Name: Un protocollo video di infezione retrovirale in Primaria intestinale organoide Cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T18:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Scopri la trasduzione retrovirale in organoidi intestinali primari per studi genetici funzionali. Questo metodo consente l'overespressione o il knockdown inducibile di transgeni in un sistema organotipico in vitro.

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Koo BK e Mustata RC sono supportati dal Sir Henry Dale Fellowship dal Wellcome Trust e Andersson-Rolf A è sostenuto dal Medical Research Council (MRC). Fink J è supportato dal dottorato di ricerca-programma di 4 anni Wellcome Trust.

Tutti i topi utilizzati nel seguente protocollo sono stati tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni specifici, e tutte le procedure sono state eseguite secondo le norme Regno Unito Casa di Office. 1 Preparazione <ol><li> Preparare supporti 1 ora in anticipo di utilizzo (vedi Tabella 1 e la Lista dei Materiali per maggiori dettagli) e pre-caldo in un bagno di 37 ° C acqua almeno 10 minuti prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Coltura Piccolo intestinale (SI) organoidi NOTA: Se non diversamente specificato, tutte le incubazioni vengono eseguite a 37 ° C, 5% di CO 2 in un incubatore umidificato. Attrezzature e reagenti che entrano in contatto con le cellule viventi devono essere sterili. Pre-riscaldamento della piastra di coltura tissutale è importante in quanto previene la matrice seminterrato (Matrigel o BME) scende da diffondere quando semina. Inoltre, la matrice basamento deve essere mantenuto in ghiaccio in ogni momento. Conservare a -20 ° C e disgeloin ghiaccio prima dell&#39;uso. <ol><li> Isolamento cripte <ol><li> Per l&#39;isolamento del piccolo intestino sacrificare il mouse in base alle norme e ai regolamenti nazionali, quindi posizionare l&#39;animale sul dorso e lavare l&#39;addome con il 70% di etanolo. Eseguire una linea mediana incisione longitudinale dall&#39;inguine allo sterno. In primo luogo, tagliare la pelle e quindi il tessuto sottocutaneo. Rimuovere il piccolo intestino cieco allo stomaco. Cripte isolati dal duodeno, digiuno e ileo possono essere utilizzati per la coltura organoide. </li><li> Lavare il piccolo intestino isolato con pre-raffreddata Phosphate-Buffered Saline senza calcio e magnesio (PBS0). </li><li> Tagliare il tessuto in pezzi lunghi 3-5 cm e usare le forbici per tagliare aprire longitudinalmente. Stendere il tessuto utilizzando una pinza. </li><li> Raschiare villi con un coprioggetto. Attenzione, troppa forza causerà il tessuto di strappare e ridurrà la resa delle cripte nel seguire passaggi. </li><li> Trasferire il tessuto in una provetta da 50 ml contenente pre-raffreddata PBS0 Strug pinze. Lavare i frammenti di tessuto attraverso vigorosa agitazione e cambiare il PBS0. Ripetere 2-3 volte o fino a quando il PBS0 diventa meno nuvoloso. </li><li> Incubare il tessuto in una provetta da 50 ml contenente 30 ml di PBS0 di 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 30 min a 4 ° C su un rullo tubo. </li><li> Agitare vigorosamente la provetta e trasferire il tessuto ad un altro tubo da 50 ml contenente 30 ml di PBS0 con 5 mM EDTA. La soluzione 1 mM EDTA (precedentemente contenente il tessuto) conterrà una miscela di cripte e villi. Questa frazione non è adatto per la semina di organoidi quanto spesso contiene un&#39;alta percentuale di villi. </li><li> Incubare il tessuto ulteriormente per 1 ora a 4 ° C su un rullo tubo. </li><li> Agitare vigorosamente il tubo e raccogliere la soluzione in una provetta pulita da 50 ml. Confermare la presenza di cripte e di stimare il numero, ad esempio, contando cripte in 50 microlitri al microscopio ottico. Calcolare il volume necessario per ottenere 50-100 cripte e trasferirlo ad un 1,5 ml tube. </li><li> Spin a 300 xg per 5 min. