Espressione ricombinante Cellulase Cel5A da

L'obiettivo generale del seguente esperimento è esprimere temporaneamente proteine bersaglio nel tabacco, al fine di valutarne la fattibilità nell'espressione enzimatica basata su piante in un breve lasso di tempo. Questa espressione transitoria si ottiene infiltrando le foglie di tabacco con un ceppo di *Agrobacterium tumefaciens* che contiene un vettore con il gene di interesse come secondo passaggio. Dopo l'incubazione, le foglie delle piante infiltrate vengono raccolte ed estratti proteici sono parzialmente purificati per ottenere una soluzione enzimatica funzionante. Successivamente, viene effettuata un'analisi proteica per valutare gli effetti dell'espressione basata su piante sull'enzima e per verificarne l'attività enzimatica.

Si ottengono risultati che mostrano la dimensione delle proteine, possibili effetti della glicosilazione e l'attività enzimatica basati su analisi di western blotting, saggi zy e di degradazione del substrato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sulla conversione della biomassa vegetale e può inoltre fornire informazioni sull'attività degli enzimi dopo essere stati espressi in modo transitorio nel tabacco. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi di infiltrazione sono difficili da apprendere a causa della facilità con cui le foglie possono essere danneggiate dalla siringa, dagli indumenti e procederò a eseguire gli esperimenti in condizioni sterili.

Trasferire singole colonie di agrobatterio in un matraccio Erlenmeyer contenente 10 millilitri di brodo estratto di lievito con antibiotici. Incubare quindi il brodo inoculato per 36-40 ore a 26 °C con agitazione a 180 giri al minuto. Successivamente, inoculare 200 microlitri di ciascuna coltura in 20 millilitri di brodo estratto di lievito con gli stessi antibiotici utilizzati in precedenza e incubare nelle stesse condizioni per 36-40 ore.

Indurre le colture con due microlitri di acetofenone, 100 microlitri di soluzione di glucosio al 40% e 200 microlitri di tampone MES uno molare a pH 5,6 e continuare l'incubazione per tutta la notte. Prelevare ora le piante dalla serra e utilizzare la punta di una pipetta per fare un'incisione sul lato assiale AB della terza alla quinta foglia a partire dall'apice della pianta, per facilitare l'infiltrazione. Successivamente, riempire una siringa con il mezzo di infiltrazione e posizionarla su una delle incisioni precedentemente effettuate.

Supportare la siringa con un dito sul lato della foglia assiale e iniettare con attenzione il mezzo nella zona fogliare intravenosa. Per visualizzare la fluorescenza nelle sezioni fogliari che esprimono TR cell 5:00 AM cherry, illuminare le piante con una sorgente luminosa portatile che emette luce verde. Quando osservata attraverso un filtro rosso, la fluorescenza proveniente da TR cell 5:00 AM cherry sarà chiaramente visibile.

Per estrarre le proteine espresse, selezionare foglie di tabacco che sono state infiltrate con AUM contenente P track ERTR cell five A e tagliarle in pezzi da un grammo. Successivamente, posizionarle in un mortaio preraffreddato e aggiungere una quantità adeguata di azoto liquido ai campioni. Macinare le foglie fino a ottenere una polvere utilizzando un pestello.

Ripetere il processo con foglie di tabacco non infiltrate per ottenere campioni di controllo. Quindi aggiungere due millilitri di PBS contenente un millimolare di fenil metilsulfonil fluoruro alla materia vegetale macinata e mescolare fino a quando la maggior parte della materia vegetale è in sospensione. Centrifugare l'estratto a 15.000 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi scartare il pellet, parzialmente purificare la cellula TR cinque A incubando il surnatante contenente le proteine a 55 gradi Celsius per 10 minuti e lasciarlo riposare a temperatura ambiente per altri 10 minuti. Successivamente, centrifugare il surnatante a 15.000 ×g per 10 minuti a temperatura ambiente. Scartare il pellet e utilizzare il surnatante contenente le proteine per tutti gli usi.

Ulteriori saggi. Eseguire anche il processo di purificazione parziale per piante non infiltrate al fine di ottenere campioni di controllo. In questa procedura, mescolare etilcellulosa e acqua per ottenere una soluzione al 1,5% e incubare sotto agitazione fino a completo scioglimento.

Per preparare un gel A-C-M-C-S-D-S, sostituire un millilitro di CMC al 1,5% con un millilitro di acqua in una soluzione per gel SDS-PAGE da 10 millilitri e versare normalmente il gel. Successivamente, denaturare i campioni facendoli bollire in presenza di SDS. Eseguire l'elettroforesi a 200 volt per 50 minuti, fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel. A questo punto, effettuare il ripiegamento delle proteine direttamente nel gel su un gel SDS-PAGE al 15% C-M-C-S-D-S.

Utilizzare beta ciclodestrina all'1,5% in tampone fosfato citrato 20 millimolare a pH 6,5. Incubare il gel in questa soluzione a temperatura ambiente con agitazione delicata per 15 minuti. Rimuovere la soluzione di beta ciclodestrina e lavare brevemente il gel con acqua, quindi incubare a temperatura ambiente in tampone acetato di sodio 50 millimolare a pH 4,8 per altri 15 minuti.

Quindi eseguire la zimografia CMC utilizzando il gel di elettroforesi C-M-C-S-D-S rifoldato al punto 15% incubando il gel in tampone di acetato di sodio 30 millimolare per 20 minuti a 50 gradi Celsius. Per visualizzare i punti in cui il CMC è stato degradato, colorare il gel per 10 minuti con una soluzione al 0,1% di rosso Congo e svilupparlo con cloruro di sodio 1 molare per 30 minuti oppure fino a quando compaiono bande nitide; alla fine, lavare il gel con acido acetico 0,3%. Per un'immagine più chiara immediatamente prima di eseguire il saggio, preparare una soluzione lavorativa 4 MUC 2X e pipettare 100 microlitri della soluzione lavorativa 4 MUC in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti.

