Name: High-throughput Assay per Fenotipo Salmonella enterica Typhimurium Associazione, Invasion, e replica nei macrofagi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Scopri un saggio ad alto rendimento per valutare l'associazione, l'invasione e la replicazione di Salmonella enterica nei macrofagi. Questo metodo identifica i geni meccanistici della patogenesi batterica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo progetto è stato sostenuto in parte da una sovvenzione per i National Institutes of Health NIAID (per AJB e LGA, R01 AI076246). La collezione mutante di Salmonella è stato in parte sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni (per MM, U01 A152237-05, R01, R01 AI07397-01 AI039557-11 e R01 AI075093-01), in parte dal National Institutes of Health sovvenzioni (per HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Ringraziamo Steffen Prowollik per la placcatura replica e confermando i mutanti della collezione.

1 murino macrofagi RAW264.7 Colture Cellulari <ol><li> Crescere basso numero passaggio macrofagi murini, RAW264.7 (Il numero ATCC ®, TIB-71) in una coltura cellulare pallone ventilato cap T-75 filtro Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) , 0,5% NaHCO 3 e 1% 100x non essenziali aminoacidi (NEAA) a 37 ° C, in un incubatore CO 2 5%. </li><li> Una volta che le cellule raggiungono una confluenza del 60-80% nel pallone, utilizzare un raschietto cella per raccogliere le cellule, e contare le cellule in un emocitometro e calcolare la concentrazione cellulare. </li><li> Risospendere le cellule e diluire la concentrazione cellulare in 2,5 x 10 5 / ml in mezzo di coltura cellulare fresca DMEM. Utilizzare pipette multicanale al piatto 200 ml di mezzo di coltura cellulare DMEM contenente 5 x 10 4 cellule in ciascun pozzetto di 96 pozzetti piastre di coltura cellulare. </li><li> Piatto quattro pozzi di ogni ceppo Salmonella. Impostare tre piatti separati per un setdi phagocytic dosaggio cellule invasione, e contrassegnarli con &quot;associazione&quot;, &quot;invasione&quot; e &quot;replica&quot;, rispettivamente. </li><li> Posizionare le piastre del 5% di CO 2 incubatore a 37 ° C ON per consentire alle cellule macrofagi per attaccare al fondo dei pozzetti. </li></ol> 2 Preparazione di Salmonella wild-type e mutanti <ol><li> Lo stesso giorno della preparazione delle cellule macrofagi RAW264.7, raccogliere singole colonie di wild-type (WT) Salmonella enterica sierotipo Typhimurium 14028s, DinvA mutanti, DphoP mutanti, e ceppi mutanti di prova desiderati, e la cultura li in Luria-Bertani ( LB) brodo integrato con antibiotici come appropriato. Usare ogni set dei fagociti saggi cellule invasione di testare fino a 10 ceppi mutanti (DinvA mutante e DphoP mutanti sono difettosi in invasione e replicazione intracellulare, rispettivamente). </li><li> Crescere i batteri per 14 ore a 37 ° C con sHaking a 220 rpm in 5 ml di brodo LB in vagamente 14 ml con tappo in polipropilene in una provetta a fondo tondo. LB brodo contiene antibiotici appropriati, nel nostro caso, la maggior parte dei ceppi mutanti sono resistenti alla kanamicina, 50 mg / ml </li><li> Il giorno successivo, Subculture ciascuna delle ON colture di ceppi di Salmonella in pianura 5 ml di brodo LB in un rapporto di 1:50 per un ulteriore 4 ore con agitazione a 220 rpm. </li><li> Leggi OD 600 valori di ogni coltura batterica su uno spettrofotometro, e ogni lettura dovrebbe variare 0,6-1,2 per ottimizzare Salmonella patogenicità isola-1 di tipo III, sistema di secrezione (SPI-1 TTSS) l&#39;espressione del gene per l&#39;invasione. </li><li> Utilizzare la formula di 1 OD 600 = 7,5 x 10 8 UFC / ml di valutare la concentrazione batterica, poi diluire batteri ad una concentrazione di 5 x 10 6 UFC / ml in mezzo di coltura cellulare fresca DMEM. </li></ol> 3 Invasion Assay in 96 pozzetti Cultura Piatto <ol><li> Rimuovere le tre cel 96 pozzettipiastre di l di coltura dalla CO 2 incubatore e lavare i pozzetti una volta con 200 ml di 1x tampone PBS. </li><li> Dopo il lavaggio e la rimozione completa di PBS, aggiungere 200 microlitri batteri in terreno DMEM (vedi sopra) in ogni pozzetto. Ciò si traduce in 1 x 10 6 cellule di Salmonella in ciascun molteplicità bene e di infezione (MOI) di 20: 1. </li><li> Centrifugare le piastre a 