Name: Hydrogel nanoparticelle raccolta di plasma o nelle urine per il rilevamento di proteine a basso Abbondanza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Impara a utilizzare nanoparticelle di idrogel funzionalizzate per concentrare e rilevare biomarcatori a bassa abbondanza in fluidi biologici come plasma e urine. Questo metodo migliora la sensibilità diagnostica.

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Michael Henry, Dublin City University, gentilmente aiutato con la raccolta e analisi dei dati illustrato in Figura 5. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da (1) George Mason University, (2) l&#39;italiano IstitutoSuperiore di Sanita &#39;nel quadro della Italia / USA accordo di cooperazione tra il Dipartimento di Salute e Servizi Umani, George Mason University, e il Ministero della Salute pubblica italiana, (3) NIH, borse di programma IMAT 1R21CA137706-01 e 1R33CA173359-01 a LAL, e (4) Ceres Nanoscienze, Inc .

Plasma umano e nelle urine sono stati raccolti da donatori volontari sani, con il consenso informato scritto, seguendo George Mason University Institutional Review Board protocolli approvati. I donatori sono stati equamente distribuiti tra maschi caucasici e femmine di età compresa tra 25 e 42 campioni sono stati analizzati individualmente tra e non sono stati riuniti. 1 nanoparticelle Elaborazione di siero o plasma Basso potenziale di biomarcatori abbondanti nel plasma vengono catturati, in soluzione, con nanoparticelle idrogel. Le particelle vengono aggiunti al plasma, incubato, separato per centrifugazione, lavato, e le proteine ​​vengono eluite catturate. Le proteine ​​eluite vengono essiccati in corrente di azoto a valle per il sequenziamento spettrometria di massa e l&#39;identificazione. <ol><li> Diluire 500 ml di siero 1: 2 con 50 mM TrisHCl pH 7 (siero ml 500 + 500 microlitri TrisHCl) in una provetta. </li><li> Aggiungere 500 ml di poli (NIPAM / AAC) nucleo nanoparticoli. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare il campione a 16.100 xg, 25 ° C per 10 minuti in una centrifuga dotata di un rotore ad angolo fisso. Rimuovere e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 500 microlitri tiocianato di sodio (25 mm) al pellet. Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte. </li><li> Centrifugare il campione a 16.100 xg, 25 ° C per 10 minuti in una centrifuga con rotore ad angolo fisso. Rimuovere e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 500 ml di acqua MilliQ al pellet nanoparticella. Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte. </li><li> Centrifugare il campione a 16.100 xg, 25 ° C per 10 minuti in una centrifuga con rotore ad angolo fisso. Rimuovere e scartare il surnatante. </li><li> Preparare il tampone di eluizione fresco: Aggiungere 700 ml di acetonitrile idrossido di ammonio 300 microlitri in una provetta pulita. Attenzione: idrossido di ammonio è corrosivo. Usare con ventilazione adeguata. Nota: Il buffer di eluizione devono essere prepared immediatamente prima dell&#39;uso. Non conservare il tampone di eluizione. </li><li> Aggiungere 300 ml di tampone di eluizione al pellet nanoparticelle. Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare il campione a 16.100 xg, 25 ° C per 10 minuti in una centrifuga con rotore ad angolo fisso. Rimuovere e conservare l&#39;eluato in una, provetta etichettata e pulita. </li><li> Ripetere i passaggi 1,9-1,10. Unire i due eluati in una provetta. </li><li> Essiccare gli eluati sotto flusso di azoto in un collettore evaporatore azoto a 42,1 ° C, con flusso d&#39;aria impostata a 8 (Figura 2F). </li><li> Conservare l&#39;eluato essiccata a temperatura ambiente per O / N stoccaggio, oa -20 ° C per la conservazione a lungo termine, prima della spettrometria di massa, western blotting, o test ELISA (opzionale). </li></ol> 2. nanoparticelle Trattamento dei Campioni di urina L&#39;urina normale contiene meno di 30 mg / dl e proteinemeno di 1+ sangue. Tuttavia, molte malattie / condizioni possono alterare i normali livelli di proteine ​​nelle urine e del sangue. Per aiutare a determinare il volume ottimale di nanoparticelle da aggiungere al campione di urine, un esame delle urine viene eseguito prima di nanoparticelle di raccolta. Possono esistere biomarcatori urine in concentrazioni estremamente basse, che possono richiedere l&#39;ottimizzazione del rapporto tra nanoparticelle di volume urinario. Questa procedura descrive nanoparticelle raccolta di campioni di urine per la valle analisi western blot. <ol><li> Raccogliere campioni di urina in un bicchiere di plastica pulito, asciutto. È richiesto un volume minimo di 22 ml. Urine Conservare i campioni a -80 ° C fino al momento di analizzare. </li><li> Scongelare l&#39;urina congelata a temperatura ambiente oa 4 ° CO / N. Mescolare brevemente su vortex. Versare almeno 22 ml di urina in una provetta di polipropilene fondo conico da 50 ml. </li><li> Spin urine in una centrifuga con rotore swing-out a 3.700 xg per 15 min. Decantare l&#39;urina, senza disturbare il pellet, in un ambiente pulito polypr fondo