Valutare l'attività anti-fungina isolato Alveolar macrofagi dal Microscopia confocale

Un metodo per valutare la capacità di isolato macrofagi alveolari del mouse per controllare la crescita di spore di Aspergillus fagocitati mediante microscopia confocale.

L'obiettivo generale di questa procedura è confrontare la capacità dei macrofagi di controllare la crescita della candia fungina ceto ex vivo. Ciò si ottiene marcando prima i macrofagi alveolari in vivo con un colorante lipofilo PKH 26. Il secondo passo della procedura consiste nel prelevare i macrofagi alveolari dai topi inoculati mediante lavaggio broncoalveolare.

Il terzo passo consiste nel coltivare e raccogliere spore fungine positive alla GFP. I passaggi finali consistono nel sfidare i macrofagi con candia positiva alla GFP e cellule fisse in punti temporali predeterminati. In definitiva, con una minima manipolazione cellulare ex vivo, la microscopia confocale può rivelare la capacità dei macrofagi alveolari di controllare la crescita della fagocitosi.

Spore Per prima cosa diluire il colorante lipofilo P HK 26, da 1 a cinque. Nel diluente C, il colorante sarà assorbito dalle cellule acide FOC. Caricare 100 microlitri di P HK 26 diluito in una siringa da mezzo cc e iniettare il colorante per via endovenosa retroorbitale o per la vena caudale.

Si stima che ogni topo fornirà da tre a 500.000 macrofagi marcati dopo 10 giorni. Sopprimere i topi e prepararsi ad aprire la cavità toracica dal diaframma. Praticare un piccolo foro nella gabbia toracica a destra del torace per sgonfiare i polmoni e per la successiva visualizzazione del gonfiaggio polmonare.

Successivamente, localizzare e isolare la trachea dai tessuti circostanti. Quindi, usando una pinza curva, tagliare con cura l'avventizia, che copriva la trachea. Una volta esposto, inserire un catetere nella trachea.

È molto importante evitare di perforare la trachea. Nell'eseguire questa manovra, fissare il catetere con una lunghezza di 10 centimetri di sutura avvolta attorno alla trachea. Quindi rimuovere l'ago dal catetere.

Quindi, riempire una siringa da sei millilitri con liquido di lavaggio e collegarla a un rubinetto di arresto a quattro vie. Collegare una siringa vuota da sei millilitri in un'altra posizione e collegare con cura la porta aperta al catetere. Con il gruppo in posizione, aprire il rubinetto di arresto fino alla siringa piena e iniettare lentamente circa un millilitro di soluzione nei polmoni.

Quindi, ruotare il rubinetto di arresto per chiudere la siringa e prelevare il liquido. Quindi prelevare con cura il fluido polmonare ricco di macrofagi osservando i polmoni sgonfiarsi. Ripetere questo processo fino a quando tutta la soluzione è stata iniettata e raccolta dai polmoni.

Aspettatevi una certa perdita di liquidi. Non sarai in grado di rimuovere il fluido dai polmoni se il catetere è nella posizione sbagliata. Muovere con cautela il catetere avanti e indietro fino a quando il liquido non può essere facilmente prelevato dai polmoni.

Assicurarsi di non far cadere il catetere. Quindi trasferire il liquido di lavaggio raccolto in un conico da 50 millilitri per raccogliere le cellule, centrifugare il fluido a 300 Gs per cinque minuti. A temperatura ambiente, versare il surnatante e, se lo si desidera, conservarlo per l'analisi delle citochine.

Risospendere le cellule in uno o cinque millilitri di RPMI 1640 con il 10% di FBS e determinarne la densità. Almeno il 95% delle cellule dovrebbe essere costituito da macrofagi da coltivare. Aspergillus fumigatus che esprime GFP Berran cervello infuso cardiaco.

