Nanogold Etichettatura del Sistema lievito endosomiale per le analisi ultrastrutturali

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare a livello ultra strutturale i compartimenti endosomiali del lievito Saccharomyces cei. Ciò si ottiene preparando il lievito Sphera plast, che poi subisce l'assorbimento endocitico di particelle di nano oro caricate positivamente. In una seconda fase, il campione viene fissato e sezionato per ottenere sezioni criogeniche ultra sottili delle cellule.

Successivamente, le sezioni criogeniche vengono sottoposte alla reazione di potenziamento dell'argento. Al fine di ingrandire e visualizzare le particelle di nano oro caricate positivamente endocitosio, si ottengono risultati che mostrano la morfologia dei diversi compartimenti endosomiali del lievito in base alla marcatura specifica di questa procedura. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai nostri metodi esistenti, come la marcatura della sezione ImmunoGold, è che non si basa su anticorpi che spesso non funzionano nella preparazione dell'elettromicroscopia.

Sebbene questo metodo possa mostrarci informazioni sul sistema lisosomiale del lievito sarchi ESIS vei, può essere applicato anche ad altri modelli eucariotici come altre cellule di lievito e mammiferi. Il lievito da cui verrà preparato lo Sphero Plast viene prima incubato per una notte a 30 gradi Celsius in 10 millilitri del terreno appropriato, come determinato dal disegno dell'esperimento il giorno successivo. Dopo aver misurato la densità ottica della coltura a 600 nanometri, diluire le cellule nello stesso terreno di coltura a un OD 600 compreso tra 0,2 e 0,4.

Far crescere le cellule fino a una fase di crescita esponenziale con un OD 600 di trasferimento da uno a due, 10 D 600 equivalenti di cellule in una provetta da 50 millilitri e centrifugare a 2100 Gs per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di tubi da 100 millimolari e tre dihi da 10 millimolari a Hall, incubare a 30 gradi Celsius per 10 minuti. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Dopo aver scartato il surnatante Resus, sospendere le cellule in cinque millilitri di terreno contenente un molare di sorbitolo e cinque milligrammi di enzima litico. Incubare la miscela a 30 gradi Celsius agitando delicatamente per 30 minuti. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 Gs per cinque minuti per raccogliere una frazione di pellet che corrisponde alle piastre Sphero.

Scartare il surnatante e risospendere gli splats in 960 microlitri di terreno ghiacciato a freddo contenente un molare di sorbitolo. Trasferire il composto in una provetta da microcentrifuga ghiacciata da due millilitri. Per iniziare la procedura di assorbimento del nano oro, utilizzare una pipetta e mescolare delicatamente Sphero plast con quattro particelle di nano oro caricate positivamente.

Resus sospeso in 40 microlitri d'acqua. Il volume finale della miscela deve essere di un millilitro. Porre la sospensione cellulare ottenuta sul ghiaccio per 15 minuti.

Trasferire la sospensione a temperatura ambiente e incubare per il tempo necessario per consentire l'internalizzazione del nano oro mediante endocitosi. Quando l'assorbimento del nano oro desiderato è completo, arrestare la reazione aggiungendo un millilitro di fissativo a doppia forza contenente un molare di sorbitolo alla sospensione cellulare. Tenere il tubo a temperatura ambiente per 30 minuti.

Capovolgere delicatamente la provetta della microcentrifuga manualmente più volte durante i 30 minuti per mantenere il PHE plast e la sospensione Successivamente, centrifugare due volte a 1700 Gs per 25 secondi, scartare il surnatante e aggiungere un millilitro di fissativo fresco di dosaggio standard contenente un molare di sorbitolo, incubare per due ore a temperatura ambiente su una ruota che ruota lentamente. Successivamente, le cellule vengono lavorate e criosezionate come descritto nel protocollo di testo prima di iniziare questa procedura, rimuovere il kit di potenziamento dell'argento dal congelatore e scongelare in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Posizionare il kit di scongelamento in un'incubatrice da banco a 24 gradi Celsius precedentemente posizionata nella camera oscura fino all'uso.