conico da 50 mltubo opylene. Eliminare il pellet. </li><li> Eseguire l&#39;analisi delle urine con un multi-analita &quot;urine con stick reattivo&quot; striscia reagente. Nota: conservare le strisce reagenti in un contenitore ermeticamente chiuso lontano dalla luce diretta del sole e dall&#39;umidità 17, 18. <ol><li> Posare la striscia reagente, a faccia in su, su un fazzoletto di carta pulito e asciutto. </li><li> Utilizzare una pipetta monouso per aspirare 1 ml di urina preparato al punto 2.3. </li><li> Impostare un timer per 2 min, ma non avviarlo. Erogare rapidamente 1 - 2 gocce di urina su ogni pad prova della striscia reagente. Avviare immediatamente il timer. Nota: Non immergere la striscia reagente direttamente nel contenitore urine. Gli indicatori colorante / chimici nella striscia reagente possono potenzialmente percolare fuori della striscia reagente nel contenitore urine. </li><li> Al tempo indicato sul flacone delle strisce di reagente, registrare i risultati qualitativi per i vari analiti sulla striscia reagente confrontando il colore delle singole strisce reagenti alla corrispondente indica codice coloretori sul contenitore del reagente. Tipici normali risultati delle urine sono: (normale o negativo) per il sangue, proteine, leucociti, nitriti, glucosio, chetoni, bilirubina e urobilinogeno; Urine pH (5,5-7,0); peso specifico (1,001-1,020). Nota: Alti livelli di proteine ​​in un campione di urina possono competere con la proteina di interesse per i siti sulle nanoparticelle vincolanti. Per massimizzare la raccolta di proteine ​​con nanoparticelle, l&#39;/ volume di urina volume di nanoparticelle può essere regolato sia per limitare la concorrenza da proteine ​​di alta abbondanza, o può essere ottimizzato per raccogliere le proteine ​​presenti in concentrazioni molto basse. Se il valore di proteine ​​nelle urine è 1+ o superiore, aggiungere 2x volumi di nanoparticelle nella fase 2.5. Se l&#39;analita di interesse è molto basso abbondante proteina, può essere necessario aumentare il volume delle nanoparticelle fino a 2 ml (Figura 3). </li></ol></li><li> Trasferire 20 ml di urina chiarito dal punto 2.3 in una provetta da 50 ml pulito polipropilene fondo conico. Nondisturbare eventuali detriti / pellet che possono essere nel fondo della provetta urina. Aggiungere 200 ml di nanoparticelle per il campione di urina 20 ml. Mescolare brevemente su vortex. Nota: Se il valore di proteine ​​nelle urine è 1+ o superiore, aggiungere 400 ml di nanoparticelle a 20 ml di urina. </li><li> Incubare la miscela urine / nanoparticelle per 30 minuti a temperatura ambiente, senza che a dondolo / miscelazione. </li><li> Centrifugare la sospensione urina / nanoparticelle in una centrifuga dotata di un rotore oscillante a 3.700 xg per 10 min. Nota: se un pellet non è visibile Dopo la centrifugazione, girare i campioni per un ulteriore 2 - 7 min. </li><li> Rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere acqua 500 microlitri MilliQ al pellet nanoparticelle. </li><li> Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte. Trasferire la soluzione di nanoparticelle di un ambiente pulito 1,5 ml provetta. </li><li> Spin le nanoparticelle in una centrifuga dotata di un rotore ad angolo fisso a 16.100 xg per 10 min. Nota: se un pellet non è fol visibileguendo centrifugazione, girare i campioni per un ulteriore 2-7 min. </li><li> Rimuovere e scartare il surnatante. </li><li> Ripetere i punti 2.8 e 2.11 (due volte) con 200 ml 18 MilliQ acqua per lavare le nanoparticelle. </li><li> Preparare il tampone di eluizione fresco: Aggiungere 970 ml di acetonitrile idrossido di ammonio 30 ml in una provetta pulita. Attenzione: idrossido di ammonio è corrosivo. Usare con ventilazione adeguata. Nota: Il buffer di eluizione deve essere preparata immediatamente prima dell&#39;uso. Non conservare il tampone di eluizione. </li><li> Aggiungere 20 microlitri tampone di eluizione al pellet nanoparticelle. Risospendere le nanoparticelle da vigorosamente pipettando su e giù più volte. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Spin i campioni di nanoparticelle a 16.100 xg per 10 min. Rimuovere e conservare il surnatante in una provetta pulita da microcentrifuga da 1,5 ml. Non disturbare il pellet nanoparticelle. Eliminare il pellet nel rischio biologico spazzatura. </li><li> Mettere i campioni in un rack in una cappa. Aprire i tappi e incUbate a temperatura ambiente per 30 min. In alternativa, posizionare i campioni sotto flusso di azoto a 40 ° C fino a secco (1 - 2 ore). </li><li> Aggiungere 15 microlitri tampone Tris-glicina SDS (2x) per i campioni. Riscaldare a 100 ° C in un blocco a calore secco per 5 min con i tappi aperti o fino a quando il volume lasciato nel tubo non è più di 20 microlitri. Nota: non utilizzare un bagno di acqua bollente. L&#39;umidità dal bagno di acqua impedirà l&#39;evaporazione del buffer. </li><li> Posizionare il tappo sui tubi. Rimuovere i tubi dal blocco di calore. Il campione può essere conservato a -80 ° C o utilizzato immediatamente a valle per l&#39;analisi western blot. </li></ol>