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in 50 ml di matrice seminterrato, e le sementi in una piastra a 24 pozzetti pre-riscaldato. Incubare la piastra in un tessuto cultura incubatore per 5-15 minuti in modo che la matrice seminterrato polimerizza. </li><li> Overlay con 500 microlitri di media ENR (vedi Tabella 1). Circa 24 ore dopo la semina i organoidi mostrerà una piccola forma cistica rotonda e dopo altri 2-3 giorni in erba strutture diventano visibili. Modificare i media ENR freschi ogni 3 giorni. </li><li> Passaggio organoide culture ogni 7 giorni. </li></ol></li><li> Passaging e organoidi Gestione <ol><li> Mantenere le organoidi aggiornando media ogni 3 giorni e il passaggio 1: 3 o 1: 5, come il lume si riempie di cellule morte, circa ogni 7 giorni. </li><li> Rompere la cupola matrice seminterrato con media usando 1 ml di punta Pipetman e trasferirlo dal pozzo in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Meccanicamente dissociare le organoidi attraverso un pipettaggiopproximately 50x con una multa (ad esempio, 200 ml) punta. </li><li> Spin a 300 xg per 5 min. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 150-250 ml di matrice seminterrato. Seed in un pre-riscaldato 24 pozzetti (50 ml di matrice seminterrato / e). Prima della semina pipetta matrice seminterrato su e giù una volta per rivestire la parete della punta. Pipetta lentamente per evitare bolle e seme nel mezzo del pozzo per evitare che la matrice seminterrato diffusione fuori. Si desidera ottenere una cupola di matrice interrato nel centro del pozzo. </li><li> Incubare in un tessuto cultura incubatore per 5-15 minuti in modo che la matrice seminterrato polimerizza. Overlay con 500 microlitri ENR supporto per pozzetto. </li></ol></li></ol> 3 Pre-Trattamento di infezione SI organoidi NOTA: La figura 1 illustra la procedura di trasduzione. <ol><li> Scambio ENR per ENRWntNic (vedi Tabella 1) medio e crescono le organoidi in til suo mezzo per un minimo di 3 giorni o fino a che non hanno adottato una morfologia cistica. Wnt3a aumenta il numero di cellule staminali e di Paneth mentre Nicotinamide (Nic) migliora l&#39;efficienza cultura. </li></ol> 4. Virus Produzione <ol><li> È necessario uno a 150 mm piatto di cellule Platinum-E per l&#39;infezione. Seme di circa 5 x 10 6 cellule con 15-18 ml di supporti (DMEM + 10% FBS) in presenza di puromicina (1 mg / ml) e blasticidin (10 mcg / ml). Trasfezione le cellule dopo 2-3 giorni, quando hanno raggiunto il 70-80% di confluenza. Modificare il medio DMEM + 10% FBS, senza puromicina e blasticidin prima di trasfezione. </li><li> Aggiungere 30 mg di costrutto di DNA retrovirale e 240 ml di polietilenimmina (PEI) per separare le provette contenenti 1 ml di Opti-MEM. Mescolare ed incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Si riuniscono le due soluzioni ed incubare a temperatura ambiente per 20-30 min. Aggiungere la miscela completa al mezzo di cellule Platinum-E e agitare accuratamente il plate al fine di garantire un&#39;equa distribuzione dei complessi DNA-PEI. </li><li> Incubare le cellule Platinum-E con la miscela di trasfezione durante la notte e aggiornare il medio il giorno seguente. Conservare le cellule del nuovo mezzo per 2 giorni. </li><li> Raccogliere solo il mezzo in un tubo Falcon da 50 ml, passa attraverso un filtro da 0,45 micron e centrifugare a 8000 xga 4 ° C per 12-16 ore. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 250 ml di trasduzione media (vedi Tabella 1). </li></ol> 5. organoide Frammento Preparazione <ol><li> Per una infezione è necessario un pozzetto da una piastra da 24 pozzetti. Rompere la cupola matrice seminterrato con media usando 1 ml di punta Pipetman e trasferirlo in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Utilizzare una punta di volume più fine (ad esempio, 200 consigli microlitri) per distruggere meccanicamente i organoidi attraverso pipettaggio (30-50x). La soluzione diventerà torbida e non interi organoidi dovrebbe essere visibile. </li><li> Centrifugare a temperatura ambiente, 900 xg per 5 min<html> . </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 500 ml di coltura cellulare di grado proteasi ricombinante (ad esempio, TrypLE). Incubare a 37 ° C per 5 min. Dopo incubazione verificare la dimensione dei frammenti organoide utilizzando la microscopia ottica, contando il numero di cellule per frammento. Frammenti contenenti 5-10 cellule sono l&#39;ideale. Se la maggior parte dei frammenti contiene un numero elevato di celle del tempo di incubazione può essere aumentata di 2 minuti alla volta. </li><li> Terminare il processo di dissociazione con l&#39;aggiunta di 500 ml di ENR media. </li><li> Centrifugare a temperatura ambiente, 900 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e conservare il pellet in ghiaccio o 4 ° C. </li></ol> 6. trasduzione retrovirale <ol><li> Unire