Appartamento Monte Imaging di pelle di topo e la sua applicazione alla analisi del follicolo pilifero patterning e sensoriale Axon Morfologia

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare interamente strutture cutanee come i follicoli piliferi e le terminazioni nervose, senza sezionare fisicamente il campione. Questo risultato si ottiene innanzitutto raccogliendo la pelle da diverse regioni del corpo, tra cui la pianta posteriore della zampa e la coda. Il secondo passaggio consiste nell'appiattire e pulire i campioni di pelle.

In seguito, i campioni di pelle vengono sottoposti a una fissazione adeguata. L'ultimo passaggio consiste nell'eseguire una colorazione immunoistochimica o una istochimica sui campioni di pelle. Infine, l'analisi mediante microscopio stereoscopico o confocale viene utilizzata per visualizzare la geometria delle diverse strutture cutanee.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la preparazione di montaggi ormonali epidermici, è che può essere applicata alla cute in qualsiasi sede del corpo e non richiede la separazione dell'epidermide dal derma. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nello studio della polarità cellulare plantare. Poiché la geometria bidimensionale della cute e la particolare disposizione dei follicoli piliferi rendono la pelle un sistema ideale per studiare questo processo, questa tecnica non solo può fornire informazioni sulla polarità cellulare plantare, ma può anche essere utilizzata per esaminare altri aspetti dello sviluppo cutaneo, come la definizione dei tipi di neuroni somatosensoriali basata sulla visualizzazione diretta delle singole strutture nelle morfologie superiori.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la dissezione della pelle da alcune regioni, come i piedi e la coda, è difficile da apprendere; è importante stendere perfettamente i campioni evitando grinze e stiramenti eccessivi. In questa dimostrazione, la pelle dorsale verrà prelevata da tre topi sacrificati mediante isoflurano. Mediante inalazione, si utilizzano lame per effettuare un taglio orizzontale alla base della coda lungo ciascun fianco, proseguendo sul lato dorsale alla base di ogni arto, lateralmente rispetto alle orecchie, fino a terminare al naso.

Staccare delicatamente la pelle dal tessuto sottostante procedendo da posteriore ad anteriore, tenendo la pelle tra le dita guantate in modo da non schiacciarla con la pinza. Quando si stacca la pelle a livello delle orecchie, tagliare prima le orecchie con un paio di forbici e procedere con particolare lentezza poiché in questa zona la pelle può strapparsi. Da questo momento in poi, posizionare la pelle con la faccia interna rivolta verso l'alto.

Fissare la pelle alla S Guard con circa 20 spilli da insetto disposti uniformemente lungo la periferia. Non stirare eccessivamente la pelle. Coprire la pelle con 10-20 millilitri di PBS utilizzando pinze angolate o curve.

Rimuovere il grasso e il tessuto connettivo associati alla pelle. Orientare l'estremità appuntita della pinzetta in senso orizzontale per minimizzare il rischio che la pinzetta penetri nella pelle. Espellere eventuali bolle d'aria intrappolate sotto la pelle arrotolando delicatamente un applicatore di cotone sulla superficie cutanea.

Il passo successivo consiste nel fissare la pelle del pinna. Se la pelle verrà utilizzata per l'imaging della melanina o per l'istochimica della fosfatasi alcalina, aggiungere 20 millilitri per ogni piastra da 10 centimetri di PFA al 4% appena preparato in PBS o formalina tamponata al 10%. Se la pelle verrà utilizzata per immunostaining o per visualizzare una cheratina transgenica, KRT 17 GFP, aggiungere 20 millilitri per ogni piastra da 10 centimetri di PFA al 2% appena preparato in PBS; agitare delicatamente tutta la notte in una stanza fredda e, il giorno seguente, lavare in PBS per più di 10 minuti.

La procedura di istochimica della fosfatasi alcalina non verrà dimostrata in questo video. Per l'immagine della melanina, disidratare la pelle attraverso una serie di etanolo a concentrazione crescente per un giorno per ogni passaggio, con rotazione orizzontale delicata a temperatura ambiente. Tre giorni dopo, rimuovere i tessuti connettivi residui dalla pelle disidratata mantenendo la pelle in etanolo al 100%.

Rimuovere i perni per insetti e trasferire la pelle in una capsula di vetro da 10 centimetri di diametro. Per il successo di questa procedura, il campione di pelle deve essere raccolto come un pezzo integro e appiattito perfettamente. Posizionare due vetrini di vetro sulla pelle per appiattirla e impedire che si arricci.

Aggiungere 20 millilitri di benzoato di benzile e alcol benzilico o BBBA, che indurirà rapidamente il tessuto nelle successive ore. Sollevare le lamelle dalla pelle per alcuni secondi per permettere al BBBA di scorrere sulla superficie cutanea. La pelle dei piedi, utilizzata per l'analisi del patterning dei follicoli piliferi, viene tipicamente dissezionata da P1 a P8 negli animali. Dopo l'eutanasia, rimuovere i piedi al di sopra dell'articolazione della caviglia ed effettuare un singolo taglio dritto lungo la superficie ventrale attraverso le piante dei piedi.

Staccare delicatamente la pelle dal tessuto sottostante procedendo da prossimale a distale. Tagliare le dita per rimuovere la pelle e fissarla su un supporto con la superficie interna rivolta verso l'alto. Il piede presenta un quantitativo minimo di tessuto connettivo.

Pelle transgenica. La pelle KRT17 GFP è ora pronta per l'acquisizione di immagini per l'analisi della melanina. Fissare ed elaborare la pelle come dimostrato in precedenza per la pelle dorsale. Dopo l'eutanasia dell'animale a P21, rimuovere i peli strofinando con un depilatorio.

