Name: Concentrarsi Formazione: Un test cellulare per determinare il potenziale oncogeno di un gene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Scopri il Focus Formation Assay per valutare il potenziale oncogeno di un gene utilizzando cellule fibroblasti di topo NIH 3T3. Questo metodo permette di quantificare la crescita indipendente dalla densità tramite colorazione al cristallo viola.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da New Innovator Award Program del direttore NIH (ED). AA è stato sostenuto in parte da premi di laurea dal National Cancer Institute e la National Science Foundation.

1. Rendere i vettori virali Le sequenze codificanti per il gene di interesse, così come i controlli positivi e negativi, sono inseriti in pBABEpuro con metodi tradizionali di clonazione (amplificazione PCR, digestione di restrizione e legatura). Ci sono quattro siti di restrizione sul vettore in cui il DNA può essere inserito: BamHI, SnaBI, EcoRI e Sali. <ol><li> Preparare trasfezione-grade plasmide DNA dalle cellule competenti mediante il kit plasmide midi QIAGEN. </li><li> Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop2000. </li></ol> 2. Retrovirus Produzione La linea cellulare di packaging Plat-E sarà utilizzato per produrre retrovirus ecotropic che porterà il cDNA di interesse per cellule NIH 3T3. <ol><li> Stabilire Plat-E culture di cellule congelate <ol><li> Scongelare rapidamente cellule Plat-E in un bagno d&#39;acqua ° C 37 e trasferire in una provetta da 15 ml. Lentamente aggiungere 9 ml di Plat-E medio (Dudi lbecco modificato (DMEM) + 10% siero fetale bovino (FBS) + penicillina e streptomicina). </li><li> Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule con 10 ml di Plat-E a medio e trasferimento in un piatto di cultura 10 cm. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore fino a quando sono 80-90% confluenti (circa 2 giorni). </li></ol></li><li> Splitting cellulare <ol><li> Aspirare il medio e lavare le cellule una volta con PBS. </li><li> Aggiungere 2 ml di 0,05% tripsina-EDTA e incubare per 1 min a RT. </li><li> Staccare le cellule finger tapping, aggiungere 10 ml di Plat-E di media, e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml. </li><li> Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule con 10 ml di Plat-E a medio e sementi in nuovi piatti a 1: 4-1: 6 diluizioni. </li></ol></li><li> Plat-E Seeding e Transfection <ol><li> Seed 2 x 10 6cellule per 10 centimetri piatto di coltura usando Plat-E medio senza antibiotici. </li><li> Incubare le cellule O / N a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Il giorno dopo, il trasferimento di 300 ml di Opti-MEM in 1,5 ml provetta da microcentrifuga. </li><li> Aggiungere 27 ml di polyethylenimine (PEI), un costo-efficacia di trasfezione reattivo 12, al tubo preparato con Opti-MEM. Mescolare delicatamente con le dita toccando e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 9 mg di trasfezione-grade plasmide DNA nel tubo Opti-MEM / PEI, mescolare delicatamente con il vortex e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere il DNA / PEI goccia a goccia complesso nel piatto Plat-E, e incubare O / N a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Il giorno dopo, aspirare il supporto contenente il reagente di trasfezione e aggiungere 10 ml di fresco medio Plat-E (senza antibiotici). </li><li> Riportare le cellule per l&#39;incubatore. </li></ol></li></ol> 3. Cellule NIH 3T3 e infezioni <ol><li> Stabilire NIHCulture 3T3 e il seeding <ol><li> Scongelare rapidamente cellule NIH 3T3 in ° C bagnomaria 37 e trasferire in una provetta da 15 ml. Aggiungere lentamente 9 ml di NIH 3T3 medium (DMEM + 10% FBS). </li><li> Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule con 10 ml di NIH 3T3 media e il trasferimento ad un piatto di cultura 10 cm. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. È molto importante che le cellule NIH 3T3 sono sempre tenute underconfluent (50-60%), la frequenza di trasformazione spontanea (e quindi i livelli basali di formazione foci) aumenta una volta coltura raggiunga confluenza. </li><li> Seed 3 x 10 5 cellule per 10 centimetri piatto e incubare O / N per l&#39;infezione il giorno successivo. </li></ol></li><li> Infezione <ol><li> Raccogliere il supernatante retrovirale dal piatto Plat-E utilizzando una siringa monouso 10 ml, filtrare attraverso un filtro a membrana di nylon dimensioni 0,45 micron pori, e trasferirlo in un 15 mltube. </li><li> Aggiungere 10 ml di fresco medio Plat-E per le cellule (senza antibiotici), e restituirli alla incubatrice. </li><li> Aspirare il supporto dal piatto delle cellule NIH 3T3 di essere infetti, e aggiungere 5 ml di regolare medie NIH 3T3 e 5 ml di virus contenenti surnatante filtrato. </li><li> Aggiungere polibrene al piatto ad una concentrazione di 6 mg / ml. </li><li> Incubare le cellule O / N a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Il giorno dopo, ripetere i punti 3.2.1 - 3.2.5 per un secondo turno di infezione. </li><li> Sostituire il supporto contenente il virus, con regolare medio