Corsa di modellazione in Mouse: Coagulazione permanente dell'arteria cerebrale media distale
31 luglio 2014
Vari modelli murini di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) sono ampiamente utilizzati nella ricerca sul cervello sperimentale. Qui, dimostriamo il modello di transcranica permanente distale MCAO che produce coerente infarto corticale di misura corrispondente al danno imposto dalla maggioranza degli ictus ischemici umani.
L'obiettivo generale di questa procedura è creare un'occlusione permanente dell'arteria cerebrale media distale in un topo, ottenendo un infarto principalmente a livello della corteccia e di dimensioni relativamente paragonabili a quelle degli ictus umani. Questo risultato si ottiene innanzitutto valutando il valore basale dell'asimmetria nell'uso degli arti prima dell'intervento chirurgico. Il passaggio successivo della procedura consiste nell'eseguire l'intervento chirurgico per l'induzione dell'ictus mediante elettrocoagulazione dell'arteria cerebrale media distale.
Dopo l'intervento chirurgico, la presenza di deficit sensitivo-motori focali viene valutata misurando l'asimmetria nell'uso degli arti. Il passaggio finale consiste nell'analizzare il volume dell'infarto mediante colorazione con violetto di cresta. In definitiva, le lesioni corticali risultanti sono di dimensioni moderate e con una variabilità ridotta, il che rende questa tecnica un modello prezioso per la ricerca di base e traslazionale sull'ictus.
I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ad altri modelli comuni di ictus sono che la mortalità in questo modello è minima, così come il volume e la localizzazione dell'infarto. La neocorteccia rappresenta la maggior parte dei casi di ictus nell'uomo ed è altamente riproducibile. Generalmente, i principianti con questo metodo avranno inizialmente difficoltà con la rimozione delicata del cranio per minimizzare le lesioni meccaniche.
In secondo luogo, l'identificazione corretta e la corretta correlazione dell'arteria salivare mediale distale sono fondamentali per questo modello. Iniettare prima gli analgesici 30 minuti prima di iniziare l'operazione. Accendere la coperta riscaldata per il topo e impostarla a 37 gradi Celsius per tutta la durata dell'operazione.
Successivamente, assicurarsi che il gas anestetico composto dal 70% di azoto, 30% di ossigeno e isoflurano sia pronto. Quindi esporre il topo a 4% di isoflurano in una camera di induzione fino a quando non smette di muoversi. Successivamente, posizionare il topo sul tappetino riscaldante e somministrare isoflurano al 4% per un minuto aggiuntivo.
Dopo il minuto, modificare la percentuale di isoflurano al 1,5%. Verificare ora che il topo sia sufficientemente anestetizzato mediante il test del pizzicotto alla zampa, e in caso affermativo, applicare dafan etanolo agli occhi utilizzando una pinzetta. Iniziare l'intervento chirurgico con un'incisione di un centimetro tra l'orecchio e l'occhio. Separare la cute e identificare il muscolo temporale.
Ora sul generatore ad alta frequenza, impostare la funzione su coagulazione, la modalità su bipolare, la potenza a 12 watt e collegare la pinza. Durante la preparazione, aggiungere una goccia di soluzione fisiologica sul muscolo temporale esposto. Quindi utilizzare la pinza per elettrocoagulazione per staccare il muscolo temporale dal cranio nelle sue parti apicale e distale.
Il risultato è un lembo muscolare allentato. Ora identificare l'arteria cerebrale media o MCA al di sotto del cranio trasparente. Si trova nella parte rostrale della regione temporale, dorsale al seno retroorbitario.
Utilizzare un trapano per assottigliare l'osso direttamente sopra questa arteria fino a quando non diventa trasparente. Mantenere l'osso umido durante la perforazione utilizzando soluzione fisiologica. Ora, utilizzando pinzette molto fini, rimuovere con cura l'osso per esporre il ramo dell'arteria cerebrale media.
Impostare il generatore ad alta frequenza su sette watt. Coagulare ora l'arteria con la pinza ad elettrocoagulazione toccandola delicatamente senza afferrarla. Coagulare l'arteria sia in senso prossimale che distale alla biforcazione; in caso di variazione anatomica senza biforcazione dell'arteria cerebrale media (MCA), coagulare l'arteria il più prossimale possibile in due punti, distanti circa un millimetro l'uno dall'altro, dopo la coagulazione.
Attendere 30 secondi, quindi toccare delicatamente l'arteria con pinzette arrotondate. Successivamente, riposizionare il muscolo nella sua sede, in modo da coprire il foro di trapanazione. Suturare la ferita e collocare l'animale in una scatola per il recupero a 32 gradi Celsius per favorire il risveglio dall'anestesia, quindi riportarlo nella gabbia.