1000 xg in un vettore sigillata per 10 minuti, quindi sostituire piastre (tempo zero) a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 30 min. Per ogni ceppo, istituito almeno quattro pozzetti in duplicato. </li><li> Dopo 30 minuti, togliere le piastre dal termostato e lavare tre volte con 200 ml di PBS 1x per rimuovere i batteri non associati. </li><li> Dopo il lavaggio, salvare la piastra etichettato con &quot;associazione&quot; per un ulteriore trattamento. Aggiungere 200 ml di terreno DMEM contenente 100 mg / ml di gentamicina in ogni pozzetto delle piastre contrassegnati con &quot;invasione&quot; e &quot;replica&quot; per to uccidere la salmonella extracellulare. Riportare le piastre a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per un ora supplementare. </li><li> Salvare un bene da ogni ceppo infetto per registrare la conta delle cellule macrofagi, trattare il resto dei pozzi sul piatto &quot;associazione&quot; con 200 ml di 1x PBS contenente 1% Triton X-100 per 10 min. La soluzione Triton lisare cellule macrofagi e rilasciare Salmonella associata. </li><li> Harvest Salmonella da ogni pozzetto e metterli in 1,5 ml provette Eppendorf. Eseguire tre 10 diluizioni seriali di piegatura con 900μl 1x PBS sui campioni raccolti da ogni pozzetto, vortice viene eseguita tra ogni diluizione. </li><li> Piatto terza diluizione, 10 -3, sia su LB (WT) o LB Kan (mutanti) piatti. Etichettare le piastre con un&#39;adeguata nome Salmonella ceppo, numero di diluizione, il punto ora e la data. </li><li> Dopo vortex la terza provetta di diluizione, dispensare campione di 10 microlitri sulla superficie del agar e ripetere fnostri tempi per un totale di 5 gocce. Assicurarsi di spazio cinque 10 microlitri scende in modo uniforme sulle piastre di Petri piatto 7. </li><li> Dopo le gocce penetrare nel agar, girare i piatti più e incubare una notte a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore. </li><li> Trattare pozzi salvati per il conteggio dei macrofagi con 150 1XPBS microlitri contenenti 0,25% tripsina-EDTA per 10 min. </li><li> Dopo tripsinizzazione, posto macrofagi in 1,5 ml provette Eppendorf e li trattano con 50 ml di FBS per neutralizzare soluzione di tripsina / EDTA, colorano le cellule con 0,4% Trypan blu e punteggio attraverso l&#39;utilizzo emocitometro. </li><li> Una volta trascorso il incubazione di un hr, rimuovere il &quot;invasione&quot; e piatti &quot;replica&quot; dal CO 2 incubatore, lavare i pozzetti come &quot;Step 3.4&quot;. </li><li> Salvare la piastra &quot;invasione&quot; per un ulteriore trattamento come &quot;Step 3,6-3,12&quot;. </li><li> Aggiungere 200 ml di terreno DMEM contenente 10 mg / ml di gentamicina perla piastra &quot;replica&quot; per mantenere la clearance della Salmonella extracellulare nel mezzo. Riportare la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per un ulteriore 22,5 ore. </li><li> Il giorno seguente, rimuovere la piastra &quot;replica&quot; di 37 ° C, 5% CO 2 incubatore, lavare i pozzetti come &quot;Step 3.4&quot; e trattarli come &quot;Step 3,6-3,12&quot;. </li><li> Infine, rimuovere le piastre di agar dopo incubazione overnight a 37 ° C incubatore e segnare il numero di colonie batteriche. </li><li> Una buona distribuzione delle colonie deve essere compresa tra 10 e 100 colonie, ogni punto contiene circa 2 a 20 colonie, sarebbe difficile segnare se ci fossero più di 20 colonie su un punto. Se il conteggio è troppo bassa o troppo alta, replate il campione con 10-diluizioni maggiori o minori a seconda delle necessità. </li></ol> Analisi 4. Dati <ol><li> Calcolare i (unità di formazione di colonie per ml) CFU di ogni piatto in base alla placcaturavolume e fattore di diluizione. </li><li> Accertare il numero di Salmonella per macrofagi attraverso la conta delle cellule macrofagi registrato da ogni ceppo. </li><li> Calcolare le medie geometriche della CFU per macrofagi di almeno tre esperimenti indipendenti per associazione cellulare, invasione o la replica rispettivamente, e normalizzare ulteriormente la WT per il valore relativo. </li><li> Analizzare i dati per l&#39;associazione, l&#39;invasione, e la replica da parte di Student t-test, rispettivamente, confrontando ogni ceppo di WT, e determinare la significatività statistica del p-value. </li></ol>