NIH 3T3. </li><li> Lasciare le cellule NIH 3T3 a crescere per 2-3 settimane, sostituendo la soluzione, se necessario. Controllare espressione della proteina di interesse mediante elettroforesi delle proteine ​​convenzionale e immunoblot su lisati cellulari interi da lastre di replica. </li></ol></li></ol> 4. Colorazione e quantificazione <ol><li> Cristallo viola colorazione <ol><li> Aspirare il mezzo di NIH 3T3 e posizionare i piattisul ghiaccio. </li><li> Lavare i piatti due volte con PBS freddo. </li><li> Fissare le cellule con metanolo ghiacciata per 10 min. </li><li> Togliere i piatti da ghiaccio, aspirare il metanolo, e aggiungere 3 ml di soluzione di cristallo viola 0,5% effettuati nel 25% di metanolo (RT). </li><li> Incubare i piatti per 5 minuti a RT. </li><li> Aspirare la soluzione a cristalli viola e risciacquare accuratamente il piatto con Milli-Q H 2 O fino a quando nessun colore si stacca nel risciacquo. </li><li> Lasciare i piatti asciugare O / N su un banco (scoperto). </li></ol></li><li> Foci Quantificazione <ol><li> Una volta che i piatti sono asciutti, utilizzare un righello per misurare le collezioni di colore scuro di cellule sulla piastra. Contano solo quelli che sono più di 5 mm di diametro come &quot;focolai&quot;. Registrare il numero di focolai e calcolare le medie e il significato rispetto ai controlli. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+assays+for+Ras+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Biological assays for Ras transformation.</a> Methods in enzymology. , 255-395 (1995).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+biology+%3A+a+laboratory+handbook%22">Cell biology : a laboratory handbook</a>. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).</li>
<li>Raptis, L., Vultur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation assays.</a> Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).</li>
<li>Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressed+pp60c-src+can+induce+focus+formation+without+complete+transformation+of+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells.</a> Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).</li>
<li>Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+biological+activity+of+human+homologs+of+the+raf%2Fmil+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22IMolecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene.</a> IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).</li>
<li>Yancopoulos, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+can+cooperate+with+ras+to+transform+normal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).</li>
<li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+activity+of+purinergic+receptor+P2Y%2C+G+protein+coupled%2C+8+revealed+by+retroviral+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening.</a> Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene. 7, 1063-1066 (2000).</li>
<li>Morgenstern, J. P., Land, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+mammalian+gene+transfer%3A+high+titre+retroviral+vectors+with+multiple+drug+selection+markers+and+a+complementary+helper-free+packaging+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line.</a> Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li>
<li>Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+5%27+and+3%27+long+terminal+repeat+promoter+function+in+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus.</a> Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).</li>
<li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+gene+transfection+by+DNA+compaction+at+pH+4.0+using+acidified%2C+long+shelf-life+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine.</a> Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).</li>
<li>Fox, E. J., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase-specific+expression+of+the+Mad3+gene+in+proliferating+and+differentiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells.</a> The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).</li>
<li>Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+Mad+family+member+Mad3+in+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation.</a> Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).</li>
<li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li>
<li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis%3A+new+insights+into+the+role+of+Mad3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li>
<li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508(2012).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La FFA fornisce un metodo semplice e veloce per valutare trasformazione maligna in vitro. E &#39;suscettibile di proiezione di un numero relativamente elevato di geni candidati, e le sue esigenze tecniche modeste rendono conveniente. Inoltre, due o più geni possono essere coexpressed (talvolta indicato come un saggio &quot;cooperazione&quot;) per valutare il potenziale cancerogeno della combinazione. I vantaggi di questo test si basano sulla sua tecnica semplice, la facilità di quantificazione e la sua relativa...