Metti una piastra riscaldante in una stanza buia e riscaldala a una temperatura finale di 24 gradi Celsius. Coprire la parte superiore della piastra riscaldante con una superficie da banco, proteggere con il lato lucido rivolto verso l'alto e fissarla con del nastro adesivo. Posizionare la pellicola para sulla protezione della superficie e contrassegnare i bordi con un pennarello nero per consentire la visualizzazione al buio.

Fissare un termometro sulla parte superiore della protezione della superficie. Per monitorare la temperatura della piastra riscaldante, regolare gradualmente la temperatura. Se non ci sono 24 gradi Celsius, posizionare un tubo da 50 millilitri contenente acqua distillata doppia.

All'interno dell'incubatrice, riempire una piccola capsula di Petri con acqua distillata doppia, preavvertita a 37 gradi Celsius. Posizionare due griglie di nichel con le sezioni criogeniche nel campo dell'acqua con il lato del campione rivolto verso il basso per 30 minuti. Dopo 30 minuti, riempire una seconda capsula di Petri con acqua distillata doppia preriscaldata e mettere le stesse due griglie di nichel nell'acqua per altri 30 minuti.

Sciacquare nuovamente le griglie passandole con il lato del campione rivolto verso il basso su alcune gocce di acqua bidistillata a 24 gradi centigradi poste sul profumo che è stato fissato sulla piastra riscaldante. Assicurati che altre nove gocce di acqua distillata doppia siano pronte sul profumo per il risciacquo dopo la reazione di potenziamento dell'argento. A questo punto della procedura, tutte le luci nella camera oscura devono essere spente e la luce rossa accesa.

Tuttavia, solo a scopo di ripresa, la luce rimarrà accesa. In questa dimostrazione, estrarre le soluzioni A e B del kit di miglioramento dell'argento dall'incubatore a 24 gradi Celsius in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri a sei gocce della soluzione A, seguite da sei gocce della soluzione B e mescolare bene con una pipetta di vetro per pasti evitando la formazione di bolle. Vortex la soluzione.

Rimettere brevemente le soluzioni a e B nell'incubatore a 24 gradi Celsius ed estrarre la soluzione C. Aggiungere sei gocce della soluzione C alla miscela AB. Mescolare nuovamente con una pipetta pastiera seguita da vortice ed evitare di formare bolle.

Utilizzare immediatamente questa miscela finale. Posiziona le gocce sulla paraforma con un paio di pinzette antimagnetiche pulite. Posizionare le griglie sul composto.

Questa è la reazione di potenziamento dell'argento. Lasciare le griglie per sei-15 minuti a seconda del miglioramento desiderato per l'esperimento. Togliete le griglie dal composto e passatele rapidamente attraverso una successione di sei gocce di acqua bidistillata poste su Perfil a 24 gradi per gli ultimi tre lavaggi.

Lasciare le griglie per sette minuti per goccia d'acqua. Se si esegue un vero esperimento, riaccendere le luci al termine del lavaggio. Successivamente, i risultati vengono visualizzati mediante marcatura ImmunoGold o colorazione della membrana per un'indagine EM.

Diversi tipi di compartimenti endosomiali del lievito possono essere marcati con nano oro potenziato con argento e visualizzati al microscopio elettronico. Un assorbimento di cinque minuti di nano oro etichetta la membrana plasmatica e i compartimenti endosomiali precoci, come le vescicole singole, che sono probabilmente vescicole endocitiche e le strutture tubulari, che sono molto probabilmente endosomi precoci. Un'incubazione di 30 minuti con nano oro porta alla marcatura di endosomi tardivi o corpi multivescicolari.

Il potere risolutivo della combinazione di una procedura di microscopia immunoelettronica con questo protocollo di potenziamento dell'argento nano oro è sottolineato dalla conservazione e dalla qualità della morfologia degli organelli mostrati, in particolare delle vescicole interne dei corpi multivescicolari. Prima di utilizzare il metodo di potenziamento dell'argento, è necessario eseguire un esperimento pilota per determinare i tempi di incubazione ottimali necessari sia per le dimensioni che per l'uniformità di queste particelle d'argento. Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come l'immunomarcatura, possono essere eseguiti per rispondere a domande come la localizzazione di una particolare proteina in una specifica sotto il compartimento mar.