Name: Zinc-finger nucleasi avanzata gene targeting in cellule staminali embrionali umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Scopri il targeting genico avanzato con nucleasi a dito di zinco in cellule staminali embrionali umane. Questo metodo facilita la ricombinazione omologa efficiente nel locus PITX3 per studiare lo sviluppo del sistema nervoso centrale.

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Il lavoro descritto in questo protocollo è stato reso possibile da un finanziamento da parte del governo vittoriana come parte di un&#39;alleanza di collaborazione con l&#39;Istituto californiano per la medicina rigenerativa (CIRM).

Tutte le procedure sono eseguite in una cappa a flusso laminare sterile. Tutti i mezzi e le soluzioni sono equilibrati a 37 ° C se non diversamente specificato. 1 Espansione di PSC umani (hESC e hiPSCs, WA-09 utilizzato in questo protocollo) per la trasfezione Nota: Non è necessario espandere hESC su Matrigel o Geltrex. hESC espanse su fibroblasti embrionali di topo (MEF) possono essere utilizzati per elettroporazione o nucleofection a seguito di una fase di rimozione MEF (vedi sezione 2.8). <ol><li> Preparare 1 x 100 mm piatto e 1 x boccetta 75cm2 di DR4 MEF a 2,0 x 10 4 cellule per cm 2 in mezzi MEF (vedi Tabella 1) su piatti pre-rivestite con 0.1% w / v di gelatina. Nota: CF1, BLK6 o MF1 MEF può essere utilizzato, tuttavia, si consiglia di utilizzare le linee MEF resistenti agli antibiotici, per esempio, DR410. </li><li> Il giorno successivo, hESC passaggio su un piatto da 100 millimetri pre-placcato con MEF preparati in sezione 1.1. Per fare questo ASPItasso hESC supporti da culture piatti, lavare hESC con soluzione salina bilanciata Ca2 + / Mg2 + Hanks -free &#39;(HBSS), aggiungere dispasi (vedi Tabella 2 per volumi adeguati) e posto in un incubatore umidificato a 37 ° C / 5% di CO 2. Dopo 3-5 minuti di incubazione, aspirare dispasi e delicatamente lavare 1 - 2 volte con HBSS per rimuovere MEF. Aggiungere i media hESC (vedi tabella 3) e utilizzando un raschietto cellulare, o 5 ml pipetta, raschiare delicatamente le colonie sulla superficie del piatto cultura. </li><li> Raccogliere i frammenti di colonie in sospensione dal piatto di coltura in una provetta da centrifuga 15 ml. Piatto cultura Sciacquare con i media hESC e trasferimento al tubo da 15 ml. Fare attenzione a non rompere grumi in cellule singole o in piccoli frammenti. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 160 xg per far sedimentare frammenti di colonia. </li><li> Aspirare il surnatante. Toccare fondo della provetta 15 ml con il dito per allentare colonia frammento pellet. Frammenti di colonia delicatamente risospendere in hESC supporti in base al rapporto di divisione (normallya divisi rapporto tra 1: 4 e 1: 8 è appropriato). Fare molta attenzione a non rendere grumi nelle singole cellule o piccoli frammenti come questo influenzerà replating efficienza. </li><li> Prima di replating frammenti hESC sul MEF di lavaggio 1X con HBSS. Lentamente aggiungere una quantità appropriata (vedi Tabella 2) di sospensione cellulare contenente frammenti hESC nei media hESC ai piatti pre-placcati con MEF. </li><li> Posizionare piatti della cultura sulla mensola in incubatrice e muoversi lentamente avanti e indietro e un lato all&#39;altro per distribuire uniformemente frammenti di colonia. </li><li> Sostituire i media hESC quotidiana. </li><li> Per preparare mezzi condizionati dal MEF (MEF-CM) lavare 75 cm 2 fiasco pre-plated con MEF 1 x con HBSS. Aggiungi i media hESC. Dopo 24 ore, raccogliere condizionata media e sostituire