<ol><li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonellae+interplay+with+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li>
<li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+intraleukocytic+bacteria+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics.</a> The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).</li>
<li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).</li>
<li>Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+invasion+and+adherence+directed+by+the+enterotoxigenic+Escherichia+coli+tib+locus+is+associated+with+a+104-kilodalton+outer+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein.</a> Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).</li>
<li>Behlau, I., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PhoP-repressed+gene+promotes+Salmonella+typhimurium+invasion+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.</a> J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).</li>
<li>Hueck, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li>
<li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li>
<li>Foster, J. W., Spector, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Salmonella+survive+against+the+odds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How Salmonella survive against the odds.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).</li>
<li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).</li>
<li>Molinari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li>
<li>Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+pathogenicity+island+1-independent+induction+of+apoptosis+in+infected+macrophages+by+Salmonella+enterica+serotype+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium.</a> Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).</li>
<li>Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+molecular+characterization+of+Salmonella+typhimurium+infection+in+neonatal+calves%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves.</a> Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).</li>
<li>Lawhon, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869(2011).</li>
<li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Il test di protezione gentamicina è ampiamente usato per studiare l&#39;invasione e la replica di batteri patogeni intracellulari all&#39;interno della cellula ospite, ed è soprattutto un importante strumento biologico per lo studio di agenti patogeni, come la Salmonella, la cui invasione è il passo presupposto indispensabile per l&#39;infezione 1. La protezione dosaggio standard di gentamicina nella comunità di ricerca di Salmonella è implementato in 24-ben piatto cultura 5. Anch...