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<li>Michael, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue+kallikrein+5+is+a+member+of+a+proteolytic+cascade+pathway+involved+in+seminal+clot+liquefaction+and+potentially+in+prostate+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression.</a> J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).</li>
</ol>

Benjamin Espina è un dipendente di Ceres Nanosciences, Inc. che produce i reagenti utilizzati in questo articolo. Lance Liotta, Alessandra Luchini e Virginia Espina sono titolari di brevetti (brevetto USA 7.935.518 e/o 8.497.137) sulla tecnologia delle nanoparticelle utilizzata in questo articolo. In qualità di dipendenti dell'università, hanno diritto a ricevere royalties da questi brevetti in base alla politica universitaria. Lance Liotta e Alessandra Luchini sono azionisti di Ceres Nanosciences e fanno parte del Comitato Consultivo Scientifico.

Rilevanza clinica Un campione di siero o plasma è pensato per contenere bassa abbondanza di proteine ​​e peptidi in grado di fornire una ricca fonte di informazioni per quanto riguarda lo stato dell&#39;organismo nel suo complesso circolante. Nonostante la promessa di proteomica del siero, ci sono tre barriere fisiologiche fondamentali e gravi contrastare scoperta di biomarcatori e la traduzione di beneficio clinico 10, 11, 16, 25. Pos...