frammenti organoide con 250 microlitri della soluzione retrovirale (da paragrafo 4.5) in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. Mescolare delicatamente pipettando lento utilizzando 1 ml di punta Pipetman. </li><li> Sigillare la piastra con Parafilm. </li></ol>e &quot;&gt; 7. Spinoculation e placcatura <ol><li> Centrifugare la piastra a 32 ° C, 600 xg, per 1 ora. Rimuovere con attenzione il Parafilm e incubare la piastra in un tessuto cultura incubatore per 6 ore. </li></ol> 8 Semina di infetti organoide Frammenti <ol><li> Trasferire i frammenti organoide infetti e media trasduzione dal pozzo in una provetta da 1,5 ml e centrifugare a 900 xg per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante e mettere il tubo contenente il pellet in ghiaccio per 5 minuti a raffreddare. Aggiungere 100 ml di matrice seminterrato e risospendere il pellet pipettando lentamente su e giù. </li><li> Gocce di semi di &#39;interrato matrice -cell mix&#39; di 50 microlitri di una nuova piastra da 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 ° C per 5-15 minuti fino a quando i solidifica matrice seminterrato. </li><li> Aggiungi mezzi di trasduzione, senza polibrene ai pozzetti e incubare la piastra in un incubatore coltura di tessuti. Modificare i media ogni 2-3 giorni. </li></ol> 9 Selezione <ol><li> Inizia SEcolta dopo 2-3 giorni con l&#39;aggiunta puromicina (1 mg / ml) per il supporto. </li><li> Quando i frammenti stanno iniziando a formare organoidi sostituire il supporto di trasduzione con i media ENR integrato con puromicina (1 mg / ml). </li></ol> 10 post-infezione Trattamento di SI organoidi <ol><li> Cultura trasduzione organoidi secondo il &quot;Passaging e mantenere organoidi&quot; protocollo (punto 2.2.1). Dopo 1-2 settimane i organoidi SI potranno ritrovare le loro strutture in erba. </li><li> A seguito della comparsa di strutture in erba indurre l&#39;espressione di miRNA o cDNA aggiungendo 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) in una concentrazione di 1 mM di lavoro. Si noti che questo passo è valida solo se si utilizza vettori retrovirali da Addgene (pMSCV-loxp-DsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE (32702), pMSCV-loxp-DsRed-loxp-3xHA-Puro-WPRE (32703), e pMSCV -flip-puro-DsRed-GFP-miRNA (32704)) e organoidi esprimono Cre-ERT2. </li></ol> 11 Conferma di infezione e ExprESSIONE / Soppressione del gene di interesse <ol><li> Se si utilizzano vettori retrovirali da Addgene (32702, 32703 e 32704) efficienza di trasduzione può essere confermata dall&#39;osservazione di espressione DsRed. Inoltre, l&#39;espressione o la soppressione del gene di interesse possono essere confermati dal Western Blot, utilizzando la GFP o 3xHA epitopo (per la sovraespressione del gene) e qPCR (per gene knockdown), come esemplificato nella Koo et al 4. </li></ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+and+liver+physiology%22%5BJournal%5D)">A nomenclature for intestinal in vitro cultures. American journal of physiology.</a> Gastrointestinal and liver physiology. 302, G1359-G1363 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature. 9, 81-83 (2012).</li>
<li>Schwank, G., Andersson-Rolf, A., Koo, B. K., Sasaki, N., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+BAC+Transgenic+Epithelial+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of BAC Transgenic Epithelial Organoids.</a> PloS one. 8, e76871(2013).</li>
<li>Mustata, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr4+is+required+for+Paneth+cell+differentiation+and+maintenance+of+intestinal+stem+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Lgr4 is required for Paneth cell differentiation and maintenance of intestinal stem cells ex vivo.</a> EMBO reports. 12, 558-564 (2011).</li>
<li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5+homologues+associate+with+Wnt+receptors+and+mediate+R-spondin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling.</a> Nature. 476, 293-297 (2011).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+suppressor+RNF43+is+a+stem-cell+E3+ligase+that+induces+endocytosis+of+Wnt+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors.</a> Nature. 488, 665-669 (2012).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> The EMBO journal. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare. Gli autori non hanno dichiarato alcun conflitto di interessi.

