Nanogold Etichettatura del Sistema lievito endosomiale per le analisi ultrastrutturali

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di visualizzare a livello ultrastrutturale i compartimenti endosomiali del lievito Saccharomyces cerevisiae. Questo risultato si ottiene preparando lieviti in sferoplasti, che successivamente effettuano l'assorbimento endocitico di particelle di oro nano caricate positivamente. Come secondo passaggio, il campione viene fissato e sezionato per ottenere sezioni criogeniche ultraterne delle cellule.

Successivamente, i tagli criogenici vengono sottoposti alla reazione di amplificazione con argento. Al fine di ingrandire e visualizzare l'endocitosi, si ottengono risultati positivi con nanoparticelle d'oro cariche che mostrano la morfologia dei diversi compartimenti endosomiali del lievito, basata sull'etichettatura specifica di questo procedimento. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'etichettatura ImmunoGold su sezioni, è che non dipende da anticorpi che spesso non funzionano sulle preparazioni per microscopia elettronica.

Sebbene questo metodo possa fornirci informazioni sul sistema lisosomiale del lievito sarchi ESIS vei, può essere applicato anche ad altri modelli eucariotici, come altri lieviti e cellule di mammifero. I lieviti da cui verranno preparati gli Sphero Plast vengono prima incubati tutta la notte a 30 gradi Celsius in 10 millilitri del mezzo appropriato, scelto in base al disegno sperimentale del giorno successivo. Dopo aver misurato la densità ottica della coltura a 600 nanometri, diluire le cellule nello stesso mezzo di coltura fino a un OD 600 compreso tra 0,2 e 0,4.

Coltivare le cellule fino alla fase esponenziale di crescita con un OD 600 compreso tra uno e due; trasferire 10 D 600 equivalenti di cellule in un tubo da 50 millilitri e centrifugare a 2100 G per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di pipes 100 millimolari e dihi tre 10 millimolari a Hall, quindi incubare a 30 gradi Celsius per 10 minuti. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

Dopo aver scartato il soprannatante Resus, sospendere le cellule in cinque millilitri di mezzo contenente un molare di sorbitolo e cinque milligrammi di enzima litico. Incubare la miscela a 30 gradi Celsius con agitazione delicata per 30 minuti. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 G per cinque minuti per raccogliere una frazione di pellet che corrisponde ai Sphero plats.

Eliminare il soprannatante e ri-sospendere gli splats in 960 microlitri di mezzo freddo contenente sorbitolo uno molare. Trasferire la miscela in una provetta da microcentrifuga da due millilitri fredda. Per iniziare la procedura di incorporazione dell'oro nano, utilizzare una pipetta e mescolare delicatamente lo splasto Sphero con quattro particelle di oro nano cariche positivamente.

Risospendere in 40 microlitri di acqua. Il volume finale della miscela deve essere di un millilitro. Porre la sospensione cellulare ottenuta sul ghiaccio per 15 minuti.

Trasferire la sospensione a temperatura ambiente e incubare per il tempo necessario per consentire l'internalizzazione dell'oro nano mediante endocitosi. Al termine dell'assorbimento desiderato di oro nano, arrestare la reazione aggiungendo un millilitro di fissativo a doppia concentrazione contenente sorbitolo uno molare alla sospensione cellulare. Mantenere il tubo a temperatura ambiente per 30 minuti.

Rovesciare delicatamente il tubo del microcentrifugatore manualmente più volte durante i 30 minuti per mantenere omogenea la plastificazione del PHE e la sospensione. Successivamente, centrifugare due volte a 1700 G per 25 secondi, eliminare il soprannatante e aggiungere un millilitro di fissativo fresco di concentrazione standard contenente sorbitolo uno molare; incubare per due ore a temperatura ambiente su un rotatore lento. In seguito, le cellule vengono processate e sottoposte a criosezionamento come descritto nel protocollo testuale. Prima di iniziare questa procedura, rimuovere il kit di amplificazione argentica dal congelatore e farlo scongelare in un incubatore a 37 gradi Celsius. Collocare il kit scongelato in un incubatore da banco a 24 gradi Celsius precedentemente posizionato nella stanza buia, fino al momento dell'uso.