Nonostante il completamento del sequenziamento del genoma umano, non sono stati compiuti progressi significativi in biomarcatori predittivi di identificazione di malattia in stadio precoce, o che la correlazione con il risultato terapeutico, o la prognosi 1. Uno dei motivi di questa mancanza di progresso è che esistono molti biomarcatori potenzialmente significative ad una concentrazione al di sotto del limite di rilevazione di spettrometria di massa convenzionale e altre piattaforme di scoperta biomarker. La spettrometria di massa (MS) e multipla Reaction Monitoring (MRM) hanno una sensibilità di rilevamento tipicamente superiore a 50 ng / ml, mentre la maggior parte degli analiti misurati da test immunologici caduta laboratorio clinico nell&#39;intervallo tra 50 pg / ml e 10 ng / ml . Questo significa che molti biomarcatori, in particolare nella fase iniziale di una malattia non possono essere rilevati da MS convenzionale e MRM 2. Inoltre la presenza di proteine ​​ad alta abbondanza come albumina e immunoglobuline nei fluidi biologici complessi maschera spesso da miliardi di volte excess bassa abbondanza, proteine ​​a basso peso molecolare e peptidi 3, 4. Per questo motivo sono necessari prima di sequenziamento spettrometria di massa e di identificazione diversi passaggi di preparazione del campione. Un tale passo preparatorio impiega l&#39;esaurimento di proteine ​​di alta abbondanza con colonne di esaurimento disponibili in commercio 5-8. Purtroppo questo passaggio porta alla riduzione del rendimento di biomarker candidati perché sono spesso non covalentemente legato al proteine ​​carrier che vengono rimossi. Un&#39;altra sfida è rappresentata dalla stabilità dei biomarcatori candidati ex-vivo una volta che i campioni vengono raccolti. Le proteine ​​sono soggetti a degradazione da proteasi endogene o esogene 9. Nanoparticelle idrogel possono superare queste sfide critiche amplificando la concentrazione biomarcatore putativo a un livello entro l&#39;intervallo del dosaggio, proteggendo la proteina dal degrado 10-13. E &#39;importante notare tha LMW proteine ​​nel sangue sono una miscela di piccole proteine ​​intatte così come frammenti di proteine ​​di grandi dimensioni. Proteine ​​derivate dal tessuto superiore a 60 kDa sono troppo grandi per entrare passivamente il flusso sanguigno attraverso la membrana basale vascolare, ma possono essere rappresentati nel sangue come peptidi o frammenti di proteine ​​14. Il nostro obiettivo è quello di misurare nuovi biomarcatori circolanti che possono essere candidati per la diagnosi precoce della malattia, stratificazione dei pazienti per la terapia e monitorare la risposta alla terapia. Le nostre nanoparticelle sono creati per escludere selettivamente immunoglobuline alta abbondanza e albumina, e contemporaneamente catturare proteine ​​e peptidi più piccoli e la loro concentrazione fino a 100 volte a seconda del volume di partenza. Il nostro gruppo ha identificato una serie di piccoli coloranti organici che possono agire con successo esche molecolari ad alta affinità per le proteine ​​e peptidi. Binding protein-dye è pensato per essere a causa di una combinazione di interazione idrofobica ed elettrostaticas. Gli anelli aromatici sulla colorante interleave con proteine ​​tramite tasche idrofobiche sulla superficie della proteina 11. Le esche, a seconda della loro chimica, mostrano una particolare affinità per le classi selezionate di analiti. Le esche sono in concorrenza con le proteine ​​di trasporto, come l&#39;albumina, per le proteine ​​o peptidi. Il peso proteine ​​/ peptidi a basso peso molecolare diventano intrappolati nella particella. Proteine ​​di elevato peso molecolare come albumina e immunoglobuline viene impedito di entrare particella a causa della capacità setacciatura dovuta al poro restrittiva del idrogel 11 (Figura 1). Nanoparticelle idrogel sono sintetizzati per precipitazione polimerizzazione iniziata da persolfato di ammonio 11. N-isopropilacrilammide (NIPAM), co-monomeri di acido acrilico (AAC) e allilamina (AA) e cross-linker N, N&#39;-Methylenebisacrylamide (BIS) sono autorizzati a reagire a 70 ° C per 6 ore in condizioni diluite 11, 13. L&#39;affinità di legame ad alta percentuale proteica di poli (N isopropilacrilammide-co-acrilico-acido) (poli (NIPAM-co-AAC) nanoparticlesis raggiunto da covalentemente incorporando coloranti-aminoacidi contenenti (es., Coloranti sulfonatedanthraquinonetriazine) nelle nanoparticelle attraverso una reazione ammidazione eseguita in solventi acquosi o organici a seconda delle caratteristiche idrofiliche / idrofobiche dei coloranti 11, 13. sostituzione nucleofila dei gruppi amminici della nanoparticella con l&#39;atomo di cloruro di un colorante anthraquinonetriazine è utilizzata per creare-colorante contenente poli (NIPAM -CO-allilamina) (AA) nanoparticelle 11, 12. Un processo di polimerizzazione in due fasi viene utilizzato per creare nanoparticelle idrogel che contengono un guscio esterno di acido vinylsulfonic (VSA) 11, 13. Nanoparticelle idrogel possono essere applicati a vari fluidi biologici, compreso il sangue intero, plasma, siero, liquido cerebrospinale, il sudore e l&#39;urina. In un passo, in soluzione, il nanoparticles eseguire una rapida (entro pochi minuti) il sequestro e la concentrazione di basso peso molecolare analiti 10, 11, 13, 15-18. Le proteine ​​sono successivamente eluiti dalle nanoparticelle e rilevati mediante Western Blotting 19-21, spettrometria di 10, 11, 13, 15, 18, ​​22 di massa, 23, saggi immunologici / ELISA 10, 11, 15, 18, ​​o fase inversa proteina microarray 16, 24 saggi. Le nanoparticelle funzionalizzate con esche chimiche, e presentando un nucleo o nucleo shell architettura, la cattura e concentrano le proteine ​​in base alle proprietà fisico-chimiche esca / shell. Diversi coloranti incorporati nelle nanoparticelle saranno quindi catturare diversi sottoinsiemi di proteine ​​con diversa efficacia basata sull&#39;affinità colorante, il pH della soluzione, e la presenza / assenza di competere proteine ​​ad alto abbondante 13. Inoltre, la quantità di nanoparticelle in rapporto al volume della soluzione influenzerà la resa di proteine ​​dalle nanoparticelle. Questi aspetti diidrogel nanoparticelle raccolta sono dimostrata utilizzando tre diverse esche nanoparticelle per le proteine ​​raccolta di campioni di plasma che contengono elevate quantità di proteine, e da campioni di urina che in genere non contengono grandi quantità di proteine. In questo protocollo dimostriamo la raccolta e concentrazione fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-alfa) da campioni di plasma mediante poli (NIPAM-co-AAC), Poli (NIPAM / colorante) e nanoparticelle core-shell (Poly (NIPAM-co-VSA)) . Poli (NIPAM / colorante) nanoparticelle sono mostrati a concentrarsi Mycobacterium antigene specie che è stato aggiunto a campioni di urina umana, per imitare Mycobacterium tuberculosis individui infetti.

