Name: Cultura primario di topo neuroni dopaminergici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Impara a generare colture primarie di neuroni dopaminergici da mesencefalo di topo embrionale. Questo protocollo consente di studiare la vulnerabilità neuronale e i meccanismi della malattia di Parkinson.

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Supportato da sovvenzioni del CNRS e dell'INSERM. PM ringrazia la Fondation pour la Recherche Médicale en France (Equipe FRM 2009). SC ringrazia la Fondation de France.

I topi utilizzati in questo lavoro sono stati curati e trattati in conformità con le linee guida del Consiglio dell&#39;Unione europea (86/609 / UE) per l&#39;uso di animali da laboratorio. 1 Preparazione delle soluzioni necessarie <ol><li> Soluzioni Immagini <ol><li> 10x Poly-L-Ornitina (OLP) Soluzione: pesare 10 mg di PLO bromidrato (peso molecolare = 30,000-70,000) e sciogliere in 70 ml di acqua sterile. Filtrare la soluzione con 0,2 micron filtro a siringa, aliquote, e conservare a -20 ° C. </li><li> 30% di soluzione di glucosio: pesare 30 g di D (+) - Glucosio e sciogliere in acqua sterile fino ad un volume totale di 100 ml. Filter, aliquote e conservare a 4 ° C. </li><li> Modified mezzo di Eagle di 5x Dulbecco (DMEM) / Nutrient Mixture F-12 Ham: pesare 6 g di polvere DMEM / F-12 Prosciutto e sciogliere in acqua sterile fino ad un volume totale di 100 ml. Filter, aliquote e conservare a 4 ° C. </li><li> 7,5% Bicarbonato di sodio (NaHCO3) Solution: pesare 7,5 g di NaHCO3 e sciogliere in acqua sterile fino ad un volume totale di 100 ml. Filter, aliquote e conservare a 4 ° C. </li><li> 1 M HEPES Soluzione: Pesare 23,8 g di HEPES e sciogliere in acqua sterile fino ad un volume totale di 100 ml. Filter, aliquote e conservare a 4 ° C. </li><li> 70% (v / v) etanolo: Diluire 70 ml di etanolo assoluto con 30 ml di acqua sterile. </li></ol></li><li> Tampone fosfato isotonico con glucosio e antibiotici (PBS-GAB): aggiungere 10 ml di soluzione di glucosio al 30% e 5 ml di soluzione di penicillina-streptomicina a 500 ml di Dulbecco Phosphate Buffered Saline. Conservare a 4 ° C. </li><li> Inattivato siero fetale bovino (IFB): Scongelare siero bovino notte a 4 ° C e inattivare a 56 ° C per 30 min. Aliquota in 50 ml e conservare a -20 ° C. </li><li> Cultura Media: In acqua sterile, mescolare successivamente 40 ml di DMEM 5x / F12-Ham, 1 ml di 1 M HEPES, 2 ml di 200 mM L-glutammina, 2 ml di penicillina-streptomicina, 4 ml di 30% di glucosio unnd 3 ml di 7,5% NaHCO3 ad un volume finale di 180 ml. Filtrare e utilizzare lo stesso giorno. </li><li> Ormone Mix <ol><li> Preparare 180 ml di terreno di coltura. Sciogliere 200 mg di apo-transferrina in questo mezzo. </li><li> Pesare 50 mg di insulina e sciogliere in 2 ml di HCl 0,1 M. Aggiungere lentamente 8 ml di acqua sterile mentre mescolando delicatamente. Diluire la soluzione nel mezzo di coltura. </li><li> Pesare 19,3 mg di putrescina dicloridrato e sciogliere in 10 ml di acqua sterile. Aggiungere la soluzione alla miscela ormone 10 ml. </li><li> Preparare una soluzione di selenito di sodio 3 mM in acqua sterile e una soluzione di progesterone 2 mM in etanolo assoluto. Aggiungere 20 ml di ciascuna soluzione al mix ormonale. </li><li> Filtrare il mix di ormoni, un&#39;aliquota in 10 ml e conservare a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 2 Preparazione di piastre di coltura e strumenti <ol><li> FBS rivestimento delle piastre di coltura: Il giorno prima della dissezione, preparare 180 ml di terreno di coltura. Aggiungere 10 ml diIFB a 90 ml di mezzo di coltura. Aggiungere 300 ml / pozzetto di terreno di coltura / 10% IFB in piastre da 24 pozzetti poli-D-lisina pretrattata. Incubare per una notte a 37 ° C. Conservare i supporti rimanenti (con e senza IFB) a 4 ° C. </li><li> Sterilizzare gli strumenti e le pipette Pasteur. Raccogliere le attrezzature elencate nella tabella dei materiali così come una cappa di classe II a flusso laminare e un incubatore CO 2. </li></ol> 3. Dissezione di mouse mesencefalo <ol><li> Sacrifica un E13.5 il mouse in stato di gravidanza (secondo le linee guida istituzionali). Pulire l&#39;addome del mouse con il 70% di etanolo e aprire la parete addominale. Raccogliere le corna uterine, aprirli utilizzando le forbici delicati, sezionare ogni embrione dalle corna uterine, e rimuovere le membrane amniotiche. Mettere gli embrioni in una capsula di Petri 100 millimetri contenente PBS sterile-GAB e lavarli con bonifico in 3 bagni identici consecutivi con pinze. Per la dissezione, collocare gli embrioni da 3 in una capsula di Petri sterile 60 mm. </li><li> Movvia e il piatto finale Petri allo stereomicroscopio. Non decapitare gli embrioni. Utilizzando le forbici Vännäs, asportare il cervello. <ol><li> Rimuovere con cautela e scartare le regioni anteriori e romboencefalo. A lato rostrale, tagliare vicino alla regione del talamo, al taglio laterale caudale in corrispondenza della zona istmo, rimuovere il collicolo superiore. </li><li> Una volta che il mesencefalo ventrale è isolato, rimuovere con cautela le meningi con una pinza ultra fine. Raccogliere i segmenti sezionati, senza le meningi, in una provetta sterile da 13 ml riempito con PBS-GAB. </li></ol></li><li> Pulire accuratamente il tubo contenente il mesencephala con il 70% di etanolo e portarla sotto il cofano. </li></ol> Dissociazione 4. cellulare <ol><li> Lavare mesencephala 3 volte con PBS sterile-GAB. Consenti frammenti del cervello di stabilirsi tra ogni lavaggio ed evitare di interrompere il tessuto. Dopo l&#39;ultimo lavaggio, rimuovere con attenzione