima dell'avvio della modalità di lavoro. Dopo aver messo il cuore in modalità di lavoro, utilizzare un filo di sutura in polipropilene 3-0 per eseguire una sutura a borsellino all'apice del ventricolo sinistro. Successivamente, usare un ago da 16 gauge per praticare un'incisione puntiforme all'interno della sutura a borsellino.
Inserire il catetere di conducibilità pressione-volume nell'incisione apicale. Osservare l'output dei dati per determinare quanti segmenti di volume sono attivi. Se non tutti i segmenti sono attivi, regolare la posizione del catetere finché lo sono; potrebbe essere necessario un lieve movimento rotatorio del catetere per ottimizzare la morfologia del tracciato.
Quindi, utilizzando un catetere opportunamente calibrato, acquisire almeno 30 secondi di dati pressione-volume di base per determinare le misurazioni della funzione cardiaca dipendenti dal volume. Una volta ottenuti un numero sufficiente di cicli, utilizzare una pinza per tubicini per occludere lentamente il tubicino del pre-carico. I cicli pressione-volume dovrebbero iniziare a ridursi e spostarsi verso il basso e a sinistra.
Questo fenomeno è chiamato "walk down". Dopo aver acquisito dai 10 ai 15 secondi di dati di walk down, rilasciare la pinza sul tubo in modo da permettere al precarico di rientrare nell'atrio sinistro ed ottenere misurazioni del funzionamento cardiaco indipendenti dal volume. Infine, fare clic sul pulsante di arresto per interrompere l'acquisizione dei dati ed ottenere misurazioni replicate.
Dopo cinque minuti, ripetere la procedura. A partire dal passaggio di occlusione, i cambiamenti nella resistenza coronarica possono causare fluttuazioni della pressione di perfusione. Queste variazioni possono essere lievi e correggersi gradualmente nel tempo.
Tuttavia, in alcuni casi, queste variazioni possono essere brusche e richiedere un aggiustamento del flusso attraverso la pompa centrifuga per mantenere la pressione di ripristino desiderata. In questo esperimento, al momento dell'inserimento iniziale del catetere pressione-volume in un cuore di suino conservato a quattro gradi Celsius per due ore, i tracciati erano di scarsa qualità, con numerose aree di sovrapposizione e nessun componente riconoscibile del ciclo cardiaco. Tuttavia, con una minima manipolazione del catetere all'interno del ventricolo, la morfologia dei tracciati è migliorata notevolmente, consentendo di ottenere misurazioni nonostante l'ottimizzazione della posizione del catetere.
I loop acquisiti sul circuito ex vivo possono avere una morfologia diversa rispetto ai loop in vivo, probabilmente a causa dell'orientamento differente del cuore sul circuito rispetto a quello presente in un animale supino, nonché alla mancanza di connessioni anatomiche presenti in un animale vivo. Inoltre, l'uso di fili di stimolazione per regolare la frequenza cardiaca introduce una corrente elettrica esterna che provoca il picco visibile nella parte in basso a destra dei loop ex vivo. Tuttavia, fintanto che questi loop presentano ancora i componenti del ciclo cardiaco, possono comunque fornire dati interpretabili.
Seguendo questa procedura, altri metodi come l'elettrocardiografia e l'ecocardiografia possono essere eseguiti per esaminare altre proprietà fisiche del cuore, inclusa la conduzione.
Panoramica
Questo articolo descrive un sistema Langendorff progettato per modelli di animali di grandi dimensioni, che consente la misurazione della funzione cardiaca ex vivo. Il metodo permette l'acquisizione di dati su diverse specie, inclusi gli esseri umani, evitando interferenze immunologiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Fisiologia cardiaca
- Misurazione della funzione cardiaca ex vivo
- Progettazione dell'apparato di Langendorff
Sfondo
- Gli studi tradizionali utilizzano spesso modelli animali di piccole dimensioni.
- I modelli animali di grandi dimensioni forniscono dati più clinicamente rilevanti.
- Gli elementi di confondimento immunologici complicano gli studi sul trapianto in animali di grandi dimensioni.
- L'apparato di Langendorff può essere adattato per specie più grandi.
Scopo dello studio
- Misurare la funzione cardiaca in animali di grandi dimensioni utilizzando un circuito ex vivo.
- Fornire un metodo affidabile per l'acquisizione di dati tra diverse specie.
- Ottimizzare i parametri fisiologici per ottenere misurazioni accurate.
Metodi Utilizzati
- Assemblaggio dell'apparato cardiaco funzionante.
