Name: Concentrarsi Formazione: Un test cellulare per determinare il potenziale oncogeno di un gene (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Scopri il Focus Formation Assay per valutare il potenziale oncogeno di un gene utilizzando cellule fibroblasti di topo NIH 3T3. Questo metodo permette di quantificare la crescita indipendente dalla densità tramite colorazione al cristallo viola.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da New Innovator Award Program del direttore NIH (ED). AA è stato sostenuto in parte da premi di laurea dal National Cancer Institute e la National Science Foundation.

1. Rendere i vettori virali Le sequenze codificanti per il gene di interesse, così come i controlli positivi e negativi, sono inseriti in pBABEpuro con metodi tradizionali di clonazione (amplificazione PCR, digestione di restrizione e legatura). Ci sono quattro siti di restrizione sul vettore in cui il DNA può essere inserito: BamHI, SnaBI, EcoRI e Sali. <ol><li> Preparare trasfezione-grade plasmide DNA dalle cellule competenti mediante il kit plasmide midi QIAGEN. </li><li> Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop2000. </li></ol> 2. Retrovirus Produzione La linea cellulare di packaging Plat-E sarà utilizzato per produrre retrovirus ecotropic che porterà il cDNA di interesse per cellule NIH 3T3. <ol><li> Stabilire Plat-E culture di cellule congelate <ol><li> Scongelare rapidamente cellule Plat-E in un bagno d&#39;acqua ° C 37 e trasferire in una provetta da 15 ml. Lentamente aggiungere 9 ml di Plat-E medio (Dudi lbecco modificato (DMEM) + 10% siero fetale bovino (FBS) + penicillina e streptomicina). </li><li> Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule con 10 ml di Plat-E a medio e trasferimento in un piatto di cultura 10 cm. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore fino a quando sono 80-90% confluenti (circa 2 giorni). </li></ol></li><li> Splitting cellulare <ol><li> Aspirare il medio e lavare le cellule una volta con PBS. </li><li> Aggiungere 2 ml di 0,05% tripsina-EDTA e incubare per 1 min a RT. </li><li> Staccare le cellule finger tapping, aggiungere 10 ml di Plat-E di media, e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml. </li><li> Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule con 10 ml di Plat-E a medio e sementi in nuovi piatti a 1: 4-1: 6 diluizioni. </li></ol></li><li> Plat-E Seeding e Transfection <ol><li> Seed 2 x 10 6cellule per 10 centimetri piatto di coltura usando Plat-E medio senza antibiotici. </li><li> Incubare le cellule O / N a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Il giorno dopo, il trasferimento di 300 ml di Opti-MEM in 1,5 ml provetta da microcentrifuga. </li><li> Aggiungere 27 ml di polyethylenimine (PEI), un costo-efficacia di trasfezione reattivo 12, al tubo preparato con Opti-MEM. Mescolare delicatamente con le dita toccando e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 9 mg di trasfezione-grade plasmide DNA nel tubo Opti-MEM / PEI, mescolare delicatamente con il vortex e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere il DNA / PEI goccia a goccia complesso nel piatto Plat-E, e incubare O / N a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Il giorno dopo, aspirare