<table><tbody><tr><td>Nanoparticelle di idrogel</td><td>Ceres Nanoscience</td><td>CS003</td><td>NanoTrap ESP particelle</td></tr><tr><td>18 M&Omega;-cm di acqua</td><td></td><td></td><td>Reagente di tipo 1</td></tr><tr><td>Tris HCl, 50 mM pH 7.0</td><td>VWR</td><td>IC816116</td><td>50 mM, pH 7</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>BDH</td><td>BDH1103-4LP</td><td>Disponibile da VWR</td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio NH4OH</td><td>BDH</td><td>BDH3014</td><td>Disponibile da VWR, dosato al 28-30% NH3</td></tr><tr><td>Sodium tiocianato 25 mM</td><td>Acros Organics</td><td>419675000</td><td>Per campioni di siero/plasma</td></tr><tr><td>Strisce di reagenti per urine multi-analita</td><td>Siemens</td><td>2161</td><td>Per campioni di urina</td></tr><tr><td>Tris-glicina SDS Sample Buffer (2X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC2676</td> Utilizzare <td>a RT per prevenire la precipitazione di SDS</td></tr><tr><td>Incubatore a bagno secco (100 oC) con blocco riscaldante</td><td>Barnstead</td><td>11-715-125DQ</td><td>Non sostituire un bagno d'acqua bollente</td></tr><tr><td>Collettore dell'evaporatore di azoto</td><td>Organomation Associates</td><td>Microvap118</td><td>Per campioni di siero/plasma</td></tr><tr><td>Centrifuga, rotore oscillante</td> Serie <td>Sorvall</td><td>Legend</td><td>Capacità provette 50 ml, rcf 3.700 x g</td></tr><tr><td>Centrifuga, rotore ad angolo fisso</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>Capacità microcentrifuga 1,7 ml, RCF 16.000 x g</td></tr><tr><td>Centrifuga conica da 50 ml&nbsp; provette</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Con tappi a vite per campioni di urina</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-755</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S04782</td><td>Secondi/minuti</td></tr></tbody></table>

hydrogel nanoparticelle raccolta di plasma o nelle urine per il rilevamento di proteine ​​a basso abbondanza

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Scoperta di biomarcatori romanzo gioca un ruolo cruciale nel fornire il rilevamento delle malattie più sensibile e specifica. Purtroppo molti biomarcatori bassa abbondanza che esistono nei fluidi biologici non possono essere facilmente individuati con la spettrometria di massa o immunologici perché sono presenti in concentrazioni molto basse, sono labili, e sono spesso mascherati da proteine ​​ad alta abbondanza, come l&#39;albumina e immunoglobulina. Bait contenente poli (N-isopropilacrilammide) (NIPAM) nanoparticelle a base sono in grado di superare queste barriere fisiologiche. In un passo sono in grado di catturare, concentrare e preservare biomarcatori da fluidi corporei. Analiti basso peso molecolare entrano nel nucleo della nanoparticella e vengono catturati da diversi coloranti chimici organici, che fungono da alta affinità esche proteiche. Le nanoparticelle sono in grado di concentrare le proteine ​​di interesse di parecchi ordini di grandezza. Questo fattore di concentrazione è sufficiente aumentare il livello di proteina tale che le proteine ​​sono all&#39;internolimite di rilevazione di spettrometri di massa attuali, western blotting e saggi immunologici. Le nanoparticelle possono essere incubate con una pletora di fluidi biologici e sono in grado di arricchire notevolmente la concentrazione di proteine ​​a basso peso molecolare e peptidi, escludendo albumina e altre proteine ​​ad alto peso molecolare. I nostri dati mostrano che una piega amplificazione 10.000 nella concentrazione di un particolare analita può essere raggiunto, consentendo spettrometria di massa e test immunologici per rilevare biomarker precedentemente non rilevabili.