<html> Per ottenere alta efficienza di trasduzione alcuni aspetti sono fondamentali. Uno è il pre-trattamento dei organoidi con ENRWntNic supporti fino a che non adottano una forma cistica rotonda. Questo aumenta il numero di cellule staminali e quindi la possibilità di ottenere una integrazione stabile del transgene, oltre ad aumentare il tasso di sopravvivenza dei organoidi SI tutta la procedura di trasduzione. Un altro parametro è il tempo di incubazione seguente spinoculation. Risultati di incubazione troppo corto o troppo lungo in cattiva efficienza di trasduzione e la scarsa sopravvivenza dei organoidi rispettivamente. Il passo spinoculation non è essenziale anche se aumenta significativamente la percentuale di organoidi trasdotte. Infine, il virus ad alto titolo è la chiave per la trasduzione di successo. Questo dipende dal tipo di linea cellulare di packaging e virus. La combinazione della linea cellulare Platinum-E e murina virus di cellule staminali (MSCV), è stato trovato per produrre un titolo abbastanza alto per la trasduzione di organoidi. ve_content &quot;&gt; Di seguito sono riportati suggerimenti per la risoluzione dei problemi che possono contribuire al raggiungimento di trasduzione di successo. Innanzitutto, se la trasfezione della linea cellulare di packaging è scarsa, assicurarsi che la confluenza delle cellule è tra il 70-80% e che il tempo di incubazione della miscela pool PEI-DNA è tra 20-30 min. La sopravvivenza dei organoidi durante trasduzione altamente dipende dalla dimensione del frammento. Troppo lungo tripsinizzazione causa la maggior parte dei frammenti di consistere in meno di 3 cellule e di conseguenza diminuisce la sopravvivenza organoide. altro fattore è l&#39;attività del mezzo Wnt condizionato, se l&#39;attività è troppo basso amplificando attraverso aggiunta di CHIR99021 in una concentrazione di lavoro di 5 micron possono aumentare la sopravvivenza. CHIR99021 inibisce GSK3, con conseguente aumento di segnalazione Wnt. Inoltre, Y-27362, che impedisce anoikis si aggiunge ai media di trasduzione per migliorare la sopravvivenza organoide, dal momento che i organoidi sono interrotti a frammenti (contenenti 1-10 cellule) prima di trasduzione. come60, citato sopra, il tempo di incubazione dopo spinoculation non deve superare i 6 ore. Infine, se il povero trasduzione si osserva dovrebbero essere considerati i fattori di cui sopra che influenzano il titolo virale e il limite di dimensione dell&#39;inserto per il vettore retrovirale. L&#39;efficienza del knockdown è fortemente dipendente dalla miRNA. Poiché l&#39;efficienza varia con la combinazione del gene bersaglio e miRNA è opportuno eseguire una schermata efficienza per identificare quelli che funzionano meglio. La tecnica è limitata ai fenomeni epiteliali del sistema organoide. In futuro potrebbe essere possibile studiare malattie infettive o immuno-mediate attraverso la co-coltura di patogeni o di ricostituzione con componenti derivati ​​dal sistema immunitario, rispettivamente. Inoltre, i retrovirus possono trasportare solo inserti di dimensioni relativamente ridotte. Di conseguenza, naturali regioni regolatorie devono essere esclusi e quindi l&#39;espressione del transgene non può imitare quella diil gene endogeno. Come accennato in precedenza, l&#39;efficienza atterramento dipende dal gene bersaglio e miRNA. Se nessun miRNA con idoneo efficienza smontabile può essere giudicata può limitare l&#39;uso della tecnica per quel particolare gene bersaglio. Teoricamente, organoidi sono compatibili con tutte le tecniche manipolative standardizzate utilizzate per linee cellulari. Trasduzione retrovirale è stato il primo metodo da segnalare 4, e recentemente BAC (cromosoma artificiale batterico) -transgenesis è diventato disponibile 5. Con un tempo totale di generazione di 2-3 settimane, dopo trasfezione del plasmide virale nella linea cellulare di packaging, è significativamente più veloce rispetto alla generazione di un transgenico (tg) topo. Mantenendo in vivo cripta-villo architettura mentre contenente cellule staminali così come tutte le linee cellulari differenziate dell&#39;epitelio intestinale, il sistema di coltura organoide colma il divario tra tg animali e colture cellulari precedentemente utilizzato. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Il protocollo qui descritto fornisce un metodo per eseguire l&#39;analisi fenotipica di epitelio endodermico in vitro attraverso GAIN- e in perdita di studi di funzione. Ciò rende possibile affrontare questioni fisiologicamente rilevanti in adulto biologia delle cellule staminali, con un bisogno minimo di topi tg. Ad esempio, la generazione di topi knockout condizionali potrebbe essere evitato utilizzando organoidi derivati ​​da mutanti neonati con mortalità perinatale 6. Inoltre, la tecnica può essere applicata a organoidi derivate da topi knockout precedentemente stabiliti per studiare il ruolo di paralogues effettuando ulteriori 7,8 smontabile. Dopo la creazione di piccole organoidi intestinali, adattamento del protocollo di cultura originale ha permesso coltura del pancreas, del fegato, del colon e dello stomaco epiteli 9-11. Inoltre, organoidi intestinali umani e organoidi tumorali sono stati derivati ​​da normali biopsie umane, primario adenoma e il cancro del colon-retto 10 biopsie. Il protocollo infezione virale può essere facilmente esteso a questi tipi di organoidi e fornisce un modo senza precedenti di eseguire studi funzionali nei tessuti di derivazione umana. Nel loro insieme, trasduzione retrovirale di piccole organoidi intestinale è una risorsa preziosa per lo studio delle cellule staminali manutenzione, la differenziazione, e la decisione il destino delle cellule, così come le interazioni di segnalazione cellulare e la cellula cellulare.