In generale, l'animale impiega da cinque a dieci minuti per riprendersi dall'anestesia. Il test del cilindro verifica il preferire un arto rispetto all'altro. Posizionare l'animale in un cilindro di vetro acrilico trasparente affiancato da due specchi disposti ad angolo retto.
Registrare l'animale per cinque minuti di fronte al vertice dei due specchi, sul lato opposto del cilindro. Dopo ogni prova, pulire il cilindro e il piano del tavolo con etanolo al 60%. Successivamente, eseguire un'analisi fotogramma per fotogramma.
Valutare il test contando il contatto di una delle quattro zampe con il cilindro durante la completa elevazione sulle zampe posteriori, e anche contando gli atterraggi con uno degli arti anteriori. Dopo un punteggio di elevazione completa, almeno 20 contatti di uno degli arti anteriori per prova sezione criostatica, ogni cervello serialmente in sezioni spesse 20 micrometri prelevate a intervalli di 400 micrometri. Raccogliere le sezioni su vetrini per conservarle a meno 20 gradi Celsius.
Utilizzando questo protocollo di sezionamento, tutte le sezioni che coprono l'area dell'infarto da un singolo cervello possono essere posizionate su un unico vetrino. Colorare le sezioni seguendo un protocollo standard con violetto cresteo per delimitare l'area del tessuto infartuato in ciascuna sezione cerebrale. I vetrini possono quindi essere montati, scansionati e analizzati utilizzando il metodo di Swanson per l'edema.
La mortalità corretta dovuta all'intervento chirurgico di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCA) è stata inferiore al 5%, principalmente a causa di emorragia subaracnoidea o anestesia inadeguata. Nessun decesso si è verificato durante il periodo di osservazione. Per questa analisi finalizzata all'uso di PA, l'asimmetria è stata misurata mediante il test del cilindro dopo l'induzione dell'ictus e confrontata con i valori basali ottenuti prima dell'occlusione dell'MCA; è stata rilevata un'asimmetria significativa degli arti a 24 ore, che ha mostrato un parziale recupero durante la prima settimana successiva all'ictus, una settimana dopo l'evento cerebrovascolare.
L'infarto indotto con colorazione al violetto di cresta ha mostrato un volume medio di infarto di 15,4 millimetri cubi, corrispondente approssimativamente al 12% di un emisfero cerebrale. La deviazione standard di questo modello è molto bassa. Inoltre, la localizzazione dell'infarto ha presentato una variabilità minima.
Una volta eseguita correttamente, questa operazione può essere completata entro 10 minuti. Oltre ai test sul cilindro e alla colorazione con violetto di cristallo mostrati, altri test comportamentali e metodi istologici consolidati possono essere utilizzati per caratterizzare ulteriormente l'esito e affrontare domande di ricerca specifiche. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come eseguire un'occlusione permanente della MCA distale nei topi.
Si raccomanda vivamente l'uso di procedure operative standard e di documentazione dettagliata per mantenere la riproducibilità del metodo.
Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per eseguire un'occlusione permanente dell'arteria cerebrale media distale (MCAO) nei topi, che determina un'infarto corticale costante simile agli ictus ischemici umani. La tecnica è utile sia per la ricerca di base che per quella traslazionale sull'ictus, grazie alla sua riproducibilità e al tasso minimo di mortalità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ricerca sull'ictus
- Modelli animali
Sfondo
- Occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) è un modello comune per lo studio dell'ictus ischemico.
- Questo modello permette l'esame dell'infarto corticale in un ambiente controllato.
- La comprensione dei meccanismi dell'ictus nei topi può fornire informazioni applicabili alle condizioni umane.
- Riproducibilità e bassi tassi di mortalità aumentano l'utilità del modello nella ricerca.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo affidabile per indurre un'occlusione permanente dell'arteria cerebrale media (MCAO) nei topi.
- Valutare l'entità dell'infarto corticale risultante e la sua rilevanza rispetto agli ictus umani.
- Valutare gli esiti comportamentali dopo l'intervento chirurgico mediante test di asimmetria nell'uso degli arti.
Metodi Utilizzati
- Valutazione iniziale dell'asimmetria nell'uso degli arti prima dell'intervento chirurgico.
- Elettrocoagulazione dell'arteria cerebrale media distale per indurre un ictus.
- Valutazione post-operatoria dei deficit sensori-motori mediante il test del cilindro.
- Analisi del volume dell'infarto attraverso la colorazione con violetto cresteo di sezioni cerebrali.
Risultati principali
- Il volume medio dell'infarto misurava 15,4 millimetri cubi, pari a circa il 12% di un emisfero cerebrale.