con i media hESC fresca. Ripetere ogni giorno per un massimo di 12 giorni. Conservare MEF-CM a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 2 Preparazione dei CES umane per la trasfezione <ol><li> Osservare la crescita di hESCsotto un microscopio giornaliero. Quando le colonie diventano 40-50% confluenti, la piastra 3 x 100 mm con piatti 2,0 x 10 5 MEF per cm 2. </li><li> Quando le colonie diventano 60 - 70% confluenti sono pronti per essere transfettate. &quot;Sposo&quot; colonie rimuovendo colonie differenziate o per anime colonia. Nota: Come crediamo maggiore trasfezione e l&#39;efficienza di targeting si verificano quando le cellule sono in fase di crescita di registro, si suggerisce di elettroporazione essere effettuati prima di hESC raggiungano ≥ 70% di confluenza. </li><li> Lavare colonie hESC con HBSS e aggiungere Accutase. Nota: Non è necessario hESCs pretrattare con inibitore ROCK Y-27632 inibizione sufficiente si verifica quando incubati con Y-27632 durante la fase 2.7 </li><li> Incubare per 10 - 20 min a 37 ° C / 5% di CO 2 fino colonie sono resi singole cellule come visto sotto un microscopio. Cellule Triturare con una pipetta 1 ml. </li><li> Aggiungi i media hESC e filtro in un tubo da 15 ml con un straine 40 micron cellar per rimuovere grumi di cellule. </li><li> Centrifugare a 160 xg per 5 min. Risospendere il pellet di cellule nei media hESC freschi e ripetere per rimuovere ogni residuo di soluzione Accutase. </li><li> Risospendere le cellule in mezzi hESC contenente 10 mM Y-27632 e trasferire la sospensione cellulare totale per un piatto 100 millimetri pre-rivestito con gelatina. </li><li> Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per almeno 30 min. </li><li> Durante questo periodo MEF aderirà al piatto di gelatina rivestito. Raccogliere hESC non aderenti con una pipetta 1 ml in una nuova provetta da centrifuga 15 ml e determinare la densità delle cellule utilizzando un emocitometro. </li></ol> 3. Elettroporazione di hESC <ol><li> Supporti CM-MEF filtro con un filtro da 0,22 micron e aggiungere 10 ng / fattore di crescita dei fibroblasti ml ricombinante umano 2 (rhFGF2). </li><li> Trasferire 7,5 x 106 hESC da sezione 2.9 a un nuovo tubo da 15 ml e centrifugare a 160 xg per 5 min. </li><li> Durante questo tempo impostato il elettroporatore: Scegliere il programma per ele esponenzialectroporation e impostare i seguenti parametri, Tensione: 250 V, Capacità: 500 uF, e Resistance: ∞-. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 0,8 ml di ghiacciata 0,22 micron filtrato HBSS. Trasferire la soluzione in una sterile 0,4 centimetri elettroporazione cuvetta. </li><li> Aggiungere TV-hPITX3-forward il targeting costrutto (30 mg DNA) e mescolare delicatamente con una pipetta 200 microlitri. Incubare in ghiaccio per 5 min. Durante questo tempo togliere un&#39;aliquota di PITX3 ZFN mRNA e sbrinamento sul ghiaccio. Quando scongelato trasferimento di 7,5 ml di ZFN mRNA a DNA miscela / cellula elettroporazione cuvetta. Mescolare delicatamente con una pipetta 200 microlitri. Nota: Il locus nel mirino è il fattore principale che contribuisce alla efficienza di targeting. Codifica Loci geni silenti, i geni non espressi in CES, come PITX3 sono difficili da indirizzare utilizzando convenzionale ricombinazione omologa 6. Così, questo protocollo utilizza progettato su misura ZFNs per il locus PITX3 umano per indurre un DNA a doppio filamento break. </li><li> Elettroporazione seguendo le istruzioni sullo schermo sul elettroporatore. </li><li> Usando una pipetta 200 ml trasferire il contenuto della cuvetta