High-throughput genetica funzionali è necessario per aumentare la nostra comprensione biologica del corpo, per migliorare la corrente di scienza di base e la medicina. Genetica del mouse è stato il gold standard per lo studio della funzione genica in vivo, anche se è sia in termini di tempo e costosa. Le linee cellulari, essendo l&#39;altra scelta comune, hanno pur essendo meno costoso di una maggiore capacità di throughput. Tuttavia, essi sono impediti dalla loro incapacità di riprodurre il corretto microambiente e quindi le risposte fisiologiche visto in vivo. Quindi, vi è una necessità univoca per un facile da maneggiare sistema modello, che permette di costo / tempo-efficiente high throughput analisi mentre imitando le risposte fisiologiche osservate in vivo esperimenti transgenici (Tg) del mouse in. Per l&#39;epitelio endodermico un tale sistema modello apparso nel 2009 1. Tra le conoscenze acquisite con la scoperta delle cellule staminali intestinali Lgr5-positivi è statainformazioni sulla nicchia corrispondente ai fattori extracellulari della matrice e crescita necessarie per la manutenzione delle cellule staminali. Utilizzando queste informazioni è stato possibile stabilire &quot;mini-guts &#39;noto anche come organoidi 2. Recentemente una nomenclatura consenso per le culture in vitro, dove organoidi sono indicati come &quot;enteroids&quot;, è stato suggerito 3. Come linee cellulari, le organoidi sono in continua espansione e facile da trattare con leganti e inibitori. Tuttavia, invece di essere bidimensionali sono strutture tridimensionali di auto-organizzazione che mantengono l&#39;organizzazione cripta-villo così come le cellule staminali e linee cellulari differenziate del piccolo intestino (SI). Organoidi costituiti da un singolo strato di cellule epiteliali che circondano un&#39;area luminale. Sporgenti strutture in erba corrispondono alle piccole cripte intestinali contenenti compartimento delle cellule staminali. Partendo dalla punta della struttura germogliamento cellule progenitrici differenziano in quanto MIgrattugiare verso il rivestimento epiteliale, dove le cellule terminalmente differenziate sono capannone nel lume. Rispetto a linee cellulari, questo sistema ex vivo ricapitola più strettamente la normale fisiologia ed è quindi un sistema modello promettente per la piccola epitelio intestinale. In questo protocollo video di trasduzione retrovirale, vi presentiamo un metodo che consente di ex vivo studi di funzione genica in questo romanzo sistema di coltura organoide. Iniziamo descrivendo organoide cultura in un modo step-by-step, e continuiamo dimostrando la generazione di retrovirus seguita dalla procedura di trasduzione. Infine, vi è una sezione per ulteriori consigli per la risoluzione dei problemi. Un vantaggio di questa tecnica è che può essere combinato con l&#39;imaging dal vivo o screening di farmaci per studiare omeostasi, decisioni destino delle cellule e le interazioni cellula-cellula a livello dell&#39;epitelio intestinale. Grazie alla loro architettura semplice e tasso di turnover veloce, organoidi rappresentano un modello ideale system per lo studio della biologia delle cellule staminali adulte. Inoltre trasduzione retrovirale può essere applicato a organoidi derivate da topi transgenici prestabiliti nonché campioni umani dei pazienti. Con l&#39;avvicinarsi del knock-in e knock-out non possono essere estesi agli esseri umani, i organoidi umano SI costituiscono un&#39;alternativa attraente. In sintesi, la manipolazione genetica attraverso la trasduzione retrovirale permette l&#39;analisi fenotipica in piccoli organoidi intestinali derivati ​​da topi o campioni di tessuti umani, integrando in tal modo la genetica del mouse e linee cellulari durante l&#39;apertura di nuove strade per gli studi nei tessuti di derivazione umana. Trasduzione retrovirale consente GAIN- e la perdita-di-funzione studi da eseguire nel sistema di coltura organoide 4. Questo lo rende una risorsa preziosa per lo studio della funzione genica, adulto biologia delle cellule staminali e la malattia pur essendo in conformità con le tre R (riduzione, perfezionamento e sostituzione).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 avanzato&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>12634-034</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplemento 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N2 integratore 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>n-acetilcisteina 500 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Topo EGF 500 &micro; g/ml</td><td>Invitrogen Biosource</td><td>PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Noggin 100 &micro; g/ml</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr>Terreno <td></td><td></td><td>condizionato con R-spondina</td><td>Il mezzo condizionato è generato da celle HEK293, per i dettagli vedere Sato e Clevers 2013.</td></tr><tr>Mezzo <td></td><td></td><td>condizionato Wnt</td><td>Il mezzo condizionato è generato da celle L, per i dettagli vedere Sato e Clevers 2013.</td></tr><tr><td>Nicotinamide 1 M</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 10 &micro; M</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Polibrene (8 &micro; g/ml)</td><td>Sigma</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>Standard BD Matrigel matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Basement Matrix Extract (Cultrex PathClear BME Reduced Growth Factor Type 2, 3533-005-02) fornito da AMSBIO può essere utilizzato come alternativo.</td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>Greiner Bio One</td><td>662960</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 48 pozzetti</td><td>Greiner Bio One</td><td>677980</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma</td><td>A3734-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Cellule Platino-E</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Invitrogen</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina</td><td>Invitrogen</td><td>A1113902</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina (PEI)</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocollo video di infezione retrovirale in primaria intestinale organoide cultura