quanto soluzione possibile e incubare segmenti cerebrali in 3 ml di tripsina / EDTA per 15 min a 37 ° C in unCO 2 incubatore. </li><li> Fuoco-lucidare le pipette Pasteur per massimizzare la sopravvivenza dei neuroni, come la fine di una pipetta di vetro non levigato è tagliente e può danneggiare le cellule durante le fasi di dissociazione. Leggermente ridurre il diametro estremità (+ 0,5 mm) della pipetta Pasteur mentre fuoco lucidatura. </li><li> Rimuovere con attenzione quanto soluzione / EDTA tripsina possibile e aggiungere 10 ml di terreno di coltura / 10% IFB. Lavare i segmenti del cervello 3x con terreno di coltura / 10% IFB. </li><li> Utilizzando la pipetta Pasteur fuoco lucido, iniziare dissociazione di mesencephala in 6 ml di terreno di coltura / 10% IFB. Triturare 10x (evitare bolle d&#39;aria), consentono ai blocchi di stabilirsi, poi raccogliere il medium in una nuova provetta sterile 13 ml. </li><li> Aggiungere 6 ml di terreno di coltura, ripetere il passaggio precedente, una volta e raccogliere il supporto contenente cellule dissociate nello stesso tubo 13 ml. </li><li> Centrifugare le cellule a 160 g per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in terreno di coltura addizionato con10% mix ormonale. </li></ol> 5. cellulare placcatura <ol><li> Contare le celle in sospensione in una cella Malassez e regolare il volume del mezzo ad una concentrazione di 600.000 cellule / ml. Circa 1.700.000 cellule possono essere ottenute da un mesencefalo mouse. </li><li> Rimuovere FBS-terreno contenente rivestimento da piastre da 24 pozzetti e aggiungere in ogni pozzetto 1 ml di sospensione cellulare (600.000 cellule / pozzetto, 2-4% delle cellule TH +). </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C e 5% di CO 2/95% di aria. Nessun mezzo cambiamento è necessario. Neuroni dopaminergici sono maturi dopo circa 5-7 giorni in vitro (espressione coerente del trasportatore della dopamina). Conservare le cellule in coltura fino a 15 giorni senza prodotto sostitutivo. </li></ol> 6. immunofluorescenza protocollo <ol><li> Pulizia dei vetrini <ol><li> Il giorno prima della dissezione, aggiungere 10 ml di 1 M HCl in una capsula di Petri. Posare sulla superficie del liquido 12-15 vetrini e attendere 15 min. </li><li> Affondare il coperchioscivolare nel liquido e attendere 15 min. </li><li> Rimuovere HCl e lavare 3 volte con acqua. </li><li> Lavare i coprioggetti rapidamente con etanolo puro, una volta, quindi aggiungere etanolo puro al piatto e attendere 30 min. </li><li> Sotto il cofano, rimuovere i vetrini puliti da etanolo e aggiungere 1 coprioggetto per pozzetto di una piastra di coltura cellulare 12 pozzetti con pinze sterilizzate. </li><li> Lavare coprioggetto due volte con acqua sterile (1 ml / pozzetto). Poi, lavarli una volta con PBS sterile. </li></ol></li><li> Rivestimento dei vetrini <ol><li> Rimuovere PBS e aggiungere 500 microlitri / pozzetto di 2x dell&#39;OLP (diluito in PBS). Incubare per 4 ore a 37 ° C in incubatore CO 2. </li><li> Rimuovere la soluzione OLP e lavare 3 volte con PBS sterile. </li><li> Rimuovere PBS e aggiungere 500 microlitri / pozzetto di 20% IFB / 1 g / ml laminina. Incubare per una notte a 37 ° C in incubatore CO 2. </li></ol></li><li> Placcatura le cellule per immunofluorescenza <ol><li> Rimuovere medio rivestimento da piastre da 12 pozzetti. </li><li> Aggiungere 900,000 cellule / pozzetto in 2 volumi ml e far crescere le cellule in 37 ° C in incubatore. Le celle possono essere tenuti in coltura fino a 15 giorni senza prodotto sostitutivo. </li></ol></li><li> Immunostaining <ol><li> Rimuovere media da piastre da 12 pozzetti e lavare con 500 microlitri / pozzetto DMEM preriscaldato a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 500 ml / pozzetto di DMEM preriscaldato a 37 ° C, quindi aggiungere lentamente 160 ml / pozzetto di 8% paraformaldeide (PFA, concentrazione finale 2%) e incubare per 10 min a 37 ° C. </li><li> Rimuovere PFA e lavare 3 volte con PBS / 0,1 M glicina per 10 min. </li><li> Rimuovere PBS, aggiungere / pozzetto di PBS / 0,05% di siero di capra 300 microlitri Triton X-100/20% e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovi medio, aggiungere siero di capra 300 ml / pozzetto di anticorpo primario diluito in PBS / 0,05% Triton X-100 / all&#39;1% e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Gli anticorpi primari che possono essere utilizzati per la rilevazione di neuroni dopaminergici e caratterizzazione della cultura sono indicati nella tabella materiali. Mantenere1 bene senza anticorpo primario per valutare per lo sfondo dei diversi anticorpi secondari. </li><li> Rimuovere medie e lavare 3 volte con PBS / 0,2% di gelatina per 10 min. </li><li> Rimuovi medio, aggiungere siero di capra 300 ml / pozzetto di anticorpo secondario diluito in PBS / 0,05% Triton X-100 / all&#39;1% e incubare per 1 ora a temperatura ambiente, al buio. Gli anticorpi secondari utilizzati sono indicati nella tabella materiali. </li><li> Rimuovere medie e lavare 3 volte con PBS / 0,2% di gelatina per 10 min. </li><li> Rimuovere medie e lavare 3 volte con PBS. </li><li> Montare i coprioggetti sul lato vetro diapositive cella verso il basso in una goccia di Vectashield. Conservare i vetrini a temperatura ambiente per una notte per consentire al mezzo di montaggio a secco, poi conservarli a 4 ° C. </li><li> Acquisire le immagini utilizzando un microscopio confocale o di un microscopio a contrasto di fase attrezzata per epifluorescenza. Immagini rappresentative sono state acquisite con un microscopio confocale Leica SP2 UV. </li></ol></li></ol>