Salmonella non tifoidi sono importanti cause di malattie enteriche in tutti i vertebrati. Salmonellosi nell&#39;uomo è tra le prime malattie di origine alimentare batterica 1. Caratterizzazione dei meccanismi molecolari che sono alla base delle interazioni di Salmonella con i loro host di origine animale è ottenuta principalmente attraverso lo studio di Salmonella enterica sierotipo Typhimurium (STM) in colture di tessuti e modelli animali di infezione. Guadagnando intuizioni nelle interazioni STM-ospite ci aiuterà a capire come Salmonella sopravvivere e crescere all&#39;interno di cellule ospiti. La prima sfida nello studio di queste interazioni è quello di identificare il maggior numero possibile di fattori che partecipano sia da ospite e patogeno, ma questi sforzi sono in gran parte ostacolato dalle notevoli difficoltà di trattare con due sistemi biologici complessi indipendenti simultaneamente, vale a dire, di accoglienza e di Salmonella, in condizioni fisiologiche. Inoltre, la grande repertoOire di Salmonella e geni ospitanti potenzialmente codificanti fattori coinvolti in interazioni ospite necessitano di high-throughput piattaforma biologico per affrontare questa sfida. Un modificato, test standardizzato per fenotipo associazione Salmonella, l&#39;invasione e la replica nei macrofagi con capacità high-throughput è stato sviluppato per esaminare un ampio set di geni probabilmente impegnati in interazioni Salmonella -host. Il saggio di protezione gentamicina è stato sviluppato nel 1973 2, ma è stato accuratamente descritto da Elsinghorst nel 1994 3,4. Ora è diventato uno strumento standard per lo studio di molti batteri patogeni intracellulari ex vivo, tra cui Salmonella 5,6. Batteri internalizzati evitare di essere ucciso da alcuni antibiotici, come la gentamicina, che non possono penetrare le cellule eucariotiche 3. Sfruttando questo fenomeno, il saggio protezione Gentamicina misura la sopravvivenza e la crescita di ba intracellularepatogeni cterial. Tre eventi durante l&#39;infezione, cioè, l&#39;associazione con le cellule eucarioti, l&#39;invasione e la replica, possono essere valutati per batteri patogeni intracellulari in base l&#39;intervallo di tempo tra l&#39;infezione, il trattamento Gentamicina, e in seguito di incubazione (Figura 1). Linee di cellule eucariotiche forniscono un ambiente fisiologico che è meno complessa di modelli animali per studi di interazione ospite-patogeno. Il test di protezione gentamicina è una piattaforma appropriata per studiare le interazioni STM-ospite, ma il test standard in un piatto di coltura 24 pozzetti num bassa velocità. Analisi computazionale dei set di dati in vivo identificato 149 prodotti genici Salmonella che si prevede di interagire con circa 300 prodotti genici ospite (dati non pubblicati). Il test di protezione gentamicina standard non ha la capacità di fenotipo questo numero di mutanti in modo efficiente. In Additione, il saggio di protezione Gentamicina può teoricamente rilevare l&#39;invasione di anche un singolo batterio. A causa di questa sensibilità intrinseca, i dati grezzi sono suscettibili di variazioni tecniche quando ripetuto in tempi diversi. I controlli interni e la presentazione dei dati relativi dopo la normalizzazione sono essenziali per l&#39;interpretazione significativa dei risultati. Alla luce di queste considerazioni, una versione modificata, standardizzato test di protezione gentamicina è stato sviluppato per migliorare la capacità di test e aumentare la precisione. Il protocollo seguito è dettagliata e illustrata per eseguire il test di protezione Gentamicina modificato utilizzando 96 pozzetti piatti della cultura e la linea cellulare di