elettroporazione ad una provetta da 15 ml contenente 10 ml supporti hESC. Lavare la cuvetta due volte con 200 ml di media hESC ogni volta e trasferire in una provetta da 15 ml. Ci saranno &quot;muco-come&quot; detriti costituito da DNA e proteine ​​dalle cellule lisate che avrà un impatto negativo la sopravvivenza delle cellule. Centrifugare a 160 xg per 5 minuti per rimuovere questi detriti. </li><li> Aspirare il surnatante e picchiettare delicatamente pellet di cellule per allentare. Risospendere in 30 ml completati MEF-CM contenenti 10 mM Y-27632 e replate composta da 3 x 100 mm preplated piatti con MEF. </li><li> Modificare i media giornaliera. Il giorno 2, Y-27632 può essere ritirata e cellule cresciute in soli mezzi hESC. </li><li> Dopo 2-3 giorni le hESC devono essere 50-70% confluenti. A questo punto iniziare selezione antibiotica (ad esempio, 0,5 mg / ml puromicina). </li><li> Mantenere selezione aggiungendo fresco dei media hESC / puromicina quotidiana. Dopo ~ 7 giorni piccole colonie dovrebbero essere visibili. Se non si utilizzano MEF resistenti agli antibiotici, MEF può essere completata con l&#39;aggiunta di un ulteriore 1,0 x 10 4 cellule per cm 2. </li></ol> 4. Picking cloni transgenici hESC <ol><li> Circa 14-21 giorni dopo la selezione (quando le colonie hanno raggiunto il diametro di circa 1 mm) preparano piatti per l&#39;espansione e lo screening. Inizia sbrinamento un&#39;aliquota di Matrigel o Geltrex a 4 ° C per un minimo di 5 ore. Diluire come da istruzioni del fabbricante e aggiungere 75 microlitri di ciascun pozzetto di piastre 3 x 96 pozzetti. Preparare piatti 3 x 48 pozzetti da placcatura MEF a 2,0 x 10 4 cellule per cm 2. Incubare entrambe le piastre O / N a 37 ° C / 5% di CO 2. </li><li> Il giorno seguente sezionare colonie in 16-25 parti usando un ago G 21 sulla estremità di una pipetta 2 ml tagliando una griglia. </li><li> Aspirare Matrigel da piastre da 96 pozzetti e sostituirlo con supplemsupporti ENTED CM-MEF. Lavare MEF in piastre 48 pozzetti 1 x con HBSS e aggiungere i media hESC. </li><li> Usando una pipetta 200 microlitri delicatamente trasferire un terzo della colonia sezionato in una piastra a 48 pozzetti per l&#39;espansione. Trasferire l&#39;altra 2/3 della colonia sezionato in una piastra a 96 pozzetti contenenti corrispondente completati supporti CM-MEF. </li><li> Mantenere entrambe le piastre cambiando media giornaliera (integrato multimediale CM-MEF per Matrigel piastre rivestite da 96 pozzetti e hESC supporti per le piastre 48 pozzetti contenenti MEF, entrambi integrati con 0,5 mg / ml puromicina). </li><li> Espandere fino piastre a 96 pozzetti sono al 100% confluenti e quindi inizialmente schermo tramite PCR. </li></ol> 5. Screening ed espansione di cloni positivi <ol><li> Per preparare il DNA genomico (metodo basato su 11) Rimuovere qualsiasi supporto dalle lastre invertendo, quindi asciugare su carta assorbente. </li><li> Lavare ogni pozzetto due volte con PBS RT (100 l / pozzetto ogni lavaggio), invertito e macchia come per il passo 5.1. Posizionare le piastre a -80 ° C fo 1 - 2 ore per aiutare a lisi cellulare (piastre possono essere conservate a tempo indeterminato come questo). </li><li> Mentre le cellule sono a -80 ° C fare sarcosyl Lysis Buffer (vedi tabella 4) (50 ml / pozzetto). Per lisare cellule, piatti caldi per 5 minuti a temperatura ambiente poi tampone di lisi pipetta in ciascun pozzetto. Sigillare i bordi di ogni piatto con del nastro, posto in un contenitore sigillabile contenente tovaglioli di carta umidi per creare l&#39;umidità, e incubare O / N a 60 ° C. </li><li> Dopo