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<li>Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+axon+guidance%3A+which+makes+what%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic axon guidance: which makes what.</a> Front Cell Neurosci. 6, (2012).</li>
<li>Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitx3+is+required+for+development+of+substantia+nigra+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).</li>
<li>Ferri, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa1+and+Foxa2+regulate+multiple+phases+of+midbrain+dopaminergic+neuron+development+in+a+dosage-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner.</a> Development. 134, 2761-2769 (2007).</li>
<li>Rayport, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+postnatal+mesolimbic+dopamine+neurons+in+culture%3A+morphology+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology.</a> J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).</li>
<li>Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+GABA+receptors+in+cultured+substantia+nigra+neurons%3A+correlation+of+electrophysiology+and+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry.</a> Neuroscience. 78, 759-769 (1997).</li>
<li>Nefzger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lmx1a+allows+context-specific+isolation+of+progenitors+of+GABAergic+or+dopaminergic+neurons+during+neural+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+expression+of+Cdh2+is+essential+for+efficient+neural+differentiation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo presenta le procedure ei reagenti necessari per preparare una coltura primaria di neuroni mesencefaliche dal mouse embrionale e la procedura di immunofluorescenza per rilevare neuroni dopaminergici. Fasi critiche della procedura sono la dissezione degli embrioni e la dissociazione meccanica dei frammenti cerebrali raccolte. Strumenti di dissezione di alta qualità aiuta a padroneggiare la tecnica di dissezione. Neuroni DA costituiscono una piccola percentuale di mesencefalo. Pertanto, raccogliendo la pa...