macrofagi RAW264.7 murino. Rispetto al protocollo standard a 24 pozzetti piastre di coltura, il protocollo modificato presenta i seguenti vantaggi: 1) Uso di 96 pozzetti piatti della cultura permette fino a 10 diversi ceppi mutanti per essere phenotyped compresi i controlli interni positivi e negativi con potenza statistica sufficiente;2) La varianza dei risultati è notevolmente ridotta, in quanto i ceppi mutanti vengono testate nello stesso piatto cultura e allo stesso tempo; 3) L&#39;uso di pipette multicanale aumenta il throughput riducendo la fatica dell&#39;operatore. Infine, il confronto a 24 pozzetti piastre di coltura, le preoccupazioni di meno cellule ospiti per pozzetto a 96-ben piatto cultura sono state affrontate attraverso l&#39;ottimizzazione e la standardizzazione del protocollo. In sintesi, la modifica, test standardizzato per vitro fenotipo Salmonella o altra associazione batterica, l&#39;invasione e la replica in fagociti aumenta la precisione e raggiunge la capacità high-throughput riducendo la fatica dell&#39;operatore.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Pallone per colture cellulari tappo filtrante ventilato</td><td>Nest Biotechnology</td><td>708003</td><td></td></tr><tr><td>100x Aminoacidi non essenziali</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>BD Falcon</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari a 96 pozzetti</td><td>Corning Incorporated</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) brodo</td><td>MP Biomedicals</td><td>3002-075</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Polipropilene Provetta a fondo tondo</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina soluzione</td><td>Sigma</td><td>K0254</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Tripano blu</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput assay per fenotipo salmonella enterica typhimurium associazione, invasion, e replica nei macrofagi

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Le specie Salmonella sono agenti patogeni zoonotici e principali cause di malattie di origine alimentare negli esseri umani e bestiame 1. La comprensione dei meccanismi alla base delle interazioni Salmonella -host sono importanti per chiarire la patogenesi molecolare di infezione da Salmonella. Il dosaggio di protezione gentamicina a fenotipo associazione Salmonella, l&#39;invasione e la replica in fagociti è stato adattato per consentire lo screening high-throughput per definire i ruoli dei mutanti di delezione di Salmonella enterica sierotipo Typhimurium nelle interazioni host utilizzando RAW 264.7 macrofagi murini. Nell&#39;ambito di questo protocollo, la varianza nelle misurazioni è significativamente ridotto rispetto al protocollo standard, perché wild-type e più ceppi mutanti possono essere testati nello stesso piatto di cultura e, allo stesso tempo. L&#39;uso di pipette multicanale aumenta la produttività e migliora la precisione. Inoltre, le preoccupazioni relative a usare meno host cellule per pozzetto in 96-ben piatto cultura sono stati affrontati. Qui, il protocollo della vitro Salmonella invasione test modificati utilizzando fagociti è stato impiegato con successo per fenotipo 38 singoli mutanti di delezione Salmonella per l&#39;associazione, l&#39;invasione e la replica intracellulare. I fenotipi in vitro sono presentati, alcuni dei quali sono stati successivamente confermato di avere in fenotipi vivo in un modello animale. Pertanto, la modifica, test standardizzato per fenotipo Salmonella associazione, l&#39;invasione e la replica nei macrofagi con capacità high-throughput potrebbe essere utilizzato più ampiamente per studiare le interazioni batteri-ospite.