l&#39;incubazione aggiungere 150 ml di NaCl 5M a 10 ml di -20 ° C etanolo assoluto, mescolare bene e aggiungere 100 ml a ciascun pozzetto (Nota: etanolo andrà nuvoloso quando viene aggiunto NaCl). Piastre Toccare delicatamente per mescolare (non pipetta) e lasciare per un minimo di 30 minuti a temperatura ambiente. Durante questo tempo la soluzione andrà chiaro e il DNA viene precipitato. </li><li> Rimuovere la soluzione come al punto 5.1 quindi aggiungere 150 ml di etanolo al 70% in ogni pozzetto. Capovolgere piastra delicatamente e asciugare come prima. Ripetere questa operazione un ulteriore 2x. Nota: Poiché il DNA precipitato naturalmente aderes per la plastica coltura di tessuti non diventa sloggiato durante queste fasi di lavaggio.) </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio piatti brevemente centrifugare alla massima velocità per concentrare il DNA al fondo di ciascun pozzetto poi asciugare a temperatura ambiente (o 37 ° C) per almeno 30 min. </li><li> Aggiungere 40 - 50 ml T0.1E (pH8.0) (vedi tabella 5) o TE (pH8.0) ad ogni pozzetto e posizionare le piastre a 65 ° C per 1 ora o al 4 ° CO / N prima di utilizzare per la PCR. Risospendere il DNA toccando delicatamente i lati della piastra. Utilizzare 1-2 ml di ri-sospensione DNA / 10 microlitri reazione PCR. </li><li> Utilizzando il Expand lunga Template PCR con hPITX3 L braccio gen. F e hPITX3 L primer braccio GFP R eseguono lo screening iniziale di cloni a 58 ° C ricottura, 45 sec estensione, 35 cicli. </li><li> Campioni elettroforesi con 1kb Hyperladder in un gel di agarosio 1% contenente GelRed a 100 V per 45 minuti e rilevare cloni positivi mediante illuminazione UV. </li><li> Convalidare PCR cloni positivi per digestione del DNA genomico da Expacloni nded (vedi sotto) con HindIII e ibridazione sonde 5 &#39;e 3&#39; dei bracci vettore omologia con un Southern blot (come descritto in precedenza al punto 1). Le sonde sono generati mediante PCR utilizzando coppie di primer hPITX3 5 &#39;della sonda F e R, e hPITX3 3&#39; della sonda F e R, digerito con EcoRI e ligato in un vettore generale clonazione. </li><li> A seconda del numero di cloni positivi, preparare due pozzetti di una piastra da 6 pozzetti pre-placcatura con MEF (2,0 x 10 4 cellule per cm 2). </li><li> Il giorno successivo pretrattare cloni positivi nella piastra a 48 pozzetti con 10 mM Y-27632 per un minimo di 1 ora. </li><li> Lavare cloni positivi con HBSS e aggiungere 300 ml di Accutase. </li><li> Quando le colonie sono resi singole cellule, aggiungere 1 ml di media hESC e raccogliere in una provetta da 15 ml. </li><li> Modificare i media giornaliera. Il giorno 2, Y-27632 può essere ritirato e le cellule coltivate in hESC media. </li><li> Quando le colonie sono il 70 - 80% confluenti, sottocultura e congelare il resto della coloframmenti di NY. </li></ol>

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<li>Smidt, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homeodomain+gene+Ptx3+has+highly+restricted+brain+expression+in+mesencephalic+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La generazione di linee cellulari giornalista offre un potente mezzo per monitorare, visualizzare e isolare le cellule di interesse da una popolazione eterogenea derivato da hESC. Tuttavia, gene targeting via convenzionale ricombinazione omologa ha dimostrato di essere estremamente inefficiente per CES umani 3. In questo protocollo si descrive una tecnica relativamente semplice per l&#39;introduzione di una RP in esone uno dei locus PITX3, in hESC utilizzando un vettore targeting ampiamente disponibi...