La dopamina, uno dei neurotrasmettitori cerebrali essenziali 1,2, viene rilasciato principalmente dal mesencefalo dopaminergici (DA) neuroni. La maggior parte dei neuroni dopaminergici risiedono nella parte ventrale del mesencefalo 2-6. Schematicamente, mesencefalo neuroni DA possono essere divise in tre anatomicamente e funzionalmente distinti sistemi di proiezione: mesostriatal, mesolimbico, e percorsi mesocorticali 2,5. Il sistema nigrostriatale è coinvolta nel comportamento motorio, i percorsi mesolimbico svolgono un ruolo importante nel rinforzo, la motivazione e l&#39;apprendimento, mentre le vie dopaminergiche che proiettano alla corteccia prefrontale sono implicati nella cognizione 2. Neuroni DA sono coinvolti in diverse patologie neurologiche umane come la schizofrenia, deficit di attenzione, disturbi iper attività, e la malattia di Parkinson (PD) 2,4. PD è caratterizzata da una degenerazione progressiva e selettiva di neuroni DA collegamento substantia nigrapars compacta (SNC) al corpo striato. La perdita di Nigro-striatale DA neuroni provoca una grave deplezione di dopamina nello striato che è responsabile dei sintomi motori della malattia di Parkinson (bradicinesia, tremore a riposo, rigidità e) 7. La causa iniziale del PD idiopatica non è stata stabilita e gli attuali trattamenti sono solo sintomatica, che mira a ripristinare il livello di dopamina nello striato. Il farmaco più prescritto è L-Dopa (levodopa), il precursore naturale della dopamina. Anche se la somministrazione di Levodopa compensa la perdita di dopamina per un certo tempo, le complicanze motorie si verificano dopo i trattamenti a lungo termine (discinesia e stati on / off) 8,9. La ricerca sui neuroni dopaminergici e PD è in costante progressione e intensi sforzi sono stati fatti per sviluppare trattamenti basati sul trapianto di cellule, la terapia genica, o agenti neuroprotettivi 10,11. Tuttavia, una questione importante rimane non chiarita: qual è la causa della estrema vulnerabilità di neuroni DA? Parte della risposta può essere trovata nella attività dei neuroni DA. Una riduzione dell&#39;attività elettrica e della eccitabilità di neuroni dopaminergici sembra aumentare la loro propensione a degenerare 12. Tuttavia, la complessità del PD patogenesi richiede ulteriori studi per identificare i meccanismi coinvolti nella degenerazione dei neuroni DA 13-15. Colture primarie sono particolarmente rilevanti per studiare le proprietà dei neuroni DA 16-19 e di sfidare questi neuroni a varie sollecitazioni per la valutazione degli agenti neuroprotettivi 20-24. Modelli di coltura Rat sono più spesso utilizzati, come la dissezione di ratto dell&#39;embrione mesencefalo è più facile, in confronto con il mouse, e una maggiore quantità di neuroni possono essere ottenuti nel ratto. Tuttavia, la generazione di modelli transgenici murini di malattia 25 ha notevolmente aumentato l&#39;interesse della comunità neuroscienziato per colture primarie dal mouse 26-29. Anche se le culture prepared da animali neonati può essere utilizzato, è meglio prepararli da embrioni allo stadio post-mitotico (E13.5 per i neuroni mesencefalo), quando i neuroni hanno conservato la loro capacità di differenziarsi. Il protocollo che segue presenta isolate mesencefalo neuroni in coltura primaria da embrioni di topo (E13.5), che sono i più difficili da preparare. In particolare, forniamo un protocollo con terreno privo di siero cultura per una migliore riproducibilità. Le due fasi più critiche in preparazione culturale (dissezione e dissociazione meccanica) saranno accuratamente dettagliati nel video associato.