il supporto contenente il reagente di trasfezione e aggiungere 10 ml di fresco medio Plat-E (senza antibiotici). </li><li> Riportare le cellule per l&#39;incubatore. </li></ol></li></ol> 3. Cellule NIH 3T3 e infezioni <ol><li> Stabilire NIHCulture 3T3 e il seeding <ol><li> Scongelare rapidamente cellule NIH 3T3 in ° C bagnomaria 37 e trasferire in una provetta da 15 ml. Aggiungere lentamente 9 ml di NIH 3T3 medium (DMEM + 10% FBS). </li><li> Centrifugare la provetta a 180 x g per 5 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule con 10 ml di NIH 3T3 media e il trasferimento ad un piatto di cultura 10 cm. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. È molto importante che le cellule NIH 3T3 sono sempre tenute underconfluent (50-60%), la frequenza di trasformazione spontanea (e quindi i livelli basali di formazione foci) aumenta una volta coltura raggiunga confluenza. </li><li> Seed 3 x 10 5 cellule per 10 centimetri piatto e incubare O / N per l&#39;infezione il giorno successivo. </li></ol></li><li> Infezione <ol><li> Raccogliere il supernatante retrovirale dal piatto Plat-E utilizzando una siringa monouso 10 ml, filtrare attraverso un filtro a membrana di nylon dimensioni 0,45 micron pori, e trasferirlo in un 15 mltube. </li><li> Aggiungere 10 ml di fresco medio Plat-E per le cellule (senza antibiotici), e restituirli alla incubatrice. </li><li> Aspirare il supporto dal piatto delle cellule NIH 3T3 di essere infetti, e aggiungere 5 ml di regolare medie NIH 3T3 e 5 ml di virus contenenti surnatante filtrato. </li><li> Aggiungere polibrene al piatto ad una concentrazione di 6 mg / ml. </li><li> Incubare le cellule O / N a 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Il giorno dopo, ripetere i punti 3.2.1 - 3.2.5 per un secondo turno di infezione. </li><li> Sostituire il supporto contenente il virus, con regolare medio NIH 3T3. </li><li> Lasciare le cellule NIH 3T3 a crescere per 2-3 settimane, sostituendo la soluzione, se necessario. Controllare espressione della proteina di interesse mediante elettroforesi delle proteine ​​convenzionale e immunoblot su lisati cellulari interi da lastre di replica. </li></ol></li></ol> 4. Colorazione e quantificazione <ol><li> Cristallo viola colorazione <ol><li> Aspirare il mezzo di NIH 3T3 e posizionare i piattisul ghiaccio. </li><li> Lavare i piatti due volte con PBS freddo. </li><li> Fissare le cellule con metanolo ghiacciata per 10 min. </li><li> Togliere i piatti da ghiaccio, aspirare il metanolo, e aggiungere 3 ml di soluzione di cristallo viola 0,5% effettuati nel 25% di metanolo (RT). </li><li> Incubare i piatti per 5 minuti a RT. </li><li> Aspirare la soluzione a cristalli viola e risciacquare accuratamente il piatto con Milli-Q H 2 O fino a quando nessun colore si stacca nel risciacquo. </li><li> Lasciare i piatti asciugare O / N su un banco (scoperto). </li></ol></li><li> Foci Quantificazione <ol><li> Una volta che i piatti sono asciutti, utilizzare un righello per misurare le collezioni di colore scuro di cellule sulla piastra. Contano solo quelli che sono più di 5 mm di diametro come &quot;focolai&quot;. Registrare il numero di focolai e calcolare le medie e il significato rispetto ai controlli. </li></ol></li></ol>