Cellule staminali embrionali (ESC) protocolli di differenziazione correnti provocano popolazioni cellulari eterogenee, soprattutto per quanto riguarda la derivazione di specifici fenotipi neuronali. Così, anche se le culture contengono il fenotipo cellulare desiderato, altro neuronale, tipi di cellule non-neuronali e non-differenziati sono spesso presenti 1. Queste caratteristiche limitano l&#39;applicazione del CES derivato fonti di cellule per l&#39;uso in terapia di sostituzione cellulare e nella modellazione delle malattie vitro. Linee cellulari giornalista genetici offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse, a condizione che l&#39;espressione della proteina reporter (RP) riproduce l&#39;espressione endogena. L&#39;uso di promotori immediatamente a monte di una regione del gene codificante può essere usata per derivare reporter genetici grezzi ma tali costrutti mancano i precisi elementi regolatori che controllano l&#39;espressione del gene endogeno. Al contrario, la ricombinazione omologa offre laopportunità di garantire l&#39;espressione ad alta fedeltà del RP. In passato, il targeting vettori progettati per ricombinazione omologa a specifici loci di interesse sono stati utilizzati per RP di topo (CES mESCs) bersaglio utilizzando elettroporazione come mezzo di consegna DNA 1,2. Tuttavia la generazione di linee cellulari giornalista via convenzionale ricombinazione omologa è estremamente inefficiente per CES umane (hESC), e, quindi, è stata documentata solo in una manciata di casi (recensito in 3). Utilizzando una proteina chimerica ingegneria contenente una fusione di una nucleasi Fok I con motivi zinc-finger site-specific, conosciuti collettivamente come zinc-finger nucleasi (ZFNs), DNA rotture del doppio filamento possono essere introdotti a livello pre-determinati loci genomici. Quando si aggiunge un vettore di DNA con omologia a entrambi i lati del DNA rottura a doppio filamento, il sito genomico può essere riparato tramite ricombinazione omologa, consentendo l&#39;inserimento della sequenza di DNA donatore. Questa tecnica si è dimostrata utile fo editing genomico in cellule primarie umane 4,5 e 6,7 hESC. Più recente lavoro ha utilizzato trascrizione attivatore-come effettrici nucleasi (Talens), fattori di trascrizione utilizzati da impianti patogeni 8, per aiutare nella progettazione di site-specific nucleasi 9. Nel seguente protocollo dimostriamo la generazione di una linea cellulare hESC giornalista da elettroporazione di un EGFP contenente omologa vettore targeting 6 insieme ZFNs per l&#39;homeobox pituitaria umana 3 (PITX3) locus. Dopo la selezione antibiotica per 2-3 settimane, hESC con il DNA integrato correttamente possono essere raccolti manualmente, ampliati e proiettati inizialmente tramite PCR, e successivamente convalidati da Southern blotting.

<table><tbody><tr><td>Fibroblasti embrionali di topo (DR4)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6004G</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1683</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare - 40 &mu; m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>33 mm - 0,22 &mu; m filtro</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>rhFGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>Elettroporatore</td><td>BioRad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta per elettroporazione da 0,4 cm</td><td>BioRad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>Costrutto di puntamento in avanti TV-hPITX3 umano</td><td>Addgene</td><td>31942</td><td></td></tr><tr><td>ZFN Kit; Human PITX3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CKOZFN1050-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato, inattivato dal calore, origine statunitense (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di terreno/nutrienti Dulbecco's Modified Eagle F-12 (DMEM/F12)</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Sostituzione del siero KnockOut (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali MEM&nbsp; (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-mercaptoetanolo</td> Life <td>Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di sale sodico N-Lauroilsarcosina (Sarcosyl) (30%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61747</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e9884?lang=en&amp; region=US">E9884</a></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di proteinasi K (20 mg/ml)</td><td>Bioline Australia</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>Espandi il sistema PCR a modello lungo</td><td>Roche Australia</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L braccio gen. F (primer): 5' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3'</td><td>GeneWorks, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L braccio GFP R (primer): 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3'</td><td>GeneWorks, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 1 kb&nbsp;</td><td>Bioline Australia</td><td>BIO-33025</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Jomar Bioscience, Australia</td><td>41003</td><td></td></tr></tbody></table>

zinc-finger nucleasi avanzata gene targeting in cellule staminali embrionali umane

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

Una limitazione importante con cellule staminali embrionali (ESC) protocolli di differenziazione attuali è la generazione di popolazioni cellulari eterogenee. Queste culture contengono le cellule di interesse, ma sono anche contaminati con i CES indifferenziate, derivati ​​non-neurali e altri sottotipi neuronali. Questo limita il loro uso in vitro ed in vivo applicazioni, come la modellazione in vitro per la scoperta di farmaci o terapia di sostituzione cellulare. Per aiutare a superare questo, linee cellulari giornalista, che offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse, possono essere progettati. Tuttavia, per raggiungere questo obiettivo in cellule staminali embrionali umane via convenzionale ricombinazione omologa è estremamente inefficiente. Questo protocollo descrive il targeting della homeobox pituitaria 3 (PITX3) locus in cellule staminali embrionali umane utilizzando progettati su misura nucleasi zinc-finger, che introducono site-specific doppio filamento rotture del DNA, insieme ad unPITX3 - EGFP -specifica vettore donatore del DNA. Dopo la generazione della linea cellulare PITX3 giornalista, può quindi essere differenziato utilizzando protocolli pubblicati da utilizzare in studi in vitro come modelli di malattia o terapia di sostituzione cellulare di Parkinson.