Hydrogel nanoparticelle Dimensioni e uniformità Poli (NIPAM-AAC) le particelle sono state prodotte con altissima resa e riproducibilità tra e all'interno di lotti. Le particelle hanno una buona stabilità colloidale a RT per il tempo necessario per l'acquisizione, la memorizzazione e l'eluizione delle proteine ​​(almeno 48 ore), e nanoparticelle precipitazione non è stato osservato (Figura 1) 11. La stabilità colloidale può essere molto importante ...

Diversi biomarcatori patologici non possono essere facilmente rilevati dalle tecniche attuali a causa della loro bassa concentrazione nei fluidi biologici, della presenza di enzimi degradanti e di grandi quantità di proteine ad alto peso molecolare. Le nanoparticelle di idrogel chimicamente funzionalizzate possono raccogliere, conservare e concentrare proteine a bassa abbondanza consentendo il rilevamento di biomarcatori precedentemente non rilevabili.

Hydrogel nanoparticelle raccolta di plasma o nelle urine per il rilevamento di proteine ​​a basso Abbondanza

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere, concentrare e conservare biomarcatori a bassa abbondanza e basso peso molecolare da fluidi biologici a concentrazioni appropriate. Per i saggi proteici standard, ciò si ottiene aggiungendo prima nanoparticelle di idrogel chimicamente funzionalizzate al fluido biologico, a basso peso molecolare. Gli analiti entrano nel nucleo della nanoparticella e vengono catturati da diversi coloranti chimici organici, che agiscono come esche proteiche ad alta affinità.Il secondo passo consiste nel separare le particelle dal biofluido mediante centrifugazione. Le nanoparticelle concentrano le proteine di interesse di diversi ordini di grandezza. Le nanoparticelle vengono quindi lavate con acqua per rimuovere le proteine estranee.Il passaggio finale consiste nell'eluire le proteine catturate dalle nanoparticelle. In definitiva, il western blotting, la spettrometria di massa o i saggi amminometrici vengono utilizzati per mostrare la presenza e/o la concentrazione dei biomarcatori di bassa abbondanza raccolti precedentemente non rilevabili. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché le nanoparticelle devono essere lavate e sospese.Senza ostruire la punta della pipetta, le nanoparticelle non si sospendono facilmente come una cellula P.So è necessario pipettare vigorosamente su e giù per sospendere adeguatamente le nanoparticelle dopo la prima incubazione. Con le nanoparticelle, è importante sciacquare le pareti del tubo per raccogliere eventuali residui di nanoparticelle che potrebbero aderire al tubo. Per eseguire l'elaborazione di nanoparticelle di campioni di siero, diluire 500 microlitri di siero umano uno a due con tris da 50 millimolari, HCL pH sette in una provetta da microcentrifuga.Aggiungere 500 microlitri di poli e isop propil acrilammide o poli nipam co monomeri di nanoparticelle di acido acrilico e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi centrifugare il campione a 16, 100 volte G e 25 gradi Celsius per 10 minuti. In una centrifuga dotata di rotore ad angolo fisso, rimuovere e scartare il natina SUP prima di aggiungere 500 microlitri di tiocianato di sodio all'ato al pellet, risospendere le nanoparticelle pipettando energicamente su e giù più volte.Centrifugare il campione come prima e scartare il surnatante prima di aggiungere 500 microlitri di milli Q di acqua al pellet di nanoparticelle. Ancora una volta, sospendere le nanoparticelle pipettando vigorosamente su e giù più volte. Dopo aver girato nuovamente il campione, avevo 300 microlitri di elucian fresco, tamponare e risospendere utilizzando la tecnica dimostrata.Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo una centrifuga finale del campione, rimuovere e conservare l'EIT in una provetta da microcentrifuga con etichetta pulita. Eluire una seconda volta e combinare i due EIT in un'unica microcentrifuga. Due.Quindi, asciugare gli EIT sotto il flusso di azoto e un collettore dell'evaporatore di azoto a 42,1 gradi Celsius con flusso d'aria impostato su sei. Conservare l'EIT essiccato a temperatura ambiente per la conservazione durante la notte o aggiungere 20 gradi Celsius negativi per la conservazione a lungo termine prima della spettrometria di massa, del Western blotting o dei saggi EISA per eseguire l'elaborazione di nanoparticelle di campioni di urina. Raccogliere un volume minimo di 22 millilitri e conservare i campioni a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino al momento dell'analisi.Scongelare l'urina congelata a temperatura ambiente o a quattro gradi Celsius durante la notte. Una volta scongelato, mescolato brevemente su un miscelatore a vortice. Quindi versare almeno 22 millilitri di urina in un tubo di polipropilene a fondo conico da 50 millilitri.Quindi, centrifugare l'urina in una centrifuga con rotore oscillante a 3, 700 volte G per 15 minuti senza disturbare il pellet. Decantare l'urina