Vedere i risultati rappresentativi (Figura 2) dopo che i dati sono tracciate in base alla fagocitosi test invasione delle cellule modificate. I dati comprendono cinque diversi ceppi, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutante A e B. mutante Δ Inva, noto per essere difettoso per l'invasione, e ΔphoP noti per essere difettoso per la replica 8, sono utilizzati come controlli positivi per valutare la validità sperimentale . Infatti, nel saggio di invasione modificato, un mutante Δin...

Un test high-throughput per fenotipo Salmonella in vitro o di altra associazione batterica, l&#39;invasione, e la replica in fagociti con capacità high-throughput è stato sviluppato. Il metodo è stato impiegato per valutare Salmonella gene knockout ceppi mutanti per il loro coinvolgimento in interazioni ospite-patogeno.

High-throughput Assay per Fenotipo Salmonella enterica Typhimurium Associazione, Invasion, e replica nei macrofagi

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di selezionare e valutare i geni necessari per l'invasione e/o la sopravvivenza all'interno delle cellule macrofagiche in vitro, in modo ad alto rendimento, e identificare i geni meccanicistici della patogenesi della salmonella. Ciò si ottiene aggiungendo ceppi di salmonella wild type o mutanti alle colture cellulari di macrofagi. In 96, piastre a pozzetti per 30 minuti come infezione in vitro come seconda fase dopo l'incubazione di 30 minuti, la salmonella che non si è attaccata alle cellule macrofagiche viene lavata via e fresca.Per un'ora viene aggiunto un terreno contenente un'alta concentrazione di antibiotico gentamicina, che uccide tutti i batteri extracellulari che non vengono internalizzati. Successivamente, la coltura cellulare di macrofagi viene nuovamente lavata e viene aggiunto un terreno fresco contenente una bassa concentrazione di gentamicina per un'ulteriore incubazione di 22,5 ore al fine di mantenere un ambiente extracellulare privo di batteri e consentire solo alla salmonella intracellulare di sopravvivere e proliferare. I risultati mostrano che, confrontando la salmonella mutante con il ceppo wild type, il fenotipo in vitro dei ceppi mutanti per l'invasione e la replicazione dell'associazione è determinato sulla base della misurazione delle unità di formazione di colonie per cellule macrofagiche ottenute dal saggio seriale di diluizione della placcatura per ogni punto temporale.Il vantaggio principale della nostra tecnica è che misura l'associazione, l'invasione e la replicazione di salmonella e cellule fagocitiche e che può misurare più ceppi contemporaneamente per una maggiore produttività. A dimostrare la procedura saranno il Dr.Jing Wu, ricercatore post-dottorato nel mio laboratorio, e la signora Roberta Pugh, ricercatrice associata nel mio laboratorio Per iniziare la fila, il numero di passaggi bassi, rispecchia le cellule macrofagiche grezze 2, 64, 0,7 in un pallone di coltura cellulare T 75 con un tappo filtrante ventilato in delcos aquile modificate medium, integrato con il 10% di siero bovino fetale, lo 0,5% di bicarbonato di sodio e l'1% 100 x aminoacidi non essenziali NEAA a 37 gradi Celsius in un Incubatore ad anidride carbonica al 5%.Quando le cellule raggiungono il 60-80% di confluenza, raccogliere le cellule in DMEM con un raschietto cellulare, quindi contare le cellule in un emocitometro e calcolare la concentrazione cellulare, diluire la sospensione cellulare a una concentrazione di 2,5 volte 10 per la quinta cellula per millilitro di coltura cellulare DMEM fresca. Piastra media: 200 microlitri di sospensione cellulare diluita utilizzando una pipetta multicanale in ciascun pozzetto di una piastra per coltura cellulare da 96 pozzetti, piastre in tre piastre separate da 96 pozzetti per una serie di test di invasione cellulare fagocitaria ed etichettare ciascuna piastra con l'associazione, l'invasione e la replicazione. Per ogni ceppo di salmonella vengono utilizzati quattro pozzetti per piastra.Posizionare le piastre in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius durante la notte per consentire alle cellule dei macrofagi di attaccarsi al fondo dei pozzetti lo stesso giorno. Le cellule grezze dei macrofagi 2, 6, 4, 0,7 vengono piastrate in piastre a 96 pozzetti. Scegliere singole colonie di salmonella entera wild type, sierotipo, tyria 1, 0, 4, 2, 8, delta, INVA, mutante, delta quattro P, e la coltura dei ceppi mutanti di prova desiderati.Ciascuno dei ceppi di salmonella in cinque millilitri di brodo LB e integrare il brodo LB per i ceppi mutanti Con 50 microgrammi per millilitro di micina può far crescere i batteri per 14 ore a 37 gradi Celsius con agitazione a 220 giri/min in tubi a fondo tondo in polipropilene da 14 millilitri con tappo largo. Dopo l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius, ciascuno dei ceppi di salmonella ha un rapporto da uno a 50 in cinque millilitri del rispettivo brodo da libbra. Coltiva le colture per altre quattro ore a 37 gradi Celsius con agitazione a 220 giri/min.Leggere i valori di OD 600 di ciascuna coltura batterica su uno spettrofotometro. Ogni coltura dovrebbe avere un valore OD 600 compreso tra 0,6 e 1,2 per ottimizzare la patogenicità della salmonella, isola, sistema di secrezione da uno a tre, SPI un sistema di secrezione di tipo tre, espressione genica per l'invasione. Calcola la concentrazione