Appartamento Monte Imaging di pelle di topo e la sua applicazione alla analisi del follicolo pilifero patterning e sensoriale Axon Morfologia

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare le strutture della pelle come i follicoli piliferi e le terminazioni nervose nella loro interezza senza sezionare fisicamente il campione. Ciò si ottiene raccogliendo prima la pelle da varie regioni del corpo, tra cui la parte posteriore, la zampa posteriore e la coda. Il secondo passo consiste nell'appiattire e pulire i campioni di pelle.

Successivamente, i campioni di pelle vengono sottoposti a fissazione adeguata. Il passaggio finale consiste nell'eseguire la colorazione immunoscopica o l'istochimica sui campioni di pelle. In definitiva, l'imaging con un microscopio da dissezione o confocale viene utilizzato per visualizzare la geometria di varie strutture cutanee.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la preparazione del montaggio ormonale epidermico, è che può essere applicata sulla pelle in qualsiasi punto del corpo e non richiede la separazione dell'epidermide dal derma. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello studio della polarità delle cellule plantari. Poiché la geometria bidimensionale della pelle e la strana disposizione dei follicoli piliferi rendono la pelle il sistema ideale per studiare questo processo, non solo questo metodo può fornire informazioni sulla polarità delle cellule vegetali, ma può anche essere applicato per studiare altri aspetti dello sviluppo della pelle, come la definizione dei tipi di neuroni somatosensoriali basata sulla visualizzazione diretta degli atti individuali sulle morfologie superiori.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la dissezione della pelle da alcune regioni come i piedi e la coda è difficile da imparare, appiattirli perfettamente ed evitare rughe e allungamento eccessivo sono importanti. In questa dimostrazione, la pelle dorsale sarà raccolta da topi P 3 soppressi mediante fluoro. Inalazione utilizzare lame per effettuare un taglio orizzontale dalla base della coda lungo ciascun fianco, passando sul lato dorsale della base di ciascun arto procedendo lateralmente alle orecchie e terminando al naso.

Sbucciare delicatamente la pelle dal tessuto sottostante procedendo da posteriore a anteriore tenendo la pelle tra le dita guantate in modo che non venga pizzicata dal forcipe. Quando si sbuccia prima la pelle a livello delle orecchie, tagliare le orecchie con un paio di forbici e procedere particolarmente lentamente poiché la pelle può strapparsi in questo punto. Da questo punto in poi, orientare la pelle con l'interno rivolto verso l'alto.

Appuntare la pelle a S Guard con circa 20 spilli per insetti uniformemente distanziati attorno alla periferia. Non distendere eccessivamente la pelle. Coprire la pelle con 10-20 millilitri di PBS utilizzando una pinza angolata o curva.

Sezionare il grasso associato alla pelle e il tessuto connettivo. Rivolgere orizzontalmente l'estremità appuntita della pinza per ridurre al minimo il rischio che la pinza penetri nella pelle. Estrudere le bolle d'aria che sono rimaste intrappolate sotto la pelle facendo rotolare delicatamente un applicatore con punta di cotone sulla superficie della pelle.

Il prossimo passo è riparare la pelle del perno. Se la pelle verrà utilizzata per l'imaging della melanina o per l'istochimica della fosfatasi alcalina, aggiungere 20 millilitri per piastra di sigari da 10 centimetri di 4% P-F-A-P-B-S appena preparato o 10% di formina tamponata. Se la pelle verrà utilizzata per l'immunocolorazione o la visualizzazione di una cheratina transgenica, KRT 17 GFP aggiungere 20 millilitri per 10 centimetri di piastra sogar di 2%P-F-A-P-B-S appena preparata, ruotare delicatamente per una notte in una stanza fredda il giorno successivo, lavare in PBS per più di 10 minuti.

La procedura per l'istochimica della fosfatasi alcalina non sarà dimostrata in questo video. Per l'imaging della melanina, disidratare la pelle attraverso una serie di etanolo graduato un giorno per ogni passaggio con una leggera rotazione orizzontale a temperatura ambiente. Tre giorni dopo, rimuovere i tessuti connettivi residui dalla pelle disidratata con la pelle in etanolo al 100%.

Togliete gli spilli e trasferite la pelle in un piatto di vetro di 10 centimetri di diametro. Per il successo di questa procedura, il campione di pelle deve essere raccolto come un pezzo intatto e appiattito perfettamente. Posizionare due vetrini da microscopio sulla pelle per appiattirla ed evitare che si arricci.

Aggiungi 20 millilitri di benzoilbenzoato e alcol benzoilico o BBBA, che induriscono rapidamente il tessuto nelle ore successive. Sollevare i vetrini dalla pelle per alcuni secondi per consentire alla BBBA di lavare la pelle. La pelle del piede per l'analisi del pattern del follicolo pilifero viene tipicamente sezionata da P uno a P 8 agli animali Dopo l'eutanasia, tagliare i piedi sopra l'articolazione della caviglia e fare un singolo taglio dritto lungo la superficie ventrale attraverso la pianta dei piedi.

Staccare delicatamente la pelle dal tessuto sottostante procedendo in direzione prossimale o distale. Tagliare le dita per liberare la pelle e appuntare la pelle per sarda con la superficie interna rivolta verso l'alto. C'è un tessuto connettivo minimo sul piede.

Pelle transgenica. La pelle KRT 17 GFP è ora pronta per l'imaging per l'imaging della melanina. Fissare ed elaborare la pelle come dimostrato in precedenza per la pelle dorsale Dopo l'eutanasia dell'animale P 21, rimuovere i peli strofinando il depilatore.