<table><tbody><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Lonza</td><td>14-801F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g/L di glucosio con L-glutammina</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1x), rosso fenolo</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina, soluzione 200</td><td>mM Life Technologies</td><td></td><td></td>25030123</tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Miscela Medio/Nutriente F-12 Prosciutto</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D0547</td><td>Laminina in polvere</td></tr><tr><td>- 1 mg/ml in NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td> tamponato con Tris<td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato di poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Insulina dal pancreas suino</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>I5523</td><td></td></tr><tr><td>apo-transferrina umana</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Dicloridrato di putrescina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H4034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G7126</td><td>Soluzione madre 1 M in acqua</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G9391</td><td>Soluzione madre 2% (p/v) in acqua</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide 16% in acqua</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>RT 15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio (NaHCO3)Merck</td> <td>Millipore</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosio, monoidrato</td><td>Merck Millipore</td><td>4074-2</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur</td><td>Merck Millipore</td><td>109057</td><td></td></tr><tr><td>Acqua sterile - Aqua B. Braun</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto Reagente analitico NORMAPUR</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri sterili</td><td>VWR</td><td>82050-566</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur in vetro semplice - Wilhem Ulbrich GdbR.</td><td>VWR</td><td>612-2297</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio Malassez</td><td>VWR</td><td>631-0975</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa Acrodisc per siero con membrana Supor, sterile, GF/0,2 e micro; m, 37 mm</td><td>PALL Life science</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche - Dritte, affilate-affilate, lunghe 14,5 cm</td><td>Strumenti di scienze fini</td><td>14002-14</td><td>Per aprire la parete addominale</td></tr><tr><td>Forbici - Dritte, appuntite, delicate, lunghe 10 cm</td><td>MORIA</td><td>4877A</td><td>Per aprire la parete uterina</td></tr><tr><td>Pinze - Mascelle curve, usuali, seghettate 1 mm</td><td>MORIA</td><td>2183</td><td>Per manipolare gli</td></tr> <tr><td>embrioniForbici Vannas - Lame curve, appuntite, da 7 mm</td><td>MORIA</td><td>MC50</td><td>Per estrarre il mesencefalo</td></tr><tr><td>Pinze ultra fini - Curve, delicate, lunghe 13 cm</td><td>MORIA</td><td>9987</td><td>Per rimuovere le meningi</td></tr><tr><td>BD BioCoat Poly-D-Lysine Piastre multipozzetto a 24 pozzetti</td><td>BD Bioscience</td><td>356414</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari BD Falcon a 12 pozzetti, fondo piatto con coperchio</td><td>BD Bioscience</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio SuperFrost, bordi rettificati 90&ordm;</td><td>MENZEL-GL&Auml; SER</td><td>AG00008032E</td><td></td></tr><tr><td>Copriocchiali di precisione spessore n. 1.5H circolare 18 mm &Oslash;</td><td>MARIENFELD</td><td>117580</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale di coniglio anti-proteina associata ai microtubuli 2 (MAP2)</td><td>Chemicon Millipore</td><td>AB5622</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di topo anti-glutammato decarbossilasi (GAD67), clone 1G10.2</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB5406</td><td>1/400</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale di ratto anti-trasportatore della dopamina (DAT), clone DAT-Nt&nbsp;</td><td>Chemicon Millipore</td><td>MAB369</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Monoclonale Mouse Anti-5-HT Anticorpo</td><td></td><td></td><td>1/8.000 - Generoso dono di Yves Charnay (Svizzera, Yves.Charnay@hcuge.ch)Siero</td></tr> di <tr><td>capra, Nuova Zelanda Origine Life</td><td>Technologies</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 Capra Anticorpo IgG (H+L) Life</td><td>Technologies</td><td>A-31556</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Capra Anti-Topo IgG (H+L) Anticorpo</td><td>Life Technologies</td><td>A-11001</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Capra Anti-ratto IgG (H+L) Anticorpo</td><td>Life Technologies</td><td>A-11007</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>VECTASHIELD HardSet Montaggio Medio</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Carl Zeiss Microscopia</td><td>Stemi-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner FIREBOY</td><td>VWR</td><td>451-0136</td><td></td></tr></tbody></table>