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Cellule staminali Lgr5-positivi possono essere integrati con la crescita essenziale fattori FEG Noggin, e R-spondina, che ci permette di cultura in continua espansione delle strutture epiteliali 3D primarie in vitro. Sia l&#39;architettura e fisiologiche proprietà di questi &quot;mini-coraggio&quot;, chiamati anche organoidi, molto simili alle loro controparti in vivo. Questo li rende un sistema modello interessante per le piccole epitelio intestinale fa. Utilizzando trasduzione retrovirale, la genetica funzionali possono ora essere eseguite da sovraespressione del gene condizionale o knockdown. Questo video illustra la procedura di cultura organoide, la generazione dei retrovirus, e la trasduzione retrovirale di organoidi per assistere analisi fenotipica del piccolo epitelio intestinale in vitro. Questo nuovo sistema modello organotipica in combinazione con l&#39;espressione retrovirale genica mediata fornisce un valido strumento per una rapida analisi della funzione genica in vitro senza bisogno di costlGenerazione Y e in termini di tempo per gli animali transgenici.

Organoidi sono pronti per essere raggruppati quando il lume centrale è oscurato a causa della presenza di cellule morte (Figura 2). Dopo 2-3 giorni di organoidi pre-trattamento dovrebbe adottare una morfologia cistica turno (Figura 3). Questo aumenta il numero di cellule staminali, aumentando le possibilità di ottenere integrazione stabile. Le dimensioni del pellet virale può variare dalla centrifugazione del surnatante virale, molto probabilmente a causa di variazioni contributo di detriti cellulari alle dimensioni del pellet. È stata osservata alcuna chiara correlazione di efficienza di trasduzione. Durante la procedura di selezione organoidi non trasdotte moriranno, mentre quelle con una integrazione stabile rimarrà. La proteina fluorescente da retrovirus MSCV-eGFP può essere osservato in cellule provenienti da organoidi superstiti, che hanno una morfologia cistica, entro 2-3 giorni dopo la trasduzione (Figura 4). <img alt> = "Figura 1" fo: content-width = src "6in" = "/ files / ftp_upload / 51765 / 51765fig1highres.jpg" width = "600" /&gt; Figura 1 Un disegno schematico della procedura di trasduzione retrovirale. Prima di organoidi infezione sono pre-trattati con ENRWntNic fino a che non adottano una struttura cistica (step 1). Cellule Platinum-E sono utilizzati come la linea cellulare di packaging, e sono coltivate fino a raggiungere il 70-80% di confluenza. Successivamente vengono trasfettate con il costrutto retrovirale con PEI. I virus sono raccolte 2 giorni più tardi (fase 2). Organoidi sono tripsinizzate per ottenere frammenti contenenti 1-10 cellule (fase 3), e vengono quindi infettate (punto 4). Dopo spinoculation per aumentare l'efficienza di infezione (punto 5), i frammenti organoide infetti vengono seminate (fase 6) e 2-3 giorni dopo la selezione di cloni positivi con l'integrazione stabile può essere eseguita (punto 7). 1765fig2highres.jpg "width =" 500 "/&gt; Figura 2 Immagine rappresentativa della organoidi dopo 4-6 giorni di coltura. Il lume è pieno di cellule morte, facendolo apparire scuro. Organoidi in questa fase sono pronti per essere diversi passaggi. <img alt="Immagine al microscopio di bolle d'aria in un liquido durante lo studio dell'equilibrio statico, che dimostra la tensione superficiale." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Immagine rappresentativa di piccoli organoidi intestinali coltivate in ENRWntNic mezzi per 3-4 giorni. Le organoidi adottare una morfologia cistica. <img alt="Immagini di morfologia cellulare, microscopio a campo chiaro e a fluorescenza, analisi della struttura cellulare." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51765/51765fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 Immagine rappresentativa di piccoli organoidi intestinali (a) che mostrano l'espressione del transgene virale (B, eGFP). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Advanced DMEM / F12 +++ </td></tr><tr><td colspan="2"> Conservare a 4 ° C per 4 settimane </td></tr><tr><td> Avanzato DMEM / F12 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Glutamax 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Hepes 1 M </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> Antibiotici 100x </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mezzo ENRWntNic (per 20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conservare a 4 ° C per 2 settimane </td></tr><tr><td> Avanzato DMEM / F12 +++ </td><td> 7.2 ml </td></tr><tr><td> Supplemento B27 (50x) </td><td> 400 microlitri </td></tr><tr><td> N2 supplemento (100x) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> N-acetilcisteina (500 mm) </td><td> 50 microlitri </td></tr><tr><td> topo EGF (500 mg / ml) </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> Noggin topo (100 mg / ml) </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td> R-spondina Conditioned medio </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> Wnt3a terreno condizionato </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Nicotinamide (1 M) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mezzo di trasduzione (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Preparare fresco </td></tr><tr><td> ENRWntNic medio </td><td> 20 ml </td></tr><tr><td> Y-27632 (10 micron) </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td> Polybrene (8 mg / ml) </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td colspan="2"> ENR mezzo (20 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conservare a 4 ° C per 4 settimane </td></tr><tr><td> Avanzato DMEM / F12 +++ </td><td> 17.4 ml </td></tr><tr><td> Supplemento B27 (50x) </td><td> 400 microlitri </td></tr><tr><td> N2 supplemento (100x) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> N-acetilcisteina (500 mm) </td><td> 50 microlitri </td></tr><tr><td> topo EGF (500 mg / ml) </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> Noggin topo (100 mg / ml) </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td> R-spondina terreno condizionato </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Supporti per le celle Platinum-E (per 500 ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> Conservare a 4 ° C per 12 settimane </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 449,45 ml </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FBS) </td><td> 50 ml </td></tr><tr><td> Puromicina (1 mg / ml) </td><td> 50 microlitri </td></tr><tr><td> Blasticidin (10 mg / ml) </td><td> 500 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 1. composizione media avanzata DMEM / F12 +++, ENRWntNic medio, medio trasduzione, ENR media, e medio per le cellule Platinum-E.

Questo protocollo spiega cultura organoide Lgr5-positivo primaria e la successiva esecuzione di trasduzione retrovirale. Ciò consente sovraespressione Cre-inducibile o knockdown del transgene consegnato e permette studi funzionali da realizzare nel romanzo in vitro organotipica sistema modello.