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<li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508(2012).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La FFA fornisce un metodo semplice e veloce per valutare trasformazione maligna in vitro. E &#39;suscettibile di proiezione di un numero relativamente elevato di geni candidati, e le sue esigenze tecniche modeste rendono conveniente. Inoltre, due o più geni possono essere coexpressed (talvolta indicato come un saggio &quot;cooperazione&quot;) per valutare il potenziale cancerogeno della combinazione. I vantaggi di questo test si basano sulla sua tecnica semplice, la facilità di quantificazione e la sua relativa...

Le cellule tumorali possono essere distinti dalle loro controparti normali da una vasta gamma di alterazioni, dai modelli di espressione genica per epigenomica ai cambiamenti morfologici e proliferativi. Tra questi ultimi, ridotta dipendenza da siero, perdita di contatto (densità) inibizione, l&#39;acquisizione della proliferazione di ancoraggio-indipendente e, in ultima analisi, la capacità di formare tumori quando iniettate in animali sono utili, indicatori misurabili di trasformazione maligna 3. Diversi in vitro e in vivo sono stati sviluppati per la trasformazione cellulare. In vitro mirare a individuare e cambiamenti nella cultura morfologia (attenzione test formazione), la dinamica della cultura (il tasso di crescita, la densità di saturazione) e fattore di crescita di misura (la crescita nel siero ridotta) o ancoraggio (crescita in soft agar) esigenze. Il gold standard per determinare la natura maligna di un tipo di cellula rimane la formazione di tumori (xenotrapianti) negli animali da esperimento. Tuttavia, tl costo e la durata degli studi in vivo non sempre li rendono giustificabile in una prima fase di validazione o proiezione di oncogeni candidati. Anche se nessun test in vitro fornisce una valutazione definitiva del potenziale oncogeno di un gene, essi forniscono informazioni in potenziale oncogeno che potrebbero restringere futuro studi in vivo. Uno dei sistemi più utilizzati per valutare il potenziale oncogeno in vitro è al centro di Formazione Assay 2. Questo approccio si basa sull&#39;uso di NIH 3T3 fibroblasti di topo, una linea cellulare non trasformato che mostra forte inibizione contatto. Sovraespressione di un oncogene si traduce in perdita di crescita di densità-dipendente; cellule trasformate possono crescere in strati multipli, formando &quot;fuochi&quot;, facilmente visualizzato sullo sfondo monostrato di cellule non trasformate. La formazione fuoco Assay, poi, misura la capacità di un oncogene candidato per indurre la trasformazione maligna, come dimostra la perdita di contatto inibition come un fenotipo misurabile. L&#39;FFA è stato utilizzato per valutare la trasformazione da sovraespressione di proteine ​​chinasi (ad esempio, Src 4, BRAF 5), fattori di trascrizione (ad esempio, N-myc 6) recettori, G-accoppiati alle proteine ​​(ad esempio, P2RY8 7) e GTPases (ad esempio, , Ras 1), tra gli altri. La relativa facilità di questo saggio rende una buona scelta che fornirà una risposta rapida e visivamente chiaro se sovraespressione del gene è sufficiente per trasformare cellule di fibroblasti di topo NIH 3T3 in vitro. L&#39;FFA descritto in questo protocollo utilizza la linea cellulare di confezionamento Plat-E 8, che fornisce proteine ​​virali di imballaggio, e il vettore retrovirale pBABEpuro 9 (Addgene plasmide 1764) per la produzione di retrovirus. Dopo trasfezione con il costrutto pBABEpuro contenente il gene di interesse, la linea cellulare Plat-E produrrà retrovirus ecotropic che può essere utilizzato per infettare cellule NIH 3T3. Til suo metodo virale di consegna del gene è più efficiente rispetto ai metodi di trasfezione chimici tradizionali e offre un modo per esprimere in modo sostenibile il gene 10. Una volta inseriti nel genoma delle cellule NIH 3T3, sovraespressione del gene di interesse è guidato dalla lunghe ripetizioni terminali virali (LTR) promotore 11. Questa costante espressione può essere usato per determinare se il gene di interesse ha attività oncogenica, come misurato dalla formazione di foci, sulle cellule NIH 3T3.

<table><tbody><tr><td>vettore pBABE-puro Addgene</td><td></td><td>Plasmid 1764</td> vettore <td>di clonazione</td></tr> Linea <tr><td>cellulare di imballaggio retrovirale Platino-E, Ecotropic</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td>Linea cellulare <td>RV-101</td><td>per la produzione virale</td></tr><tr><td>Linea cellulare NIH 3T3 linea cellulare murina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93061524</td><td>per il saggio di formazione del fuoco</td></tr><tr><td>Siringa con punta BD Luer-Lok da 10 ml</td> BD <td>Biosciences</td><td>309604</td><td>reagente per la produzione virale</td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Filtro per siringa Puradisc</td><td>Whatman</td><td>6750-2504</td><td>reagente per la produzione virale</td></tr><tr><td>Polietilenimmina (PEI)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966-2</td><td>reagente per trasfezione cellulare</td></tr><tr><td>Polybrene Infezione / reagente per trasfezione di polibrene</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>reagente per trasfezione cellulare</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Fisher Scientific</td><td>C581-25</td><td>reagente per colorazione cellulare</td></tr><tr><td>Plasmid Plus Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td>Purificazione plasmidico</td></tr><tr><td>BD Falcon Piastre per colture tissutali</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>forniture per colture cellulari</td></tr><tr><td>Terreno di coltura cellulare Dulbecco's Modified Eagle (DMEM)</td><td>Terreno di coltura cellulare</td> <td>Gibco</td><td>11995-065</td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>forniture per colture cellulari</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Terreno di coltura a siero ridotto</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>Terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Fetale Bovino (FBS)</td><td>Terreno di coltura cellulare</td> <td>Gibco</td><td>16000-044</td></tr></tbody></table>

concentrarsi formazione: un test cellulare per determinare il potenziale oncogeno di un gene