Quindi aggiungere 100 microlitri di ogni campione nelle pozzette appropriate, eseguendo ogni campione in triplicato, utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 360 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nanometri. Determinare il punto temporale a zero minuti della fluorescenza di quattro mu mediante spettroscopia fluorescente. Successivamente, incubare le piastre coperte con coperchi adesivi a 50 gradi Celsius per 20 minuti.

Successivamente, arrestare la reazione congelando il campione. Dopodiché, misurare la fluorescenza finale in unità mu utilizzando gli stessi parametri del punto temporale a zero minuti. Sottrarre il valore di fluorescenza a zero minuti da quello a 20 minuti per determinare la variazione di fluorescenza causata dall'attività enzimatica immediatamente prima dell'esecuzione del saggio.

Preparare la soluzione lavorativa A-O-C-M-C due X. Quindi, combinare 50 microlitri del campione e 50 microlitri della soluzione lavorativa in un tubo da 1,5 millilitro. Successivamente, incubare i campioni per 20 minuti a 50 gradi Celsius.

Interrompere la reazione aggiungendo 250 microlitri di soluzione precipitante. Successivamente, vortexare ogni campione vigorosamente per 10 secondi per assicurare un completo mescolamento del campione con la soluzione precipitante. Quindi, incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti e vortexarli nuovamente prima di centrifugarli a 1000 G per 10 minuti.

Successivamente, trasferire 200 microlitri del SNAT da ogni campione in una piastra a 96 pozzetti senza disturbare. L'attività enzimatica del pellet è indicata da livelli più elevati di colorante solubilizzato. Misurare questo valore mediante spettroscopia di assorbanza a una lunghezza d'onda di 590 nanometri.

In questo passaggio, posizionare cerchi di carta da filtro in provette da 1,5 o due millilitri. Aggiungere 100 microlitri di acetato di sodio 60 millimolare e 100 microlitri dei campioni sui cerchi di carta da filtro e incubare per 20 ore a 50 gradi Celsius con agitazione a 300 giri al minuto.

Inoltre, incubare i campioni singoli senza carta da filtro come controlli immediatamente prima di eseguire il saggio. Preparare una soluzione lavorativa di PABA 1,5 x contenente un millilitro di soluzione A di PBA e nove millilitri di soluzione B di PABA. Conservare sul ghiaccio fino all'uso. Successivamente, preparare i campioni in provette termostabili da 0,5 millilitri.

I campioni sono composti da 45 microlitri di acqua, cinque microlitri di ciascuna soluzione incubata con carta da filtro e 100 microlitri di soluzione working di PABA. Successivamente, eseguire i controlli del campione e cinque standard preparati nello stesso modo. Quindi incubare i campioni, i controlli e gli standard esattamente per 10 minuti a 100 gradi Celsius e raffreddare a temperatura ambiente per altri 10 minuti.

Trasferire con pipetta 100 microlitri della soluzione in una piastra a 96 pozzetti e analizzare con uno spettrofotometro a una lunghezza d'onda di 410 nanometri. Sottrarre i valori del controllo del singolo campione dai valori del campione della carta da filtro per determinare la quantità di zuccheri riducenti rilasciati. Di seguito è riportata un'immagine che mostra le cassette di espressione e l'espressione proteica nelle piante di tabacco.

Questo è l'aspetto di una foglia di tabacco infiltrata osservata alla luce normale e alla luce verde con filtro rosso, dove l'espressione di TR cell 5:00 AM cherry, indicata dal colore rosso, è chiaramente visibile. La gel elettroforetica SDS-PAGE, il western blot e l'assay su CMC mostrano la dimensione e l'attività della T cell five A. Le proteine solubili totali sono state separate e possiamo visualizzarle mediante colorazione con blu di Coomassie. Il western blot eseguito contro la regione con tag istidina di T cell five A conferma la dimensione della proteina; inoltre, l'attività cellulasi contro la CMC è mostrata da un zimogramma colorato con rosso Congo. Quello che si osserva qui sono le proteine solubili totali ottenute dalle foglie della pianta di tabacco in cui TR cell five A era stata espressa in modo transitorio, prima e dopo la purificazione mediante precipitazione termica, dove TR cell five A rappresenta la banda più grande visibile ed è rilevabile anche nel western blot e nel zimogramma CMC.

Visualizziamo anche le proteine solubili totali di piante di tabacco in cui Tcell five A non era presente, dopo la precipitazione termica, e le proteine da una miscela commerciale di tresa cellulasi. Questa figura mostra la quantificazione dell'attività enzimatica di TR cell five A: TR cell five A è stato incubato con quattro MUC Azo CMC o carta da filtro, e la degradazione del substrato è stata misurata mediante il rilascio del colorante azo fluoro quattro quattro mu oppure quantificando gli zuccheri riducenti attraverso il cambiamento di colore del PBA seguendo questa procedura. Altri metodi, come il targeting proteico, possono essere utilizzati per ottenere ulteriori informazioni su come la localizzazione della proteina possa influenzare la stabilità e l'attività enzimatica.

Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere una chiara comprensione di come esprimere in modo transitorio proteine nel tabacco, nonché una buona conoscenza su come valutare l'attività enzimatica. Per la conversione della biomassa in cellulosa.