A seguito di co-elettroporazione della PITX3 coppia zinc-finger personalizzato progettato insieme al PITX3 - EGFP DNA -specifica donatore vettore, e la successiva selezione puromicina, hESC cloni positivi sono stati inizialmente rilevati tramite lo screening genomico PCR (Figura 1). Southern blot ibridazione di questi cloni positivi PCR con 5 'e 3' sonde specifiche confermato corretto il targeting to esone 1 del locus PITX3 (Figura 2), con un rendimen...

Linee cellulari Reporter offrono un mezzo per visualizzare, monitorare e isolare le cellule di interesse da popolazioni eterogenee. Tuttavia,-gene targeting utilizzando convenzionale ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali umane è estremamente inefficiente. Qui, descriviamo il targeting CNS mesencefalo specifico PITX3 locus fattore di trascrizione con EGFP utilizzando zinc-finger nucleasi avanzata ricombinazione omologa.

Zinc-finger nucleasi avanzata gene targeting in cellule staminali embrionali umane

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di indirizzare in modo efficiente i transgeni ai loci di interesse nelle cellule staminali embrionali umane utilizzando nucleasi a dita di zinco progettate su misura per fare ciò. Le cellule staminali embrionali umane o HSC vengono espanse per generare materiale sufficiente per l'elettroporazione, quindi digerite per produrre singole cellule. Successivamente, l'mRNA che codifica per due nucleasi a dita di zinco dal design personalizzato viene co-elettroporato nelle HSC con la sequenza donatrice di EGFP linearizzata e le cellule vengono quindi piastrate su embrionali di topo freschi, fibroblasti o MEF.Le nucleasi elettroporate a dita di zinco introducono una rottura a doppio filamento nel primo esone della fossa X tre locus nelle cellule. Quindi la sequenza del donatore EFGP, che è affiancata da bracci di puntamento con omologia con la sequenza del sito del doppio filamento di DNA del freno, viene incorporata durante la divisione cellulare dopo 14-21 giorni. Un terzo di una singola colonia di HESC viene fatto passare su ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti rivestita con matrigel e gli altri due terzi viene trasferito in un pozzetto corrispondente di una piastra da 48 pozzetti contenente ME Fs fresco. Quando le cellule sulle piastre da 96 pozzetti raggiungono la cofluenza, vengono sottoposte a screening per l'incorporazione della sequenza del donatore mediante PCR.Viene quindi eseguito il Southern blotting per confermare la corretta integrazione. Una volta confermati i cloni positivi, vengono espansi e quindi congelati per un ulteriore utilizzo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alla metodologia esistente, come la ricombinazione omologa convenzionale, è che le dita di zinco creano rotture predeterminate del doppio filamento di DNA, che facilitano l'efficiente targeting dei transgeni per predeterminare i loci nelle cellule staminali embrionali umane.Sebbene qui introduciamo un gene trans nel locus della fossa X tre delle cellule staminali umane, questo metodo può essere adattato a qualsiasi altro sistema in cui l'uso di linee cellulari reporter sarebbe vantaggioso. Iniziare questo protocollo espandendo le cellule staminali embrionali umane o HSC per la trasfezione come descritto nel documento di accompagnamento. Quando le colonie diventano confluenti al 60-70%, posizionare la piastra di coltura tissutale su un microscopio da dissezione.Utilizzare un ago calibro 21 all'estremità di una pipetta da due mil litri per pulire le colonie rimuovendo le colonie differenziate o i nuclei delle colonie. Successivamente, per