Un protocollo video di infezione retrovirale in Primaria intestinale organoide Cultura

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare come eseguire studi genetici funzionali negli organoidi. Ciò si ottiene pretrattando prima gli organoidi con terreni contenenti WINT tre A per facilitare la loro adozione di una forma cistica e aumentare il numero di cellule staminali. Nella seconda fase, il virus viene prodotto e i frammenti di organoidi vengono quindi trasdotti e inoculati.Nella fase finale, gli organoidi trasfettati vengono posizionati e quindi selezionati per un'integrazione virale stabile. In definitiva, l'espressione o la soppressione del gene di interesse può essere valutata mediante fluorescenza GFP. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questa tecnica rispetto ai modelli di AL esistenti come il topo, è che con questa tecnica è possibile eseguire esperimenti genetici funzionali in vitro con gli organoidi intestinali.A dimostrare la procedura sarà Amanda Andro, una dottoranda del mio laboratorio Per isolare le cripte, iniziare lavando l'intestino tenue con PBS pre-raffreddato senza calcio e magnesio. Quindi tagliare il fazzoletto in pezzi lunghi da tre a cinque centimetri e aprire i pezzi longitudinalmente con le forbici. Usa una pinza per aprire i fazzoletti, raschia via i villi in eccesso usando un vetrino copritutto, quindi trasferisci i pezzi in un tubo da 50 millilitri contenente PBS refrigerato.Lavare i frammenti di tessuto due o tre volte agitando energicamente, cambiando il PBS fino a quando il PBS non diventa meno torbido dopo l'ultimo lavaggio, incubare il tessuto in una provetta da 50 millilitri contenente 30 millilitri di PBS integrata con un millimolare di EDTA a quattro gradi Celsius su un rullo tubolare. Dopo 30 minuti energicamente, agitare nuovamente la provetta e trasferire il tessuto in un'altra provetta da 50 millilitri contenente 30 millilitri di PBS integrato con cinque millimolari di EDTA. Dopo un'ora di incubazione a quattro gradi Celsius sul tubo si arrotola vigorosamente.Agitare nuovamente la provetta e trasferire la soluzione in una nuova provetta da 50 millilitri. Quindi conta il numero di cripte in 50 microlitri. Calcola e trasferisci il volume contenente da 50 a 100 cripte in un tubo da 1,5 millilitri.Quindi, fai girare le cripte e risospendi il pellet in 50 microlitri di matrice seminterrato. Quindi seminare la soluzione della cripta in una piastra Prewarm 24 Well e incubare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per cinque-15 minuti. Una volta polimerizzata la membrana basale, incubare la matrice con 500 microlitri di terreno ENR in un incubatore per colture cellulari.Rinfrescando il terreno ogni tre giorni circa 24 ore dopo la seduta, gli organoidi mostreranno una piccola forma cistica rotonda. Dopo altri due o tre giorni, le strutture in gemmazione diventeranno visibili mentre gli organoidi adottano la loro morfologia cistica Seme, circa cinque volte 10 alle sei cellule E di platino in un piatto da 150 millimetri con 15-18 millilitri di terreno integrato con pur, micina e blastina. Dopo due o tre giorni, cambiare il terreno con un terreno senza antibiotici e aggiungere 30 microgrammi di costrutto di DNA retrovirale e 240 microlitri di pi greco a due provette individuali contenenti ciascuna un millilitro di optimum.Quindi, mescola le provette e incubale a temperatura ambiente. Dopo cinque minuti, raggruppare le due soluzioni e incubarle a temperatura ambiente per altri 20-30 minuti. Aggiungere l'intera miscela alle cellule E di platino e agitare accuratamente la piastra per garantire una distribuzione uniforme dei complessi PI del DNA.Dopo un'incubazione notturna, rinfrescare il terreno e incubare nuovamente le cellule. Dopo due giorni, raccogli solo il terreno in una provetta Falcon da 50 millilitri e filtralo attraverso un filtro da 0,45 micron. Quindi centrifugare la soluzione per 12-16 ore a 8.000 volte G e quattro gradi Celsius e risospendere il pellet in 250 microlitri di mezzo di trasduzione.Per preparare i frammenti di organoidi per la trasduzione retrovirale, pipettare prima la coltura da 30 a 50 volte con una punta di pipetta da 200 microlitri per disgregare meccanicamente gli organoidi, la soluzione diventerà torbida e non dovranno essere rilevati organoidi interi. Dopo aver centrifugato i frammenti, incubare il pellet in 500 microlitri di coltura cellulare, classificare la proteasi ricombinante a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, utilizzare un microscopio ottico per valutare le dimensioni dei frammenti di organoidi e per contare il numero di cellule per frammento.Quindi aggiungere 500 microlitri di terreno ENR per terminare il processo di dissociazione e far girare i frammenti cellulari. Dopo aver scartato il surnatante, posizionare il pellet sul ghiaccio e poi seminare i frammenti in un pozzetto di un 48. Piastra a pozzetti in 250 microlitri della soluzione retrovirale precedentemente preparata.Mescolare delicatamente la soluzione cellulare con un puntale per pipetta da un millilitro, quindi sigillare la piastra con param per eseguire la prima centrifuga di inoculazione. La piastra a 48 pozzetti per un'ora a 600 volte G e 32 gradi Celsius. Quindi rimuovere con cura la pellicola para e incubare la piastra per altre sei ore in un incubatore per colture cellulari.Dopo l'incubazione, trasferire i frammenti infetti in una provetta da 1,5 millilitri. Quindi centrifugare nuovamente i frammenti di organoide e raffreddare il pellet con ghiaccio per cinque minuti. Una volta che il pellet si è raffreddato, aggiungere 100 microlitri di matrice di base al tubo e pipettare lentamente il pellet su e giù per risospenderlo.Quindi seminare 50 gocce da microlitro della sospensione della matrice di frammento in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque-15 minuti Dopo che la matrice basamentale si è solidificata, incubare gli organoidi con mezzi di trasduzione senza poli cervello. Dopo due o tre giorni, aggiungere ai pozzetti un terreno contenente pura micina per iniziare la selezione. Quando i frammenti iniziano a formare organoidi, sostituire il mezzo di trasduzione con un mezzo ENR integrato.Con puram gli organoidi di micina sono pronti per essere scissi quando i loro lumi centrali si oscurano a causa della presenza di cellule morte. Dopo due o tre giorni di pre-trattamento con terreno Wint three a, gli organoidi dovrebbero adottare una morfologia cistica, aumentando il numero di cellule staminali e aumentando le possibilità di ottenere un'integrazione stabile nelle cellule staminali. In queste immagini, l'espressione della proteina fluorescente del retrovirus M-S-C-V-E-G-F-P può essere osservata nelle cellule originate dagli organoidi sopravvissuti che hanno acquisito la morfologia cistica attesa entro due o tre giorni dalla trasduzione.Durante il tentativo di questa procedura, è importante controllare la dimensione dei frammenti di organoidi in quanto influisce fortemente sulla loro sopravvivenza. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la trasduzione retrovirale degli organoidi.