Gel sulla superficie della pelle con un dito e un pollice guantati e attendere 10 minuti. Lavare la superficie della pelle con acqua di rubinetto. Successivamente sezionare e fissare la pelle del piede alla guardia S come mostrato in precedenza.

Fissare con l'1% P-F-A-P-B-S per 30 minuti a temperatura ambiente e poi lavare in PBS. Per preparare la pelle della coda, fare un taglio circolare attorno alla base della coda e poi una fessura longitudinale che corre per tutta la lunghezza della coda lungo la sua faccia ventrale. Staccare la pelle della coda partendo dalla punta afferrando saldamente la punta del coccige e/o il tessuto connettivo con un paio di pinze e la pelle con un secondo paio di pinze.

Fissare la pelle della coda alla protezione SIL per l'analisi della distribuzione della melanina e dell'orientamento del follicolo pilifero. Fissare ed elaborare la pelle come dimostrato per la pelle dorsale per l'analisi delle ghiandole sebacee prima della fissazione. Tagliare la pelle della coda in una serie di segmenti lunghi circa 0,5-1 centimetro e incubare i pezzi di pelle in PBS EDTA da cinque millimolari durante la notte a 37 gradi Celsius.

Per indebolire l'adesione dell'epidermide del derma il giorno successivo, staccare delicatamente l'epidermide dal derma. Fissare l'interfaccia dell'epidermide fino alla protezione S e fissare al 4% P-F-A-P-B-S per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente lavare l'epidermide con PBS e colorare con olio rosso O come descritto nel testo del protocollo.

Un microscopio da dissezione viene utilizzato per visualizzare le pelli dorsali del piede o della coda che sono immerse in BBBA appiattite sotto il vetrino e ancora nella capsula di vetro. Questo approccio riduce al minimo la contaminazione da BBBA del microscopio. Illumina la parabola dal basso per ridurre al minimo la variazione spaziale dell'intensità della luce nel campo visivo.

Sollevare la capsula di vetro a un'altezza di circa 10 centimetri sopra la superficie di lavoro standard del microscopio da dissezione e posizionare una lastra di plastica o vetro diffondente sopra la sorgente luminosa. Al termine dell'imaging, riportare la pelle al 100% di etanolo per la conservazione a lungo termine a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Per preparare la pelle macchiata di fosfatasi alcalina per l'imaging, posizionarla tra due lastre di vetro del tipo utilizzato per i gel proteici di piccole dimensioni.

Facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria tra le piastre e la pelle. Elimina con cura l'eccesso di BBBA con un tovagliolo di carta. Posiziona questo sandwich di piastra skin plate su un tavolino da microscopio.

Utilizza l'illuminazione a campo chiaro o DIC con un obiettivo 10 x e passi Z di due micrometri o cinque micrometri. Utilizza un tavolino XY meccanizzato per acquisire un montaggio di immagini XY che vengono unite insieme per creare un unico set di dati tridimensionale in scala di grigi. Esegui il tracciamento semi-automatico degli alberi degli assoni con una varietà di pacchetti software.

L'imaging in campo chiaro di montature piatte cutanee può essere utilizzato per visualizzare un singolo arboro sensoriale cutaneo mostrato qui con la sua immagine tracciata. L'imaging in campo chiaro consente anche la visualizzazione dei modelli dei follicoli piliferi in base alla pigmentazione della melanina. Queste immagini mostrano P una pelle da sei topi knockout wild type e crespi e P sette pelle da sei topi knockout Frizzled.

L'imaging al microscopio ottico di montature piatte cutanee può essere utilizzato per definire la geometria delle ghiandole sebacee e delle code. La pelle visualizzata con le ghiandole sebacee O rosso olio è disorganizzata in un topo crespo a sei knockout rispetto a un piede dorsale di tipo selvatico. La pelle raccolta da sei topi knockout wild type e crespi portatori di cheratina KRT 17 GFP marcata con A GFP e colorata con olio.

Red O ha rivelato che la pelle knockout ha un vortice di capelli al centro. L'imaging confocale dei montaggi piatti cutanei può anche definire la geometria dei follicoli piliferi visualizzati con KRT 17 GFP e la pillola anti-colorazione immuno e erettore. Muscoli oculari visualizzati con anti-smoo muscle actin, colorazione immuno

I cluster di cellule di Merkel vengono visualizzati con anti citocheratina otto o con assorbimento del colorante am 1 43 e il suo follicolo pilifero centrale visualizzato con KRT 17 GFP Invece di essere aperto verso la parte anteriore, il cluster di cellule di Merkel Frizzled six knockout forma un cerchio chiuso Una volta padroneggiata, una dissezione può essere eseguita in circa 30 minuti se eseguita correttamente e diverse posizioni errate possono essere eseguite in pochi giorni o una settimana. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere la pelle da varie regioni del corpo e come sopportarle per visualizzare diverse strutture della pelle in formato ormonale. Le immagini ad alta risoluzione delle strutture cutanee possono essere raccolte con la microscopia standard ad alta luce e la microscopia confocale.

Non dimenticare che lavorare con l'aldeide paraforme e il BBBA può essere estremamente pericoloso. L'inalazione di vapori deve essere ridotta al minimo conservando queste soluzioni in contenitori coperti e deve essere evitato il contatto con la pelle. Evitare che BBBA entri in contatto con la plastica.