in una provetta di polipropilene pulita da 50 millilitri a fondo conico e gettare il pellet. Eseguire l'analisi delle urine utilizzando una striscia reattiva con stick di urina multianalita.Appoggiare la striscia di reagenti a faccia in su su un tovagliolo di carta pulito e asciutto. Utilizzare una pipetta usa e getta per aspirare un millilitro di urina. Erogare rapidamente una o due gocce di urina su ciascun tampone reattivo della striscia reattiva.Avviare immediatamente un timer precedentemente impostato per due minuti all'ora indicata sul contenitore della striscia di reagenti. Registrare i risultati qualitativi per i vari analiti nella striscia di reagenti confrontando il colore delle singole strisce di reagenti con i corrispondenti indicatori di codice colore sul contenitore del reagente. I risultati tipici delle urine normali sono caratterizzati da un pH compreso tra 5,5 e 7,0 e un peso specifico compreso tra 1,001 e 1,020.L'urina deve essere negativa per le proteine del sangue, i leucociti, i nitriti, il glucosio, i chetoni, la bilirubina e l'urobilinogeno. Quindi, trasferire 20 millilitri di urina chiarificata in una provetta pulita di polipropilene a fondo conico da 50 millilitri. Non disturbare eventuali detriti che potrebbero trovarsi sul fondo del tubo dell'urina da cui si sta rimuovendo l'urina.Aggiungere 200 microlitri di nanoparticelle al campione di urina da 20 millilitri e mescolare brevemente su un miscelatore a vortice. Quindi incubare la miscela di nanoparticelle di urina per 30 minuti a temperatura ambiente senza oscillare o mescolare. Far girare la sospensione di nanoparticelle di urina in una centrifuga dotata di rotore oscillante a 3, 700 volte G per 10 minuti.Dopo aver rimosso e scartato il surnatante, aggiungere 500 microlitri di acqua Milli Q al pellet di nanoparticelle. Risospendere le nanoparticelle pipettando energicamente su e giù più volte. Trasferire la soluzione di nanoparticelle in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri.Successivamente, far girare le nanoparticelle in una centrifuga dotata di un rotore ad angolo fisso a 16, 100 volte G per 10 minuti. Rimuovere ed eliminare il surnatante prima di ripetere questi passaggi con acqua. Per lavare le nanoparticelle, aggiungere 20 microlitri di tampone di eluizione fresco al pellet di nanoparticelle e risospendere le nanoparticelle pipettando energicamente su e giù più volte.Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare nuovamente i campioni di nanoparticelle prima di rimuovere la trappola senza interrompere il pellet di nanoparticelle e conservando il surnatante in una provetta da microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri. Gettare il pellet nella spazzatura a rischio biologico.Collocare i campioni in un rack in una cappa chimica. Aprire i tappi e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. In alternativa, posizionare i campioni sotto il flusso di azoto a 40 gradi Celsius fino a quando non sono asciutti.Aggiungere 15 microlitri di tampone per campioni SDS di tris glicina ai campioni. Riscaldare a 100 gradi Celsius in un blocco di calore secco per cinque minuti con i tappi aperti o fino a quando il volume rimasto nel tubo non supera i 20 microlitri. Posizionare il tappo sui tubi e rimuovere i tubi dal blocco termico.Il campione può essere conservato a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius o utilizzato immediatamente per l'analisi Western blot a valle. L'elettroforesi su gel 1D con colorazione d'argento dimostra la cattura delle nanoparticelle e la concentrazione del fattore di necrosi tumorale alfa dal plasma umano. La banda che rappresenta il fattore di necrosi tumorale alfa è presente solo nelle EIT delle nanoparticelle designate con la lettera P per le particelle, ma non nelle nanoparticelle surnatanti Funzionalizzate con due diverse esche chimiche, l'acido acrilico o il guscio centrale VSA sono in grado di raccogliere varie concentrazioni di IL 17 dal western blotting al plasma del surnatante e della nanoparticella.EIT dimostra chiaramente la presenza di IL 17 nella banda di 17,5 kilodalton nell'eit, ma non nella nanoparticella surnatante. La raccolta di campioni di urina può rivelare antigeni batterici e citochine in questa pagina SDS colorata d'argento. Analisi di campioni di urina, i campioni nelle corsie U quattro e U sei sono EIT di nanoparticelle da campioni di urina contenenti RET, ESAT sei, una proteina associata a mycobacterium tuberculosis, e IL due, una citochina.Queste proteine sono rappresentate dalle bande prominenti a 15 kilodalton. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come le nanoparticelle di gel possono essere utilizzate per raccogliere, concentrare e conservare biomarcatori a basso abbandono nei fluidi biologici, escludendo contemporaneamente le molecole abbandonate indesiderate, aumentando così notevolmente la sensibilità di rilevamento degli attuali metodi analitici.