A agri slants trattati con 0,05 grammi di cloramfenicolo e 0,5 grammi di gentamicina per litro. Incubare il fungo sulle inclinazioni leggermente tappate al buio e a temperatura ambiente. Dopo sette-10 giorni, raccogli la canadia lavando ogni inclinazione con 10 millilitri di 0,01%Tween 20 in DPBS usa un STR PET per allentare il fungo e usa diversi risciacqui per aumentare la resa.

Passare la sospensione attraverso un colino da 100 micron e raccogliere il filtrato contenente la chedia. In una piscina conica da 50 millilitri la kedia con una centrifuga di 10 minuti a 400 Gs a temperatura ambiente. Quindi risospenderli in 50 millilitri di DPBS e determinarne la concentrazione con un emocitometro.

Infine, lavare i kedia altre due volte con DBBS e risospenderli alla concentrazione desiderata. I primi vetrini di copertura e le piastre devono essere preparati sotto una cappa di sicurezza biologica. Immergere i vetrini di copertura quadrati da 22 millimetri in etanolo al 70% per cinque-10 minuti.

Quindi sciacquarli in PBS per ogni punto temporale da elaborare, utilizzare una pinza per posizionare delicatamente singoli vetrini sterilizzati nei pozzetti di una piastra a sei pozzetti, caricare un pozzetto per ogni condizione testata su ciascun seme di vetrino coprioggetti, circa 1 milione di macrofagi marcati PKH 26 in 300 microlitri di RPMI 1640 con il 10% di FBS, incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica durante la notte. La mattina seguente ad ogni foglietto coprioggetti seduto a 10 milioni di GFP che esprime aspergillus fuma Gattis kedia in 100 microlitri di RPMI 1640 caldo con il 10% di FBS. Rimetti le piastre nell'incubatrice per tutta la durata della sfida e fissa le cellule a intervalli di tempo predeterminati per ottenere i risultati.

Per fissare una piastra di cellule, aggiungere un volume di formaldeide al 2% a ciascun pozzetto e lasciare riposare la piastra per due ore a temperatura ambiente. Dopo due ore, spostare la piastra a quattro gradi Celsius fino a quando anche le altre piastre non sono state fissate. Per prima cosa, preparare un vetrino con sei microlitri di mezzo di montaggio fluorescente con dappy Quando tutte le piastre sono fissate, rimuovere delicatamente i vetrini coprioggetto con una pinza e sciacquarli in un bagno di DPBS per un minuto.

Quindi tamponare i bordi per rimuovere il liquido in eccesso. Quindi, appoggiare delicatamente il coperchio, infilarlo nel supporto di montaggio preparato in precedenza sul vetrino. Non è necessario premere il cursore per far sì che il mezzo si diffonda.

Sigillare il vetrino con smalto per unghie e lasciarlo asciugare all'aria. Conservare i vetrini a temperatura ambiente al buio fino a quando non possono essere visualizzati in vivo. Alveolare etichettato.

I macrofagi sono stati raccolti e poi esposti a una sfida fungina. Topi wild type e topi portatori di una mutazione in N-A-D-P-H. Le ossidasi venivano utilizzate per raccogliere i macrofagi dopo tre o sette ore.

La fagocitosi era simile nei ceppi wild type e mutanti. Le cellule contenenti candia positive sia per PKH 26 che per GFP erano abbondanti in tutti e tre i genotipi, tuttavia, a 14 ore sono emerse differenze rispetto alla capacità dei macrofagi di controllare la crescita di Candia fagocitata. Sono stati trovati molti macrofagi selvatici intatti contenenti candia fagocitata.

Questo è stato osservato anche in cellule con un enzima N-A-D-P-H ossidasi funzionale in quelle NCF. Al contrario, i macrofagi alveolari intatti privi di N-A-D-P-H ossidasi erano scarsi, suggerendo che Phace toast Kedia fosse cresciuto distruggendo le cellule. Ciò suggerisce anche che il controllo della crescita del face toast Kedia è dipendente dalla N-A-D-P-H ossidasi Una volta padroneggiata, questa tecnica di lavaggio può essere eseguita in circa cinque minuti per topo se eseguita correttamente.