- Lavaggio e ricostruzione del sangue con soluzione fisiologica.
- Calibrazione dell'apparato di Langendorff per specie specifiche.
- Inserimento di un catetere a conduttanza per misurazioni quantitative.
Risultati principali
- Misurazione riuscita della funzione ventricolare in modelli animali di grandi dimensioni.
- Stabilimento di condizioni fisiologiche per prevenire problemi di ingresso di calcio.
- La raccolta dei dati ha fornito informazioni clinicamente rilevanti sulle prestazioni cardiache.
- Dimostrata la fattibilità dell'uso dell'apparato di Langendorff in specie di maggiori dimensioni.
Conclusioni
- Il sistema di Langendorff può misurare efficacemente la funzione cardiaca in animali di grandi dimensioni.
- Questo metodo fornisce dati preziosi riducendo al minimo gli effetti immunologici.
- Studi futuri possono sfruttare questo approccio per ulteriori ricerche cardiache.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo sistema isolato di cuore lavorante consente la misurazione ex vivo della funzione cardiaca in modelli animali di grandi dimensioni, fornendo dati clinicamente rilevanti ed evitando interferenze immunologiche intrinseche negli studi di trapianto. Il sistema supporta l'applicabilità interspecie grazie alla regolazione regolabile della pressione di perfusione, facilitando la ricerca cardiovascolare traslazionale. Generando dati quantitativi pressione-volume, migliora la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistica nei percorsi di scoperta preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la misurazione diretta della funzione ventricolare in modelli animali di grandi dimensioni fisiologicamente rilevanti.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico fornendo dati sulle prestazioni cardiache rilevanti per l'uomo, senza interferenze immunologiche.
- Valore predittivo: Genera loop pressione-volume quantitativi che aumentano la sicurezza nelle valutazioni dell'interazione con il bersaglio e della modulazione del percorso.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce misurazioni standardizzate e riproducibili di pressione-volume ventricolare adatte a campagne di screening di composti.
- Output quantitativo: Fornisce letture emodinamiche continue in tempo reale, che consentono analisi di risposta in funzione della dose e caratterizzazione dell'efficacia.
- Scalabilità: Il sistema di perfusione adattabile permette un'esecuzione costante del saggio su cuori di diverse dimensioni e specie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Mantiene parametri emodinamici che replicano le condizioni in vivo, sostenendo la validità del modello preclinico.
- Continuità traslazionale: Collega i risultati della scoperta alla validazione preclinica attraverso endpoint funzionali misurabili.
- Decisioni basate sul rischio: Fornisce dati per informare decisioni di avanzamento o interruzione basate su segnali di sicurezza ed efficacia cardiaca.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino alla valutazione preclinica, fornendo dati cardiaci funzionali che guidano l'ottimizzazione del composto promettente e la valutazione della sicurezza.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante misurazioni dirette della funzione ventricolare in sistemi rilevanti per la malattia.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso la raccolta standardizzata e riproducibile di dati pressione-volume in condizioni di perfusione controllate.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitative di variabili dipendenti (ad esempio, pressione telesistolica, lavoro sistolico) che consentono il confronto tra diverse condizioni e il ranking dei composti.
- Ricerca traslazionale: Si collega ai lavori preclinici fornendo output funzionali rilevanti per l'uomo, in linea con le valutazioni dei biomarcatori e della sicurezza.
- Riutilizzo aziendale: L'apparato configurabile funge da piattaforma riutilizzabile per multipli bersagli e specie cardiovascolari, riducendo lo sviluppo ridondante di modelli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi cardiaci.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso un rigoroso controllo della pressione di perfusione coronarica e il mantenimento degli elettroliti fisiologici.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'identificazione precoce di potenziali cardiotoxicità, riducendo l'abbandono in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Facilita la priorizzazione dei composti in base a soglie quantitative di prestazione cardiaca, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in fisiologia cardiovascolare e tecniche di perfusione ex vivo.
- Si basa su pompe centrifughe, trasduttori di pressione e cateteri a conduttanza per un preciso controllo e misurazione emodinamica.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro riguardo alla preparazione del sangue, alla regolazione della temperatura e ai protocolli di acquisizione dati.
- Comporta adattamenti in relazione alle dimensioni variabili del cuore, ai requisiti ionici specifici per specie e all’ottimizzazione del posizionamento del catetere.
- È limitato dalla configurazione a sistema aperto, che complica la regolazione della temperatura a lungo termine, nonostante permetta la raccolta di dati sull’effluente e sul volume-pressione.