batterica usando la formula uno: OD 600 equivale a 7,5 volte 10 all'ottava unità formante colonie per millilitro.CFU quindi diluire i batteri a una concentrazione di cinque volte da 10 a sei, il FU per millilitro e tre millilitri di terreno di coltura cellulare DMEM fresco Rimuovere 3 piastre di coltura cellulare da 96 pozzetti contenenti macrofagi dall'incubatore ad anidride carbonica e lavare ciascuna pozzetto una volta con 200 microlitri di un XPBS. Dopo che il lavaggio PBS è stato completamente rimosso da ciascuno, aggiungere 200 microlitri di batteri in terreno DMEM in ciascun pozzetto. Ciò si traduce in una volta 10 alle sei cellule di salmonella in ciascun pozzetto e una molteplicità di MOI di infezione di 20 a uno, centrifugare le piastre in un contenitore sigillato a 1000 volte G per 10 minuti.Quindi posizionare le piastre in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Una volta completata l'incubazione di 30 minuti, rimuovere le piastre dall'incubatrice e lavare ogni pozzetto tre volte con 200 microlitri di un XPBS per rimuovere i batteri non associati. Successivamente, a 200 microlitri di terreno DMEM contenente 100 microgrammi per millilitro di gentamicina, a ciascun pozzetto delle piastre contrassegnato con invasione e replicazione per uccidere la salmonella extracellulare.Quindi rimetti le piastre in un incubatore al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un'altra ora. Per la piastra di associazione, conservare un pozzetto da ciascun ceppo infetto per registrare la conta delle cellule macrofagiche e trattare i pozzetti rimanenti con 200 microlitri di XPBS contenente l'1% di tritton X 100 per 10 minuti. Per affettare le cellule, raccogliere la salmonella da ogni pozzetto e metterle in provette da 1,5 millilitri eend orph Fare tre diluizioni di cereali decuplicate con 900 microlitri di un XPBS sui campioni raccolti da ciascun pozzetto e vorticare tra ogni vortice di diluizione la terza diluizione, da 10 a tre negativi per ogni batterio e posizionare 10 microlitri del campione su piastre LB per wild type o piastre LB.Con può micina per i ceppi mutanti. Ripetere questo passaggio quattro volte per un totale di cinque gocce da 10 microlitri distanziate uniformemente sulle piastre dopo che le gocce si sono immerse nell'agar, capovolgere le piastre e incubare per una notte In un'incubatrice a 37 gradi Celsius, trattare i pozzetti rimanenti risparmiati per il conteggio dei macrofagi con 150 microlitri di XPBS contenente lo 0,25% di TRIPSIN EDTA per 10 minuti. Dopo la tripsinizzazione, trasferire i macrofagi in provette da 1,5 millilitri e trattare con 50 microlitri di FBS per neutralizzare la soluzione di tryin EDTA.Quindi rimuovere 10 microlitri di sospensione cellulare da una provetta EOR in una nuova provetta. Aggiungere 10 microlitri di blu triano allo 0,4% per colorare le cellule e contarle in un emocitometro quando le piastre di invasione e replicazione hanno completato l'incubazione di un'ora nell'incubatore di anidride carbonica. Togliete le piastre dall'incubatrice e lavatele tre volte con 200 microlitri di XPBS.Successivamente, aggiungere 200 microlitri di terreno DMEM contenente 10 microgrammi per millilitro di gentamicina alla piastra di replicazione per mantenere la clearance della salmonella extracellulare nel terreno. Quindi posizionare la piastra in un incubatore al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per altre 22,5 ore. Quindi raccogliere e reflare la salmonella dalla piastra di invasione su piastre di agar e contare i macrofagi da un pozzetto di ciascun ceppo infetto seguendo i passaggi descritti per la piastra di associazione il giorno successivo.Rimuovere la piastra di replicazione dall'incubatore e lavare ogni pozzetto tre volte con 200 microlitri di un XPBS. Quindi raccogliere e reflazionare la salmonella dalla piastra di replicazione su piastre di agar e contare i macrofagi da un pozzetto di ciascun ceppo infetto seguendo i passaggi descritti per la piastra di associazione. Dopo che le piastre di agar sono state incubate per una notte in un'incubatrice a 37 gradi Celsius, rimuovere le piastre dall'incubatrice e valutare il numero di colonie batteriche per piastra.Quando si conta ogni piastra, la distribuzione delle colonie dovrebbe essere compresa tra 10 e 100 colonie. Se la conta è troppo alta o troppo bassa, reflazionare il campione con una diluizione dieci volte superiore o inferiore, a seconda delle necessità. Il test di invasione delle cellule fagocitiche identifica in modo appropriato il fenotipo dei mutanti di delezione della salmonella, come mostrato per il ceppo di controllo dell'invasione delta INVA, un mutante noto per difetto di invasione e il ceppo di controllo della replicazione delta quattro P.Un mutante mutante difettoso di replicazione noto A e un mutante B sono due ceppi rappresentativi che utilizzano questo protocollo che mostrano fenotipi alterati per la replicazione nei macrofagi 20 su 38. I mutanti di Salmonella testati finora nel test di invasione delle cellule fagocitiche mostrano difetti variabili ma significativi nell'associazione, nell'invasione e/o nella replicazione nei macrofagi grezzi 2, 6, 4, 0,7. Questo protocollo è stato testato solo per alcune cellule statiche nala e ad effetto ospite.Pertanto, la modifica e l'ottimizzazione saranno necessarie per altri batteri e cellule ospiti.