- È stata rilevata un'importante asimmetria degli arti a 24 ore dall'intervento chirurgico, con un recupero parziale osservato nella settimana successiva.
- Il modello ha mostrato una bassa variabilità nella localizzazione e nelle dimensioni dell'infarto.
- La mortalità dovuta alla procedura è stata inferiore al 5%, principalmente causata da emorragia subaracnoidea o errori nell'anestesia.
Conclusioni
- Il metodo MCAO descritto è efficace per lo studio dell'ictus ischemico nei topi.
- Fornisce un modello riproducibile con minima mortalità e risultati costanti.
- Test comportamentali e analisi istologiche possono ulteriormente caratterizzare gli effetti dell'ictus.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo modello consente un'infarto corticale riproducibile nei topi con bassa mortalità, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione degli obiettivi per l'ictus. Le dimensioni e la localizzazione dell'infarto sono allineate alla patologia dell'ictus umano, aumentando la rilevanza traslazionale per la valutazione terapeutica preclinica. Gli esiti comportamentali e istologici forniscono endpoint quantitativi per decisioni di avanzamento o interruzione nei percorsi iniziali di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche nei percorsi del colpo ischemico corticale con elevata rilevanza anatomica per la patologia umana.
- Valore operativo: La bassa variabilità del volume e della localizzazione dell'infarto aumenta la fiducia nelle valutazioni dell'interazione con il bersaglio e della modulazione del percorso.
- Valore predittivo: Supporta il triage preclinico modellando meccanismi fisiopatologici ritardati come l'infiammazione, l'angiogenesi e la plasticità neuronale.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Produce lesioni corticali standardizzate adatte a schermate coerenti di composti e valutazioni di risposta alla dose.
- Risultati quantitativi: La misurazione del volume dell'infarto mediante colorazione con violetto cresile consente un'analisi obiettiva di tipo istomorfometrico degli effetti del trattamento.
- Scalabilità: La procedura chirurgica si completa in meno di 10 minuti con una mortalità minima, favorendo un'elevata produttività nei flussi di lavoro di scoperta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: La predominanza dell'infarto corticale rispecchia la maggior parte degli ictus ischemici umani, migliorando l'affidabilità predittiva per la traduzione clinica.
- Continuità meccanicistica: Permette lo studio delle vie dell'ictus subacuto e cronico, inclusi rigenerazione e plasticità, in finestre di osservazione prolungate.
- Progresso aggiustato per il rischio: La bassa mortalità e l'elevata riproducibilità riducono la variabilità biologica, consentendo valutazioni precliniche di efficacia e sicurezza più affidabili.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello si inserisce nel percorso di scoperta dell'ictus, dalla validazione del bersaglio fino all'identificazione del capostazione e ai test di efficacia preclinica, in particolare per le terapie mirate ai meccanismi di danno e riparazione corticale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su composti neuroprotettivi e neuro-riparatori in un modello di infarto clinicamente rilevante.
- Screening: Permette la generazione standardizzata di infarti per una valutazione costante degli effetti dei composti sulla progressione della lesione.
- Analisi: La colorazione con violetto cresile e il test del cilindro forniscono letture complementari, istologiche e funzionali, per analisi dose-risposta e di andamento temporale.
- Ricerca traslazionale: Modella processi fisiopatologici ritardati rilevanti per le finestre temporali di intervento nello stroke subacuto e cronico.
- Riutilizzo aziendale: Procedure chirurgiche e analitiche standardizzate consentono la riproducibilità tra progetti e la condivisione della piattaforma tra gruppi di ricerca in neuroscienze.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Un'elevata fedeltà anatomo-patofisiologica rispetto all'ictus umano aumenta la fiducia nella validazione degli obiettivi terapeutici.
- Valore operativo: Una mortalità minima e una bassa variabilità dell'infarto migliorano la riproducibilità del saggio e riducono il numero di animali necessari per ogni esperimento.
- Valore strategico: Consente l'identificazione precoce di composti biologicamente attivi, riducendo il rischio di fallimento nelle fasi avanzate dei programmi per l'ictus.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione basata sui dati degli obiettivi terapeutici, in base alla modulazione costante della dimensione dell'infarto e del recupero funzionale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche microchirurgiche e nell'identificazione dei vasi intracranici.
- Dipende da apparecchiature per elettrocoagulazione e da impostazioni precise della potenza per l'occlusione arteriosa.
- Necessita di protocolli standardizzati di anestesia e di cure postoperatorie per ridurre al minimo la variabilità.
- L'adattamento a modelli transgenici richiede la validazione della fattibilità chirurgica e della coerenza dell'infarto.
- L'analisi istologica richiede protocolli standardizzati di sezionamento e colorazione per una quantificazione affidabile dell'infarto.