lavare le colonie HESC, aspirare il terreno. Quindi aggiungere cinque millilitri di HBSS e incubare per due minuti.Dopo l'aspirato di incubazione, l'HBSS aggiunge cinque millilitri di Accutane e incuba per 10-20 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 fino a quando le colonie non sono trasformate in singole cellule come osservate al microscopio. Utilizzando una pipetta da un millilitro, triturare le cellule. Quindi, aggiungere 10 millilitri di terreno HESC e, utilizzando un colino cellulare da 40 micron, filtrarlo in una provetta conica da 15 millilitri.Per rimuovere eventuali grumi di cellule, centrifugare il flusso a 160 volte la gravità per cinque minuti. Dopo la centrifuga Resus, sospendere il pellet cellulare in cinque millilitri di terreno HESC fresco e centrifugare di nuovo per rimuovere eventuali residui di soluzione di Accutane. Risospendere le cellule in terreno HESC contenente 10 micromolari Y 2 7 6 3 2 e trasferirle in un piatto da 100 millimetri pre-rivestito con gelatina incubata a 37 gradi Celsius, 5% CO2 per un minimo di 30 minuti.Durante questo periodo, i MEF aderiranno al piatto rivestito di gelatina. Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta da un millilitro per raccogliere le SSC HE non aderenti in una provetta da centrifuga fresca da 15 millilitri e determinare la densità cellulare utilizzando un emocitometro in preparazione per l'elettroporazione. Trasferire 7,5 milioni di HSC come preparato nella sezione precedente di questo video in una nuova provetta conica da 15 millilitri e centrifugare a 160 volte la gravità per cinque minuti.Dopo la centrifuga Resus, sospendere il pellet cellulare in 0,8 millilitri di HBSS filtrato a 0,22 micron ghiacciato e trasferire la soluzione a un veterinario sterile per elettroporazione da 0,4 centimetri. Quindi, aggiungere 30 microgrammi di TVH pit X three forward targeting. Costruire il DNA e mescolare delicatamente con una pipetta da 200 microlitri, incubare su ghiaccio per cinque minuti durante l'incubazione, scongelare e aliquotare il nocciolo X, tre mRNA ZFN su ghiaccio.Una volta scongelato, trasferire 7,5 microlitri nella miscela di cellule di DNA nell'elettroporazione Q vet mescolata delicatamente con una pipetta da 200 microlitri. Premere il pulsante rosso sull'elettro per trasfettare le celle. Quindi, utilizzando una pipetta da 200 microlitri, trasferire il contenuto dall'Electroporation Q Vet a una provetta da 15 millilitri contenente 10 millilitri di terreno HESC.Lavare due volte il Q VET con 200 microlitri di terreno HESC e raccogliere le soluzioni di lavaggio nello stesso tubo da 15 millilitri. Per rimuovere il muco risultante come detriti costituiti da DNA e proteine dalle cellule lisate. Centrifugare a 160 volte la gravità per cinque minuti.Dopo la centrifuga, aspirare il surnatante e picchiettare delicatamente il pellet cellulare per sciogliere la spesa di Reese in 30 millilitri. M-E-F-C-M integrato con RH FGF due e 10 micromolari Y 2 7 6 3 2 e piastra su tre piastre da 100 millimetri contenenti MEF. Incubare a 37 gradi Celsius 5% CO2 95% O2.Cambiando il terreno ogni giorno il secondo giorno, prelevare Y 2 76 32 e lordare le celle solo nel terreno HESC. Dopo due o tre giorni, l'HES CS dovrebbe essere confluente al 50-70% a questo punto. Inizia la selezione degli antibiotici.Mantenere la selezione aggiungendo HESC fresco per terreno di coltura della micina al giorno. Dopo circa sette giorni, piccole colonie dovrebbero essere visibili se non vengono utilizzati MEF resistenti agli antibiotici. I MEF possono essere integrati aggiungendo un ulteriore uno per 10 celle del quarto