cultura primario di topo neuroni dopaminergici

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Neuroni dopaminergici rappresentano meno dell&#39;1% del numero totale di neuroni nel cervello. Questa bassa quantità di neuroni regola importanti funzioni cerebrali come il controllo motorio, la motivazione, e la memoria di lavoro. Neuroni dopaminergici nigrostriatali degenerano selettivamente nella malattia di Parkinson (PD). Questa perdita neuronale progressiva è inequivocabilmente associato con i motori sintomi della patologia (bradicinesia, tremore a riposo, e rigidità muscolare). L&#39;agente principale responsabile della degenerazione dei neuroni dopaminergici è ancora sconosciuta. Tuttavia, questi neuroni sembrano essere estremamente vulnerabile in condizioni diverse. Colture primarie costituiscono uno dei modelli più importanti per studiare le proprietà e le caratteristiche dei neuroni dopaminergici. Queste culture possono essere presentate a diversi agenti di stress che imitano PD patologia e ai composti neuroprotettivi al fine di fermare o rallentare la degenerazione neuronale. I numerosi modelli murini transgenici di PD che sono stati generated nel corso dell&#39;ultimo decennio ulteriormente aumentato l&#39;interesse dei ricercatori per le culture neuronali dopaminergiche. Qui, il protocollo video si concentra sulla delicata dissezione dei cervelli embrionali di topo. Escissione precisa del mesencefalo ventrale è fondamentale per ottenere colture neuronali sufficientemente ricchi di cellule dopaminergiche per consentire studi successivi. Questo protocollo può essere realizzato con topi transgenici embrionali ed è adatto per immunofluorescenza, PCR quantitativa, secondo la quantificazione messaggero, o neuronale valutazione morte / sopravvivenza.