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Biologia

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Un metodo semplice per determinare primario murino organoide tumore colon è descritto. Questo metodo utilizza la funzione che le cellule tumorali del colon sopravvivere e crescere in organoidi in terreni contenenti fattori di crescita limitate, mentre colon normale epiteliale non lo fanno.

In vitro organoide Cultura di primari tumori del colon mouse

In questo protocollo video diamo una spiegazione passo dopo passo della trasduzione lentivirale negli organoidi dell'epitelio intestinale primario e del processamento e dell'analisi a valle di queste colture mediante RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e immunoistochimica.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Qui, un protocollo per raccogliere, gestire e trattare il mouse piccoli organoidi intestinale con modelli patogeni associati molecolari (PAMPs) e Listeria monocytogenes è descritto, così come l'accento sulla espressione genica e corrette tecniche di normalizzazione per le proteine.

Il<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Pattern Recognition recettore stimolazione del mouse intestinale organoidi

Descriviamo istruzioni passo-passo a: 1) ingegnerizzare in modo efficiente gli organoidi intestinali utilizzando nanoparticelle magnetiche per la trasduzione lentile o retrovirale e, 2) generare sezioni congelate da organoidi ingegnerizzati. Questo approccio fornisce un potente strumento per modificare in modo efficiente l'espressione genica negli organoidi per lo studio degli effetti a valle.

Ingegneria genetica degli organiidi intestinali dei topi primari utilizzando vettori virali magnetici di trasduzione nanoparticella per la sezionamento congelato

Qui presentiamo due protocolli che consentono la modellazione di interazioni intestinali apicali-specifiche. I monostrati intestinali di derivazione organoide e le colture Air-Liquid Interface (ALI) facilitano la generazione di epitelia ben differenziate accessibili sia dal lato luminare che basolaterale, mentre gli organoidi intestinali invertiti dalla polarità espongono il loro lato apicale e sono suscettibili a test ad alta produttività.

Metodi di coltura per studiare interazioni apicali-specifiche utilizzando modelli organoidi intestinali

Questo protocollo descrive come infettare gli organoidi intestinali umani dal loro lato apicale o basolaterale per caratterizzare le interazioni ospite/patogeno a livello di singola cellula utilizzando la tecnologia di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq).

Adattamento degli organoidi gastrointestinali per l'infezione da agenti patogeni e il sequenziamento di singole cellule in condizioni di livello di biosicurezza 3 (BSL-3)

Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per stabilire organoidi murini dell'intestino tenue, isolare le cellule linfoidi innate di tipo 1 dalla lamina propria dell'intestino tenue murino e stabilire co-colture tridimensionali (3D) tra entrambi i tipi di cellule per studiare le interazioni bidirezionali tra le cellule epiteliali intestinali e le cellule linfoidi innate di tipo 1.

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Qui, presentiamo un protocollo per generare organoidi intestinali di ratto e utilizzarli in diverse applicazioni a valle. I ratti sono spesso un modello preclinico preferito e il robusto sistema di organoidi intestinali soddisfa la necessità di un sistema in vitro per accompagnare gli studi in vivo .

Generazione e manipolazione di organoidi intestinali di ratto

Questo protocollo descrive un approccio per l'esecuzione dell'imaging del calcio in organoidi intestinali umani infettati da virus e offre un approccio all'analisi.

Imaging del calcio vivo di monostrati di organoidi intestinali umani infettati da virus utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati

Lo studio presenta un metodo per l'indagine in vitro delle infezioni batteriche utilizzando organoidi intestinali derivati dalle cellule staminali tissutali. Il protocollo descrive come coltivare e differenziare gli organoidi in due dimensioni, infettarli con Escherichia coli invasiva da aderenti e valutare i dati chiave, tra cui la rottura della barriera epiteliale, l'imaging infezionale e la risposta dell'RNA epiteliale.

Una coltura organoide bidimensionale su estratto di invasina o membrana basale per studiare le interazioni ospite-batteri

Scopri la trasduzione retrovirale in organoidi intestinali primari per studi genetici funzionali. Questo metodo consente l'overespressione o il knockdown inducibile di transgeni in un sistema organotipico in vitro.

Un protocollo video di infezione retrovirale in Primaria intestinale organoide Cultura

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