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

La trasformazione maligna delle cellule è tipicamente associata a un aumento della proliferazione, alla perdita dell'inibizione del contatto, all'acquisizione di un potenziale di crescita indipendente dall'ancoraggio e alla capacità di formare tumori negli animali da esperimento1. Nelle cellule NIH 3T3, la via di trasduzione del segnale Ras è nota per innescare molti di questi eventi, ciò che è noto come trasformazione Ras. L'introduzione di un gene sovraespresso nelle cellule NIH 3T3 può promuovere la trasformazione morfologica e la perdita di inibizione del contatto, che può aiutare a determinare il potenziale oncogenico di quel gene di interesse. Un test che fornisce un metodo semplice per valutare un aspetto del potenziale di trasformazione di un oncogene è il Focus Formation Assay (FFA)2. Quando le cellule NIH 3T3 si dividono normalmente in coltura, lo fanno fino a raggiungere un monostrato confluente. Tuttavia, in presenza di un oncogene sovraespresso, queste cellule possono iniziare a crescere in focolai1 densi e multistrato che possono essere visualizzati e quantificati mediante colorazione con cristallovioletto o Hema 3. In questo articolo descriviamo il protocollo FFA con trasduzione retrovirale del gene di interesse in cellule NIH 3T3 e come quantificare il numero di focolai attraverso la colorazione. La trasduzione retrovirale offre un metodo più efficiente di consegna genica rispetto alla trasfezione e l'uso di un retrovirus murino ecotropo fornisce un controllo di biosicurezza quando si lavora con potenziali oncogeni umani.

MXD3 è un fattore fondamentale cerniera elica-ansa-elica leucina (bHLHZ) di trascrizione che è un membro del MYC / MAX / network MAD. Si tratta di un atipico membro della famiglia MAD 13-15, ed è stato segnalato per essere coinvolti nella carcinogenesi 16,17. Rispetto al pBABEpuro (controllo negativo) e MYC (controllo positivo), i piatti NIH 3T3 dove era sovraespresso MXD3 era significativamente inferiore foci (Figura 1A). I dati della figura 1B sono stati raccolti...

Il saggio Formazione Focus fornisce un metodo semplice per valutare il potenziale di trasformare un oncogene candidato.