Un diagramma di flusso illustrato dei passaggi di coltura mesencefalo è mostrato in Figura 1. Brevemente, dopo aver raccolto embrioni E13.5 da una gravidanza topo svizzera, mesencefalo ventrale è sezionato dall&#39;intero embrione. I frammenti del cervello isolati vengono successivamente sottoposti a digestione enzimatica e dissociazione meccanica. Cellule dissociate sono pellettizzati per centrifugazione, risospese in terreno di coltura e placcato in piastre da 12 o da 24 pozzetti pre-rivestito. Le cel...

I neuroni dopaminergici svolgono un ruolo regolatore vitale nel cervello. La loro perdita è associata al morbo di Parkinson. In questo video, mostriamo come generare colture primarie di neuroni dopaminergici centrali da mesencefalo embrionale di topo. Tali colture sono utili per studiare l'estrema vulnerabilità di questi neuroni a vari stress.

Cultura primario di topo neuroni dopaminergici

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è mostrare come generare una coltura primaria di neuroni dopaminergici a partire da cervelli di topi embrionali. Questo viene realizzato innanzitutto raccogliendo embrioni di topo al giorno E 13,5. Il secondo passaggio consiste nel dissezionare i cervelli dei topi embrionali e isolare il mesencefalo.Successivamente, al mesencefalo raccolto vengono applicate una dissociazione enzimatica e una meccanica. L'ultimo passaggio consiste nella semina delle cellule neuronali dissociate. Infine, una colorazione immunofluorescente viene utilizzata per dimostrare la presenza di neuroni dopaminergici nella coltura.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei disturbi neurologici e psichiatrici, come la schizofrenia, il disturbo da deficit di attenzione e iperattività e la malattia di Parkinson. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di dissezione e di dissociazione cellulare sono difficili da apprendere, in quanto richiedono gesti precisi e un'accurata identificazione anatomica della struttura; la procedura sarà dimostrata da Florence, un'ingegnera del mio gruppo. Per iniziare questa p

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Primaria dissociato mesencefalo colture di cellule della dopamina permettono per lo studio delle caratteristiche presinaptici dei neuroni dopaminergici. Possono essere utilizzati per monitorare in tempo reale la cinetica di rilascio di dopamina e proteine ​​/ mRNA livelli di regolatori di esocitosi dopamina. Qui vi mostriamo come generare queste culture da neonati di roditori.

Primaria dissociato mesencefalo colture cellulari dopamina da roditori neonati

Questo protocollo delinea i passaggi necessari per analizzare, attraverso trasfezione elettroporazione e neuroni dell'ippocampo e del mouse cultura corticale. Colture a breve termine possono essere utilizzati per gli studi della crescita degli assoni e la guida, mentre a lungo termine le culture possono essere utilizzati per studi di sinaptogenesi e analisi spine dendritiche.

Nucleofection e cultura primaria di neuroni embrionali di topo ippocampale e corticale

Questo articolo descrive i metodi per ricavare le popolazioni murine arricchito di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) in colture primarie, che differenziano per produrre oligodendrociti maturi (OLS). Inoltre, questo rapporto descrive le tecniche per produrre murino mielinizzanti co-colture da semina OPC del mouse su un letto neurite dei neuroni dei gangli spinali del mouse (DRGNs).

Derivazione di Arricchito Culture oligodendrociti e degli oligodendrociti / Neuron mielinizzanti co-culture di tessuti murini post-natale

Questo video delinea un metodo per coltivare neuroni dopaminergici da tessuto cerebrale embrionale di topo. Il processo include il trattamento del mesencefalo con un enzima proteolitico, il distacco delle cellule e la loro coltura su vetrini coprioggetti rivestiti di polimero in un mezzo ricco di sostanze nutritive con antibiotici per la loro crescita e vitalità a lungo termine.