Le cellule tumorali possono essere distinti dalle loro controparti normali da una vasta gamma di alterazioni, dai modelli di espressione genica per epigenomica ai cambiamenti morfologici e proliferativi. Tra questi ultimi, ridotta dipendenza da siero, perdita di contatto (densità) inibizione, l&#39;acquisizione della proliferazione di ancoraggio-indipendente e, in ultima analisi, la capacità di formare tumori quando iniettate in animali sono utili, indicatori misurabili di trasformazione maligna 3. Diversi in vitro e in vivo sono stati sviluppati per la trasformazione cellulare. In vitro mirare a individuare e cambiamenti nella cultura morfologia (attenzione test formazione), la dinamica della cultura (il tasso di crescita, la densità di saturazione) e fattore di crescita di misura (la crescita nel siero ridotta) o ancoraggio (crescita in soft agar) esigenze. Il gold standard per determinare la natura maligna di un tipo di cellula rimane la formazione di tumori (xenotrapianti) negli animali da esperimento. Tuttavia, tl costo e la durata degli studi in vivo non sempre li rendono giustificabile in una prima fase di validazione o proiezione di oncogeni candidati. Anche se nessun test in vitro fornisce una valutazione definitiva del potenziale oncogeno di un gene, essi forniscono informazioni in potenziale oncogeno che potrebbero restringere futuro studi in vivo. Uno dei sistemi più utilizzati per valutare il potenziale oncogeno in vitro è al centro di Formazione Assay 2. Questo approccio si basa sull&#39;uso di NIH 3T3 fibroblasti di topo, una linea cellulare non trasformato che mostra forte inibizione contatto. Sovraespressione di un oncogene si traduce in perdita di crescita di densità-dipendente; cellule trasformate possono crescere in strati multipli, formando &quot;fuochi&quot;, facilmente visualizzato sullo sfondo monostrato di cellule non trasformate. La formazione fuoco Assay, poi, misura la capacità di un oncogene candidato per indurre la trasformazione maligna, come dimostra la perdita di contatto inibition come un fenotipo misurabile. L&#39;FFA è stato utilizzato per valutare la trasformazione da sovraespressione di proteine ​​chinasi (ad esempio, Src 4, BRAF 5), fattori di trascrizione (ad esempio, N-myc 6) recettori, G-accoppiati alle proteine ​​(ad esempio, P2RY8 7) e GTPases (ad esempio, , Ras 1), tra gli altri. La relativa facilità di questo saggio rende una buona scelta che fornirà una risposta rapida e visivamente chiaro se sovraespressione del gene è sufficiente per trasformare cellule di fibroblasti di topo NIH 3T3 in vitro. L&#39;FFA descritto in questo protocollo utilizza la linea cellulare di confezionamento Plat-E 8, che fornisce proteine ​​virali di imballaggio, e il vettore retrovirale pBABEpuro 9 (Addgene plasmide 1764) per la produzione di retrovirus. Dopo trasfezione con il costrutto pBABEpuro contenente il gene di interesse, la linea cellulare Plat-E produrrà retrovirus ecotropic che può essere utilizzato per infettare cellule NIH 3T3. Til suo metodo virale di consegna del gene è più efficiente rispetto ai metodi di trasfezione chimici tradizionali e offre un modo per esprimere in modo sostenibile il gene 10. Una volta inseriti nel genoma delle cellule NIH 3T3, sovraespressione del gene di interesse è guidato dalla lunghe ripetizioni terminali virali (LTR) promotore 11. Questa costante espressione può essere usato per determinare se il gene di interesse ha attività oncogenica, come misurato dalla formazione di foci, sulle cellule NIH 3T3.

<table><tbody><tr><td>vettore pBABE-puro Addgene</td><td></td><td>Plasmid 1764</td> vettore <td>di clonazione</td></tr> Linea <tr><td>cellulare di imballaggio retrovirale Platino-E, Ecotropic</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td>Linea cellulare <td>RV-101</td><td>per la produzione virale</td></tr><tr><td>Linea cellulare NIH 3T3 linea cellulare murina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93061524</td><td>per il saggio di formazione del fuoco</td></tr><tr><td>Siringa con punta BD Luer-Lok da 10 ml</td> BD <td>Biosciences</td><td>309604</td><td>reagente per la produzione virale</td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Filtro per siringa Puradisc</td><td>Whatman</td><td>6750-2504</td><td>reagente per la produzione virale</td></tr><tr><td>Polietilenimmina (PEI)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966-2</td><td>reagente per trasfezione cellulare</td></tr><tr><td>Polybrene Infezione / reagente per trasfezione di polibrene</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>reagente per trasfezione cellulare</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Fisher Scientific</td><td>C581-25</td><td>reagente per colorazione cellulare</td></tr><tr><td>Plasmid Plus Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td>Purificazione plasmidico</td></tr><tr><td>BD Falcon Piastre per colture tissutali</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>forniture per colture cellulari</td></tr><tr><td>Terreno di coltura cellulare Dulbecco's Modified Eagle (DMEM)</td><td>Terreno di coltura cellulare</td> <td>Gibco</td><td>11995-065</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>forniture per colture cellulari</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Terreno di coltura a siero ridotto</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Fetale Bovino (FBS)</td><td>Terreno di coltura cellulare</td> <td>Gibco</td><td>16000-044</td></tr></tbody></table>

concentrarsi formazione: un test cellulare per determinare il potenziale oncogeno di un gene