per centimetro quadrato.Da 14 a 21 giorni dopo la selezione, quando le colonie hanno raggiunto circa un millimetro di diametro. Preparare le piastre per l'espansione e la vagliatura aggiungendo 75 microlitri di matrigel o gel TRE a ciascun pozzetto di 3 96. Le piastre a pozzetti preparano anche 3 piastre da 48 pozzetti di MEF a due volte da 10 a 4 cellule per centimetro quadrato, incubano entrambe le serie di piastre durante la notte a 37 gradi Celsius, 5% di CO2 il giorno successivo.Utilizzare un ago da 21 gauge all'estremità di una pipetta da due millilitri per sezionare le colonie di HESC in 16-25 pezzi tagliando una griglia. Successivamente, aspirare il matrigel da piastre a 96 pozzetti e sostituirlo con il terreno CM MEF integrato con R hf, GF due e per micina. Lavare i MEF nelle piastre a 48 pozzetti con HBSS e quindi aggiungere il terreno HESC con per micina utilizzando una pipetta da 200 microlitri.Trasferire delicatamente un terzo della colonia sezionata in una piastra da 48 pozzetti per l'espansione. Trasferire gli altri due terzi della colonia sezionata nella corrispondente piastra a 90 pozzetti contenente il terreno C-M-M-E-F integrato. L'aspetto più difficile di questa procedura è il trasferimento di pezzi di colonia.Ti suggeriamo di esercitarti in anticipo con i pezzi di colore di trasferimento e dissezione. Mantenere entrambe le piastre cambiando quotidianamente il terreno integrato con antibiotici. Espandere fino a quando le piastre a 96 pozzetti sono confluenti al 100% una volta che le piastre sono confluenti.Rimuovere tutto il terreno dalle piastre capovolgendole, quindi tamponare su carta assorbente. Procedere alla preparazione del DNA genomico per la PCR come descritto nel documento di accompagnamento dopo la sospensione del DNA in TE o TO 0.1 E.Eseguire la PCR utilizzando il sistema di PCR a modello lungo espanso come descritto nel documento di accompagnamento, utilizzare da uno a due microlitri di DNA risospeso per 10 microlitri di reazione PCR dopo lo screening PCR per cloni positivi mediante elettroforesi e confermare mediante southern blotting. Una volta confermati i cloni positivi, procedi con la sottocoltura e congela il resto dei frammenti della colonia per progettare un PIT X tre.Reporter linea cellulare hecs. Sono stati co-ed con una coppia di tre dita di zinco pit progettata su misura e il vettore di donatore di DNA specifico EGFB pit X tre come descritto in questo articolo video dopo PERY e la selezione, i cloni HESC positivi sono stati rilevati tramite screening PCR genomico come si può vedere qui. C'erano numerosi cloni positivi, come indicato dalle bande a 9 84 coppie di basi.L'ibridazione Southern blot di questi cloni positivi alla PCR è stata quindi eseguita utilizzando cinque e tre sonde specifiche. Questa illustrazione mostra lo schema del vettore di puntamento linearizzato e la posizione delle cinque e tre sonde esterne. Vengono mostrate le cinque e le tre macchie meridionali sia degli alleli wild type che di quelli mirati.La banda singola nella corsia wild type indica due alleli identici che seguono il corretto targeting del transgene verso la fossa x tre locus due bande. Uno corrispondente all'allele correttamente mirato, l'altro all'allele wild type. Una volta padroneggiata, questa metodologia può essere eseguita in due o tre mesi.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indirizzare le cellule staminali umane utilizzando nucleasi a dita di zinco, nonché di come utilizzare le strategie di PCR e southern blot per lo screening della LLC correttamente mirata.

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