Concentrarsi Formazione: Un test cellulare per determinare il potenziale oncogeno di un gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire il saggio di formazione delle focus in linee cellulari di fibroblasti murini, utilizzando un retrovirus per determinare il potenziale oncogenico di un gene. Questo viene realizzato innanzitutto clonando la sequenza del gene di interesse in un vettore retrovirale. Il secondo passaggio consiste nella produzione di particelle retrovirali utilizzando il vettore virale e le cellule di confezionamento PLA e.Successivamente, il retrovirus viene utilizzato per infettare cellule di fibroblasti murini NIH 3T3 al fine di valutare il potenziale trasformante del gene di interesse. L'ultimo passaggio consiste nel lasciare che le cellule NIH 3T3 si dividano per due o tre settimane, seguito dalla colorazione con violetto di cristallo per quantificare il numero di focolai formati. In definitiva, il saggio di formazione di focolai è utilizzato per determinare se la sovraespressione di un gene di interesse è sufficiente a indurre una crescita indipendente dalla densità nelle cellule di fibroblasti murini.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia del cancro, ad esempio nella valutazione del potenziale oncogenico di un gene. Per iniziare, preparare il vettore virale come descritto nel protocollo testuale. Successivamente, stabilire colture di cellule plat E a partire da cellule congelate scongelando rapidamente le cellule plat E in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, quindi trasferendole in un tubo conico da 15 millilitri.Aggiungere lentamente nove millilitri di mezzo PLA E in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare il tubo a 180 × g per cinque minuti e scartare il soprannatante. Risospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo plat E e trasferirle in una piastra da coltura da 10 centimetri.Quindi incubare le cellule in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5% di CO2 fino a quando non raggiungono una confluenza compresa tra l'80 e il 90%. Eseguire il passaggio delle cellule aspirando prima il mezzo, quindi lavare le cellule una volta con PBS prima di aggiungere due millilitri di tripsina 0,05% EDTA e incubare per un minuto a temperatura ambiente, staccando le cellule con leggeri colpetti con le dita. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di mezzo plat E e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri.Centrifugare il tubo come in precedenza e risospendere le cellule con 10 millilitri di mezzo plat E. Successivamente, seminare 2 milioni di cellule per piastra da coltura da 10 centimetri utilizzando mezzo plat E senza alcun antibiotico e lasciare le cellule incubare durante la notte. Il giorno seguente, trasferire 300 microlitri di ottimum in un microtubo da 1,5 millilitro.Aggiungere 27 microlitri di polietileneammina al tubo preparato con Optum. Mescolare delicatamente battendo con le dita e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere nove microgrammi di DNA plasmidico di qualità per trasfezione nel tubo, mescolare delicatamente mediante vortex e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.Quindi aggiungere la miscela goccia a goccia nella piastra E prima di incubare durante la notte. Il giorno successivo, aspirare il mezzo contenente il reagente di trasfezione e aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco per piastra E, quindi reinserire le cellule nell'incubatore per stabilire colture di NIH 3T3. Per prima cosa, scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e trasferirle in un tubo da 15 millilitri.Aggiungere lentamente nove millilitri di mezzo NIH tre, T tre alle cellule, centrifugare il tubo a 180 × g per cinque minuti e scartare il soprannatante. Successivamente, risospendere le cellule in 10 millilitri di mezzo NIH tre, T tre e trasferirle in una piastra da coltura da 10 centimetri. Incubare le cellule in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con 5% CO2, mantenendole al di sotto della confluenza poiché la frequenza di trasformazione spontanea aumenta.Una volta che una coltura raggiunge la co-fluenza, dopo aver seminato tre volte 10 alla quinta cellule NIH/3T3 per piastra da 10 centimetri, incubare durante la notte per l'infezione il giorno successivo. Il giorno seguente, raccogliere il sopranatante retrovirale dalla piastra E utilizzando una siringa monouso da 10 millilitri, filtrarlo attraverso un filtro in membrana di nylon con porosità di 0,45 micron e trasferirlo in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere 10 millilitri di mezzo fresco per la piastra E alle cellule prima di reinserirle nell'incubatore.Quindi aspirare il mezzo dal piatto di cellule NIH 3T3 da infettare e aggiungere cinque millilitri di mezzo NI H 3T3 normale e cinque millilitri di supernatante filtrato contenente il virus. Successivamente, aggiungere polibrene al piatto, alla concentrazione di sei microgrammi per millilitro.Incubare le cellule durante la notte prima di ripetere i passaggi di infezione per un secondo ciclo di infezione. Dopo l'infezione, sostituire il mezzo contenente il virus con il normale mezzo IH three T three. Lasciare crescere le cellule IH three T three per due o tre giorni, sostituendo il mezzo secondo necessità per la colorazione con violetto di cristallo.Aspirare il mezzo NIH three T three e mettere le piastre sul ghiaccio. Lavare le piastre due volte con PBS freddo di ghiaccio. Fissare le cellule con metanolo freddo di ghiaccio per 10 minuti.Quindi rimuovere le piastre dal ghiaccio ed aspirare il metanolo. Aggiungere tre millilitri di soluzione di violetto cristallo allo 0,5% preparata in metanolo al 25% e incubare le piastre per cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione di violetto cristallo e risciacquare accuratamente la piastra con acqua Milli Q fino a quando nel risciacquo non si stacca più colore.Lasciare asciugare le piastre scoperte durante la notte su un banco di lavoro. Una volta che le piastre sono asciutte, utilizzare un righello per misurare le colonie e contare quelle con un diametro superiore ai cinque millimetri. Il numero MXD3 è un fattore di trascrizione appartenente alla famiglia basic helix-loop-helix leucine zipper, che rappresenta un membro atipico della famiglia MAD ed è stato riportato come coinvolto nella carcinogenesi in confronto al controllo negativo e al controllo positivo.Le piastre NIH 3T3 in cui MXD3 era sovraespresso presentavano significativamente meno foci. I dati sono stati raccolti da più esperimenti per determinare la significatività, e le stesse tendenze sono state osservate in questo saggio. I risultati suggeriscono che MXD3 non funziona come oncogene seguendo questa procedura.Altri metodi, come il saggio di formazione di focolai con combinazioni di geni, la proliferazione in agar morbido e l'analisi del ciclo cellulare, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive al fine di valutare il ruolo di un gene di interesse nella patogenesi dell'oncogenesi.

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