Concentrarsi Formazione: Un test cellulare per determinare il potenziale oncogeno di un gene

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire il saggio di formazione del fuoco in linee cellulari di fibroblasti di topo, utilizzando un retrovirus per determinare il potenziale oncogeno di un gene. Ciò si ottiene clonando prima la sequenza per il gene di interesse in un vettore retrovirale. Il secondo passo consiste nel produrre particelle retrovirali utilizzando il vettore virale e le cellule di imballaggio in PLA.

Successivamente, il retrovirus viene utilizzato per infettare tre cellule di fibroblasti di topo T al fine di valutare il potenziale di trasformazione del gene di interesse. Il passaggio finale consiste nel consentire alle tre cellule T NIH di dividersi per due o tre settimane, seguite dalla colorazione con cristallovioletto per quantificare il numero di focolai formati. In definitiva, il saggio di formazione del fuoco viene utilizzato per mostrare se la sovraespressione di un gene di interesse è sufficiente per indurre una crescita indipendente dalla densità nelle cellule di fibroblasti di topo.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia del cancro, come lo screening per il potenziale oncogeno di un gene. Per iniziare, crea il vettore virale come descritto nel protocollo di testo. Quindi stabilire colture di plat E da cellule congelate scongelando rapidamente le cellule plat E in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e quindi trasferendole in una provetta conica da 15 millilitri.

Aggiungere lentamente nove millilitri di PLA E medium al tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare la provetta a 180 volte G per cinque minuti e scartare il surnatante. Risospendere le cellule con 10 millilitri di terreno di coltura E e trasferirle in un piatto di coltura di 10 centimetri.

Quindi incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di CO2 fino a quando non sono tra l'80 e il 90% confluenti. Eseguire la scissione delle cellule aspirando prima il terreno, quindi lavare le cellule una volta con PBS prima di aggiungere due millilitri di tripsin EDTA allo 0,05% e incubare per un minuto a temperatura ambiente, staccare le cellule picchiettando con le dita. Quindi aggiungere 10 millilitri di plat E medium e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri.

Centrifugare la provetta come prima e risospendere le cellule con 10 millilitri di terreno di coltura E. Il seme successivo, 2 milioni di cellule per piastra di coltura da 10 centimetri utilizzando il terreno di coltura E senza antibiotici e lasciare incubare le cellule durante la notte. Il giorno successivo, trasferire 300 microlitri di optimum in una microprovetta da 1,5 millilitri.

Aggiungere 27 microlitri di polietilene ammina al tubo preparato con Optum. Mescolare delicatamente picchiettando con le dita e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere nove microgrammi di DNA plasmidico di grado di trasfezione nella provetta mescolata delicatamente mediante vortice e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.

Quindi aggiungere il composto goccia a goccia nel piatto E prima di incubare per una notte. Il giorno successivo, aspirare il terreno contenente il reagente di trasfezione e aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura E fresco prima di rimettere le cellule nell'incubatore per stabilire tre colture NIH T tre. Per prima cosa, scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e trasferirle in una provetta da 15 millilitri.

Aggiungere lentamente nove millilitri di terreno NIH tre, T tre alle cellule, centrifugare la provetta a 180 volte G per cinque minuti e scartare lo snat. Quindi risospendere le cellule con 10 millilitri di terreno NIH tre, T tre e trasferirle in un piatto di coltura di 10 centimetri. Incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius al 5% di CO2, mantenendole sotto conflusso all'aumentare della frequenza di trasformazione spontanea.

Una volta che una coltura raggiunge la co-fluidità, una volta coltivato il seme tre volte 10 al quinto nih, tre cellule T per 10 centimetri piatto e incubare durante la notte per l'infezione il giorno successivo. Il giorno successivo, prelevare il surnatante retrovirale dalla piastra E utilizzando una siringa monouso da 10 millilitri, filtrandolo attraverso un filtro a membrana di nylon da 0,45 micron e trasferendolo in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura E fresco alle cellule prima di rimetterle nell'incubatore.

Quindi aspirare il terreno dalla piastra NIH a tre cellule T da infettare e aggiungere cinque millilitri di normale NI H tre, T tre terreni e cinque millilitri di virus contenente surnatante filtrato. Quindi, aggiungi il cervello di polietilene al piatto. Aggiungere una concentrazione di sei microgrammi per millilitro.

Incubare le cellule durante la notte prima di ripetere le fasi dell'infezione per un secondo ciclo di infezione. Dopo l'infezione, sostituire il virus, contenere il terreno con il normale IH tre T tre medio. Lasciare che le tre cellule T IH crescano per due o tre, sostituendo il terreno se necessario per la colorazione con cristallovioletto.

Aspirare il mezzo NIH tre T three e posizionare i piatti sul ghiaccio. Lavare i piatti due volte con PBS ghiacciato. Fissare le cellule con metanolo ghiacciato per 10 minuti.

Quindi togliere le stoviglie dal ghiaccio e aspirare il metanolo. Aggiungere tre millilitri di soluzione di cristallovioletto allo 0,5% a base di metanolo al 25% e incubare le piastre per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di cristallovioletto e sciacquare accuratamente la capsula con acqua Milli Q fino a quando non si stacca più colore durante il risciacquo.

Lasciare asciugare i piatti scoperti per una notte su un piano di lavoro. Una volta che i piatti sono asciutti, usa un righello per misurare i fuochi e conta quelli che hanno un diametro superiore a cinque millimetri. Il numero MXD tre è un fattore di trascrizione basico helix loop helix leucine zipper che è un membro atipico della famiglia MAD, ed è stato riportato che è coinvolto nella carcinogenesi rispetto al controllo negativo e al controllo positivo.

I tre piatti NIH T tre in cui MXD tre era sovraespresso avevano significativamente meno focolai. I dati sono stati raccolti da più esperimenti per determinare la significatività e le stesse tendenze sono state osservate da questo test. I risultati suggeriscono che MXD 3 non funziona come oncogene Dopo questa procedura.

Altri metodi, come il saggio di formazione del fuoco con combinazioni geniche, la crescita nella proliferazione della coclea morbida e l'analisi del ciclo cellulare, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande: valutare il ruolo di un gene di interesse nella patogenesi dell'oncogenesi.