high-throughput-assay-to-phenotype-salmonella-enterica-typhimurium

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Jung, A. L. et. al., Vescicole della membrana esterna di Legionella pneumophila: isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatorio sui macrofagi. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra il pre-trattamento dei macrofagi con vescicole di membrana esterna (OMV) di Legionella pneumophila per esaminare il loro effetto sulla replicazione batterica. Alterando la segnalazione immunitaria dell'ospite, gli OMV rendono i macrofagi più permissivi all'infezione. Un numero più elevato di...

Saggio della replicazione di Legionella pneumophila nei macrofagi pretrattati con vescicole della membrana esterna

Questo video mostra un test per esaminare l'attività dipendente dal recettore toll-like (TLR) dei fattori di trascrizione fattore nucleare-kappa-B (NF-κB) e proteina attivatrice-1 (AP-1) nei macrofagi. I TLR innescano una cascata di segnalazione pro-infiammatoria dopo aver riconosciuto i pattern molecolari associati al danno (DAMP), attivando NF-κB e AP-1. I macrofagi reporter ingegnerizzati producono l'enzima fosfatasi alcalina embrionale (SEAP) secreto dopo l'attivazione di NF-κB e AP-1, che...

Un saggio per la segnalazione del fattore di trascrizione NF-&kcy;B/AP-1 TLR-dipendente nei macrofagi

Questo video mostra un test per quantificare la crescita intracellulare dei parassiti nei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM). Le cellule macrofagiche sono infettate dagli stadi invasivi mobili e non mobili della Leishmania, rispettivamente i promastigoti metaciclici e gli amastigoti. I parassiti invadono i macrofagi, interiorizzandosi in un vacuolo parassitoforo e moltiplicandosi all'interno. La crescita intracellulare del parassita viene quantificata utilizzando un microscopio dopo...

Un test in vitro per quantificare la crescita intracellulare del parassita nei macrofagi

Questo video mostra un test per quantificare la Salmonella typhimurium citosolica e vacuolare all'interno di macrofagi derivati dal midollo osseo utilizzando la permeabilizzazione differenziale. I macrofagi sono infettati da una proteina fluorescente che esprime Salmonella, che viene internalizzata all'interno di una struttura vacuolare specializzata chiamata vacuolo contenente Salmonella o SCV. Un sottogruppo di batteri sfugge all'SCV ed entra nel citosol. La membrana plasmatica ricca di...

Un test per quantificare la salmonella citosolica e vacuolare nei macrofagi primari infetti

La genetica in avanti è un potente approccio per identificare i geni nei patogeni intracellulari importanti per la resistenza all'immunità autonoma cellulare. L'approccio attuale utilizza cellule immunitarie innate, in particolare macrofagi, per identificare nuovi geni Toxoplasma gondii importanti per l'evasione immunitaria.

Forward Genetica schermi usando macrofagi per identificare<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; geni importanti per la Resistenza di IFN-γ-Dependent cellulare Immunità autonoma

Descriviamo la quantificazione di Salmonella typhimurium citosolica e vacuolare nei macrofagi derivati dal midollo osseo utilizzando la permeabilizzazione differenziale della digitonina.

Quantificazione dei citosolico vs. vacuolare<em&gt; Salmonella</em&gt; In primarie macrofagi di Permeabilization differenziale

È stato sviluppato un test in tempo reale ad alta produttività per identificare contemporaneamente (1) antimicrobici penetranti nelle cellule eucariotiche che prendono di mira un patogeno batterico intracellulare e (2) valutare la citotossicità delle cellule eucariotiche. Una variante della stessa tecnologia è stata successivamente combinata con la tecnologia di dispensazione digitale per consentire studi di sinergia facili, ad alta risoluzione, dose-risposta e bidimensionali e tridimensionali.

High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

Nuovi modelli e saggi che migliorerebbero il processo di sviluppo precoce dei farmaci antitubercolari di prossima generazione sono altamente auspicabili. Qui, descriviamo un test rapido, economico e compatibile con BSL-2 per valutare l'efficacia del farmaco contro il Mycobacterium tuberculosis che può essere facilmente adattato per lo screening ad alto rendimento.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Descriviamo qui un metodo semplice e rapido per l'isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi rivestendo i batteri con biotina e streptavidina.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Questo protocollo fornisce ai ricercatori un metodo rapido e indiretto per misurare l'attività del fattore di trascrizione NF-B-B/AP-1 dipendente da TLR in una linea cellulare murina di macrofaci in risposta a una varietà di superfici polimeriche e strati proteici adzuolabili che modellano il microambiente implantare biomateriale.

Un analisi della cella del Macrophage Reporter per esaminare la segnalazione NF-kB/AP-1 mediata da un rata a tollo su superfici polimetiche

La Salmonella invade e si replica all'interno delle cellule epiteliali intestinali sia nei vacuoli specifici della Salmonella che libera nel citosol (iperreplicazione). Un protocollo basato sulla microscopia a fluorescenza ad alta produttività è descritto qui per quantificare i fenotipi intracellulari di Salmonella mediante due analisi di immagini complementari attraverso ImageJ, raggiungendo la risoluzione e il punteggio di una singola cellula.

Analisi automatizzata dei fenotipi intracellulari di Salmonella con ImageJ

Scopri un saggio ad alto rendimento per valutare l'associazione, l'invasione e la replicazione di Salmonella enterica nei macrofagi. Questo metodo identifica i geni meccanistici della patogenesi batterica.

High-throughput Assay per Fenotipo Salmonella enterica Typhimurium Associazione, Invasion, e replica nei macrofagi

Esplora altri video