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

La trasformazione maligna delle cellule è tipicamente associata a un aumento della proliferazione, alla perdita dell'inibizione del contatto, all'acquisizione di un potenziale di crescita indipendente dall'ancoraggio e alla capacità di formare tumori negli animali da esperimento1. Nelle cellule NIH 3T3, la via di trasduzione del segnale Ras è nota per innescare molti di questi eventi, ciò che è noto come trasformazione Ras. L'introduzione di un gene sovraespresso nelle cellule NIH 3T3 può promuovere la trasformazione morfologica e la perdita di inibizione del contatto, che può aiutare a determinare il potenziale oncogenico di quel gene di interesse. Un test che fornisce un metodo semplice per valutare un aspetto del potenziale di trasformazione di un oncogene è il Focus Formation Assay (FFA)2. Quando le cellule NIH 3T3 si dividono normalmente in coltura, lo fanno fino a raggiungere un monostrato confluente. Tuttavia, in presenza di un oncogene sovraespresso, queste cellule possono iniziare a crescere in focolai1 densi e multistrato che possono essere visualizzati e quantificati mediante colorazione con cristallovioletto o Hema 3. In questo articolo descriviamo il protocollo FFA con trasduzione retrovirale del gene di interesse in cellule NIH 3T3 e come quantificare il numero di focolai attraverso la colorazione. La trasduzione retrovirale offre un metodo più efficiente di consegna genica rispetto alla trasfezione e l'uso di un retrovirus murino ecotropo fornisce un controllo di biosicurezza quando si lavora con potenziali oncogeni umani.

MXD3 è un fattore fondamentale cerniera elica-ansa-elica leucina (bHLHZ) di trascrizione che è un membro del MYC / MAX / network MAD. Si tratta di un atipico membro della famiglia MAD 13-15, ed è stato segnalato per essere coinvolti nella carcinogenesi 16,17. Rispetto al pBABEpuro (controllo negativo) e MYC (controllo positivo), i piatti NIH 3T3 dove era sovraespresso MXD3 era significativamente inferiore foci (Figura 1A). I dati della figura 1B sono stati raccolti...

Il saggio Formazione Focus fornisce un metodo semplice per valutare il potenziale di trasformare un oncogene candidato.

Concentrarsi Formazione: Un test cellulare per determinare il potenziale oncogeno di un gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire il saggio di formazione delle focus in linee cellulari di fibroblasti murini, utilizzando un retrovirus per determinare il potenziale oncogenico di un gene. Questo viene realizzato innanzitutto clonando la sequenza del gene di interesse in un vettore retrovirale. Il secondo passaggio consiste nella produzione di particelle retrovirali utilizzando il vettore virale e le cellule di confezionamento PLA e.Successivamente, il retrovirus viene utilizzato per infettare cellule di fibroblasti murini NIH 3T3 al fine di valutare il potenziale trasformante del gene di interesse. L'ultimo passaggio consiste nel lasciare che le cellule NIH 3T3 si dividano per due o tre settimane, seguito dalla colorazione con violetto di cristallo per quantificare il numero di focolai formati. In definitiva, il saggio di formazione di focolai è utilizzato per determinare se la sovraespressione di un gene di interesse è sufficiente a indurre una crescita indipendente dalla densità nelle cellule di fibroblasti murini.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia del cancro, ad esempio nella valutazione del potenziale

focus-formation-cell-based-assay-to-determine-oncogenic-potential

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Questo video descrive un test di formazione di colonie di agar morbido per testare gli effetti di un inibitore dell'enzima PADI e della BB-Cl-ammidina sulla tumorigenicità del cancro al seno in vitro. Questo test consente anche la valutazione quantitativa del potenziale di trasformazione cellulare nel contesto delle perturbazioni genetiche.