Coltura e mantenimento di neuroni dopaminergici da tessuto cerebrale embrionale di topo

Il video dimostra il processo di isolamento e coltura dei neuroni dopaminergici dal mesencefalo di embrioni di topo. I pavimenti ventrali isolati del mesencefalo vengono dissociati utilizzando enzimi. I neuroni dopaminergici risultanti vengono raccolti e trasferiti in micro-isole all'interno di piastre multi-pozzetto. Le cellule vengono incubate con un mezzo neuronale dopaminergico per mantenere le cellule ad alta densità all'interno delle micro-isole.

Isolamento e coltura dei neuroni dopaminergici del mesencefalo embrionale primario di topo

Questo video dimostra il processo di quantificazione dell'accumulo di alfa-sinucleina nei neuroni dopaminergici embrionali di topo pre-trattati con fibrille preformate di alfa-sinucleina. Descrive i passaggi per fissare, colorare e quantificare i neuroni dopaminergici contenenti aggregati di alfa-sinucleina utilizzando l'immunofluorescenza.

Studio dell'accumulo di alfa-sinucleina nei neuroni della dopamina embrionale primaria di topo

Qui si descrive un protocollo dettagliato per la generazione simultanea di colture di cellule precursore neuronali, sia come monostrati aderenti o neurosfere, dalla zona subventricolare e giro dentato di singoli topi adulti.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

Le cause della degenerazione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo durante il morbo di Parkinson non sono completamente comprese. I sistemi di coltura cellulare forniscono uno strumento essenziale per lo studio delle proprietà neurofisiologiche di questi neuroni. Qui presentiamo un protocollo ottimizzato, che può essere utilizzato per la modellazione in vitro della neurodegenerazione.

Isolamento, cultura e lungo termine Manutenzione di primaria mesencefalico neuroni dopaminergici Da Brains embrionali dei roditori

Nella malattia di Parkinson (PD), sostanza nera (SNC) neuroni dopaminergici degenerano, portando ad una disfunzione del motore. Qui riportiamo un protocollo per la coltura di neuroni del mesencefalo ventrale da un topo che esprime eGFP guidata da una sequenza promotore la tirosina idrossilasi (TH), la raccolta neuroni fluorescenti singoli dalle culture, e misurando il loro trascrittoma utilizzando RNA-Seq.

Identificazione affidabile di vita neuroni dopaminergici in Culture Midbrain Utilizzando RNA Sequencing e TH-promotore-driven eGFP Expression

Condurre esperimenti in vitro per riflettere le condizioni in vivo nel modo più adeguato possibile non è un compito facile. L'uso delle colture cellulari primarie è un passo importante verso la comprensione della biologia cellulare in un intero organismo. Il protocollo fornito descrive come crescere e coltivare neuroni cerebellari embrionali del topo.

Cultura primaria dei neuroni isolata dal cerbellello del topo embrionale

Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per studiare l'accumulo neuronale di sinucleina nei neuroni primari della dopamina del topo. Gli aggregati di sibbonucleina fosfolati nei neuroni sono indotti con fibrille pre-formate e sinucleina. L'imaging automatizzato di cellule etichettate immunofluorescentmente e l'analisi imparziale dell'immagine rendono questo protocollo robusto adatto per lo screening della produttività medio-alta di farmaci che inibiscono l'accumulo di sinucleina.

Studio pre-formato Fibril indotta accumulazione di z-sinucleina in primario embrionale Midbrain Dopamine Neuroni

Impara a generare colture primarie di neuroni dopaminergici da mesencefalo di topo embrionale. Questo protocollo consente di studiare la vulnerabilità neuronale e i meccanismi della malattia di Parkinson.

Cultura primario di topo neuroni dopaminergici

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