Applicare il gel sulla superficie della pelle con un dito guantato e attendere 10 minuti. Lavare la superficie della pelle con acqua corrente. Successivamente dissezionare e fissare la pelle del piede al supporto S come mostrato in precedenza.

Fissare con P-F-A-P-B-S al 1% per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare in PBS. Per preparare la pelle della coda, effettuare un taglio circolare attorno alla base della coda e poi un'incisione longitudinale che percorra tutta la lunghezza della coda lungo la sua faccia ventrale. Rimuovere la pelle della coda a partire dalla punta, afferrando saldamente la punta dell'osso della coda o del tessuto connettivo con una pinzetta e la pelle con una seconda pinzetta.

Fissare la pelle della coda sulla guardia in SIL per l'analisi della distribuzione della melanina e dell'orientamento dei follicoli piliferi. Fissare ed elaborare la pelle come dimostrato per la pelle dorsale per l'analisi delle ghiandole sebacee prima della fissazione. Tagliare la pelle della coda in una serie di segmenti di circa 0,5-1 centimetro di lunghezza e incubare i pezzi di pelle in PBS con EDTA 5 mM durante la notte a 37 °C.

Per indebolire l'adesione tra derma ed epidermide il giorno successivo, staccare delicatamente l'epidermide dal derma. Fissare l'epidermide con l'interfaccia rivolta verso l'alto su S guard in P-F-A-P-B-S al 4% per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente lavare l'epidermide con PBS e colorare con rosso olio O come descritto nel testo del protocollo.

Un microscopio stereoscopico viene utilizzato per acquisire immagini di pelli di dorso del piede o di coda immerse in BBBA, appiattite sotto la lametta di vetro e ancora contenute nel recipiente di vetro. Questo approccio minimizza la contaminazione del microscopio da parte del BBBA. Illuminare il recipiente dal basso per ridurre al minimo le variazioni spaziali dell'intensità luminosa all'interno del campo visivo.

Sollevare la piastra di vetro a un'altezza di circa 10 centimetri rispetto alla superficie di lavoro standard del microscopio stereoscopico e posizionare una piastra diffondente in plastica o vetro sulla sorgente luminosa. Al termine dell'acquisizione delle immagini, riporre la pelle in etanolo al 100% per la conservazione a lungo termine a meno 20 gradi Celsius. Per preparare la pelle colorata per la fosfatasi alcalina all'acquisizione delle immagini, posizionarla tra due piastre di vetro dello stesso tipo utilizzato per i gel proteici di piccole dimensioni.

Avendo cura di evitare la formazione di bolle d'aria tra le piastre e la pelle. Rimuovere delicatamente con un tovagliolo di carta qualsiasi eccesso di BBBA. Posizionare questo sandwich composto da piastra-pelle-piastra su un palco del microscopio.

Utilizzare un'illuminazione in campo chiaro o in contrasto di interferenza differenziale (DIC) con un obiettivo 10x e passi Z di due micrometri o cinque micrometri. Utilizzare un palchetto meccanizzato XY per acquisire un mosaico di immagini XY che vengono unite insieme per creare un singolo dataset tridimensionale in scala di grigi. Eseguire il tracciamento semi-automatico degli alberi assonali mediante uno qualsiasi tra diversi pacchetti software disponibili.

L'immagine in campo chiaro di preparati cutanei piatti può essere utilizzata per visualizzare un singolo arbore sensoriale cutaneo, mostrato qui insieme alla sua traccia. L'immagine in campo chiaro consente inoltre la visualizzazione dei modelli dei follicoli piliferi in base alla pigmentazione da melanina. Queste immagini mostrano la cute del P uno di topi wild type e di topi knockout per frizzled sei, e la cute del P sette di topi knockout per frizzled sei.

L'analisi mediante microscopia ottica di preparati cutanei in toto può essere utilizzata per definire la geometria delle ghiandole sebacee e delle code. La cute visualizzata con rosso d'olio mostra ghiandole sebacee disorganizzate in un topo knock-out per frizzled six rispetto a un piede dorsale di tipo selvatico. La cute prelevata da topi di tipo selvatico e da topi knock-out per frizzled six, portatori di una cheratina GFP-etichettata KRT17 GFP e colorata con rosso d'olio.

Red O ha rivelato che la pelle knock-out presenta una spirale pilifera al centro. L'immagine confocale di preparati piatti della pelle può inoltre definire la geometria dei follicoli piliferi visualizzati mediante GFP KRT17 e colorazione immunoistochimica anti-GFP e del muscolo erettore del pelo. I muscoli oculari sono visualizzati mediante colorazione immunoistochimica anti-actina del muscolo liscio.

I gruppi di cellule di Merkel sono visualizzati con anticorpi anti-citocheratina otto o con l'assorbimento del colorante am 1 43, mentre il follicolo pilifero centrale è visualizzato con KRT 17 GFP. Invece di essere aperti verso l'anteriore, i gruppi di cellule di Merkel nel topo knockout per Frizzled sei formano un cerchio chiuso. Una volta acquisita padronanza, un'analisi può essere eseguita in circa 30 minuti se effettuata correttamente, e diverse preparazioni possono essere realizzate nell'arco di pochi giorni fino a una settimana. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come raccogliere la pelle da diverse regioni del corpo e di come prepararle per visualizzare diverse strutture cutanee nel formato ormonale. Immagini ad alta risoluzione e a tutto spessore delle strutture cutanee possono essere ottenute mediante microscopia ottica standard e microscopia confocale.

Non dimenticare che lavorare con paraformaldeide e BBBA può essere estremamente pericoloso. L'inalazione dei vapori deve essere ridotta al minimo mantenendo queste soluzioni in contenitori chiusi ed è necessario evitare il contatto con la pelle. Non permettere al BBBA di entrare in contatto con la plastica.