Saggio di formazione di colonie di agar morbido: un metodo per testare gli effetti di nuovi composti sulla proliferazione delle cellule tumorali

Questo video descrive il test di formazione delle colonie, che aiuta a determinare la capacità delle cellule tumorali del polmone di proliferare indefinitamente e formare colonie individuali. Possiamo analizzare l'effetto di un agente antitumorale sulle cellule formanti colonie analizzando i cambiamenti nel numero e/o nelle dimensioni delle colonie risultanti.

Saggio di formazione di colonie: valutazione dell'efficacia degli agenti antitumorali sulle cellule tumorali del polmone formanti colonie

Questo video descrive il protocollo per l'unità di formazione di colonie a base di metilcellulosa o saggio UFC, che aiuta a identificare e contare il numero di colonie formate da cellule leucemiche in risposta al trattamento con composti antitumorali.

Saggio CFU a base di metilcellulosa: un metodo per determinare l'effetto dei composti antitumorali sulla formazione di colonie nelle cellule leucemiche

Il raggiungimento di un livello di sistemi di comprensione dei processi cellulari è un obiettivo di biologia cellulare moderna. Descriviamo qui le strategie per multiplazione reporter luciferasi di varia funzione cellulare end-point per interrogare la funzione del gene utilizzando genoma scala librerie di RNAi.

Una piattaforma di screening Luciferase basata multiplex per interrogare il cancro-associata trasduzione del segnale in cellule in coltura

Il saggio di formazione di colonie di agar morbido è un metodo utilizzato per confermare la crescita in vitro indipendente dall'ancoraggio cellulare. L'obiettivo di questo protocollo è quello di illustrare un metodo rigoroso per la rilevazione del potenziale tumorigenico delle cellule trasformate e degli effetti soppressivi tumorali delle proteine sulle cellule trasformate.

Il saggio Formazione morbida Agar Colony

Identificare nuovi bersagli farmacologici che passano dai test preclinici agli studi sull'uomo è una priorità scientifica. A tal fine, qui descriviamo un approccio di genomica funzionale per esaminare l'impatto della deplezione genica sugli sferoidi delle linee cellulari tumorali, che modellano in modo più appropriato i tumori umani in vivo.

Utilizzando Genomica Funzionale screening per identificare gli obiettivi farmaco potenzialmente romanzo in Cancer Cell Culture Spheroid

Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per studiare la dinamica della popolazione eterologica in risposta alle perturbazioni. Questo manoscritto descrive una piattaforma basata sull'immagine che produce set di dati quantitativi per la caratterizzazione simultanea di molteplici fenotipi cellulari di popolazioni eterellulari in modo robusto.

Discriminazione e caratterizzazione delle popolazioni eterocellulari con tecniche di imaging quantitative

Qui, descriviamo i protocolli per la validazione genetica e chimica di c-Fos e Dusp1 come un obiettivo della droga nella leucemia utilizzando modelli in vitro e in vivo genetica e umanizzato del topo. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi destinazione per validazione genetica e sviluppo terapeutico.

Metodi per valutare il ruolo di c-Fos e Dusp1 nella dipendenza dell'Oncogene

Questo protocollo descrive un metodo riproducibile per l'isolamento delle cellule primarie del thabdomyosarcoma del topo, la formazione e il trattamento della tumorsfera e il trapianto di allotrapianto a partire dalle colture di cellule di tumori.

Derivazione della sfera di tumore e trattamento da cellule tumorali primarie isolate da Rhabdomyosarcomas del topo

I domini intrinsecamente disordinati sono importanti per la funzione del fattore di trascrizione di fusione oncogenica. Per indirizzare terapeuticamente queste proteine, è necessaria una comprensione più dettagliata dei meccanismi di regolazione impiegati da questi domini. Qui, usiamo la trascrittomica per mappare importanti caratteristiche strutturali del dominio EWS intrinsecamente disordinato nel sarcoma di Ewing.

Mappatura delle relazioni struttura-funzione dei fattori di trascrizione oncogenica disordinati utilizzando l'analisi trascrittomica

Questo protocollo sperimentale fornisce un metodo stabile, economico ed efficiente che combina il knockdown dell'inncRNA con saggi formatori di colonie per quantificare l'effetto dell'inncRNA sulla proliferazione cellulare dell'osteosarcoma.

Test di formazione di colonie che rileva la capacità proliferativa delle cellule osteosarcoma knockdown di RNA LncRNA

Scopri il Focus Formation Assay per valutare il potenziale oncogeno di un gene utilizzando cellule fibroblasti di topo NIH 3T3. Questo metodo permette di quantificare la crescita indipendente dalla densità tramite colorazione al cristallo viola.

Concentrarsi Formazione: Un test cellulare per determinare il potenziale oncogeno di un gene

Esplora altri video