Posizionare una piastra riscaldante in una stanza buia e riscaldarla fino a una temperatura finale di 24 gradi Celsius. Coprire la parte superiore della piastra riscaldante con una superficie in tessuto da banco, con il lato protettivo lucido rivolto verso l'alto, e fissarla con del nastro adesivo. Posizionare del para film sul protettore di superficie e delinearne i bordi con un pennarello nero per consentire la visualizzazione al buio.

Attaccare un termometro sulla parte superiore del proteggi superficie. Per monitorare la temperatura della piastra riscaldante, regolare gradualmente la temperatura. Se non è di 24 gradi Celsius, posizionare un tubo da 50 millilitri contenente acqua distillata due volte.

All'interno dell'incubatrice, riempire una piccola capsula di Petri con acqua doppia distillata preriscaldata a 37 gradi Celsius. Posizionare due griglie di nichel con le sezioni criogeniche nell'acqua, con il lato del campione rivolto verso il basso, per 30 minuti. Dopo 30 minuti, riempire una seconda capsula di Petri con acqua doppia distillata preriscaldata e posizionare le stesse due griglie di nichel nell'acqua per altri 30 minuti.

Risciacquare nuovamente le griglie passandole, con il lato del campione rivolto verso il basso, su diverse gocce di acqua distillata doppia a 24 gradi Celsius poste sul parafilm fissato sulla piastra riscaldante. Assicurarsi che altre nove gocce di acqua distillata doppia siano pronte sul parafilm per il risciacquo successivo alla reazione di amplificazione argentica. A questo punto della procedura, tutte le luci nella stanza oscura devono essere spente e deve essere accesa la luce rossa.

Tuttavia, solo per scopi di ripresa, la luce rimarrà accesa. In questa dimostrazione, prelevare le soluzioni A e B del kit di amplificazione dell'argento dall'incubatrice a 24 gradi Celsius in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri, aggiungendo sei gocce della soluzione A, seguite da sei gocce della soluzione B, quindi mescolare accuratamente con una pipetta di vetro Pasteur evitando la formazione di bolle. Vortexare la soluzione.

Riportare brevemente le soluzioni a e B nell'incubatrice a 24 gradi Celsius ed estrarre la soluzione C. Aggiungere sei gocce della soluzione C alla miscela AB. Mescolare nuovamente con una pipetta pasteur seguita da vortexaggio, evitando la formazione di bolle.

Utilizzare immediatamente questa miscela finale. Applicare gocce sulla paraform con una pinzetta pulita e antimagnetica. Posizionare le griglie sulla miscela.

Questa è la reazione di potenziamento con argento. Lasciare le griglie per sei-quindici minuti, a seconda del potenziamento desiderato per l'esperimento. Rimuovere le griglie dalla miscela e farle passare rapidamente attraverso una serie di sei gocce di acqua doppio-distillata poste su Perfil a 24 gradi Celsius per gli ultimi tre lavaggi.

Lasciare le griglie per sette minuti per ogni goccia d'acqua. Se si sta eseguendo un esperimento reale, riaccendere le luci al termine del lavaggio. Successivamente, i risultati vengono visualizzati mediante etichettatura con ImmunoGold o colorazione della membrana per un'indagine al microscopio elettronico (EM).

È possibile etichettare diversi tipi di compartimenti endosomiali del lievito con oro nano potenziato con argento e visualizzarli mediante microscopia elettronica. Un'incubazione di cinque minuti con oro nano etichetta la membrana plasmatica e i compartimenti endosomiali precoci, come vescicole singole, probabilmente vescicole endocitiche, e strutture tubulari, molto probabilmente endosomi precoci. Un'incubazione di 30 minuti con oro nano determina l'etichettatura di endosomi tardivi o corpi multivescicolari.

La potenza risolutiva della combinazione di una procedura di microscopia elettronica immuno con questo protocollo di potenziamento del nano oro-argento è evidenziata dalla conservazione e dalla qualità della morfologia degli organelli mostrati, in particolare delle vescicole interne dei corpi multivescicolari. Prima di utilizzare il metodo di potenziamento con argento, è necessario eseguire un esperimento pilota per determinare i tempi di incubazione ottimali richiesti sia per le dimensioni che per l'uniformità di queste particelle di argento. Seguire questa procedura.

Altri metodi, come l'etichettatura immunoistochimica, possono essere eseguiti per rispondere a domande riguardo alla localizzazione di una proteina particolare in un compartimento marino specifico.