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Abbiamo sviluppato una tecnologia basata su pellicola sottile di silice mesoporosa per il recupero selettivo di proteine ​​a basso peso molecolare e peptidi da siero umano. Le proprietà fisico-chimiche delle nostre chip mesoporosi stati finemente sintonizzato per fornire il controllo sostanziale arricchimento peptide e di conseguenza il profilo del proteoma siero per scopi diagnostici.

Basso Peso Molecolare proteina di arricchimento sul film sottili di silice mesoporosi per la scoperta di biomarcatori

Questo manoscritto descrive un protocollo per isolare gli esosomi dall'urina umana utilizzando una tecnica di precipitazione modificata.

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Digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare l'isolamento degli esosomi da siero e Plasma sanguigno umano

Questo protocollo descrive la sintesi e la formulazione di biomateriali idrogel iniettabili, supramolecolari polimeri-nanoparticella (PNP). Vengono dimostrate le applicazioni di questi materiali per la somministrazione di farmaci, la stabilizzazione biofarmaceutica e l'incapsulamento e la consegna delle cellule.

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Viene segnalato l'uso di idrogel fotodegradabili per isolare le cellule batteriche utilizzando uno strumento di battito luminoso ad alta risoluzione. Vengono esaminate le procedure sperimentali essenziali, i risultati e i vantaggi del processo. Il metodo consente l'isolamento rapido ed economico di batteri mirati che mostrano funzioni rare o uniche da comunità o popolazioni eterogenee.

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Viene presentato un protocollo per la determinazione di biomarcatori a bassa abbondanza da campioni di siero essiccati esemplificati con il peptide di rilascio della progastrina biomarcatore (ProGRP). Le sfere magnetiche rivestite di anticorpi sono utilizzate per la pulizia selettiva e l'arricchimento di un peptide ProGRP proteotipico. Il peptide catturato viene successivamente analizzato mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem.

Microcampionamento nell'analisi mirata delle proteine basate sulla spettrometria di massa di proteine a bassa abbondanza

Questo articolo descrive una metodologia per l'isolamento, la caratterizzazione e la quantificazione di vescicole extracellulari (EV) derivate dal plasma umano e presenta un flusso di lavoro per l'analisi label-free del proteoma EV utilizzando cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).

Isolamento, caratterizzazione e analisi proteomica di vescicole extracellulari derivate dal plasma per la scoperta di biomarcatori cardiovascolari

Questo protocollo standardizza l'analisi SDS-PAGE per il profiling personalizzato della corona proteica su nanoparticelle, consentendo una rilevazione riproducibile, scalabile e a basso costo di firme specifiche per il cancro. Progettato per la diagnosi precoce dell'adenocarcinoma del pancreas duttale, offre un'alternativa pratica e ALLINEATA a REASSURED rispetto ai complessi metodi proteomici sia in ambito di ricerca che clinico.

Flusso di lavoro standardizzato SDS-PAGE per la profilazione personalizzata della corona proteica nella diagnosi precoce del cancro

Un versatile tecnica di litografia plasma è stata sviluppata per generare modelli di superficie stabile per guidare l'attaccamento cellulare. Questa tecnica può essere applicata a creare reti di cellule, comprese quelle che imitano i tessuti naturali ed è stato utilizzato per lo studio dei diversi tipi di cellule distinte.

Plasma Surface Patterning litografia per la creazione di reti di cella

Impara a utilizzare nanoparticelle di idrogel funzionalizzate per concentrare e rilevare biomarcatori a bassa abbondanza in fluidi biologici come plasma e urine. Questo metodo migliora la sensibilità diagnostica.

Hydrogel nanoparticelle raccolta di plasma o nelle urine per il rilevamento di proteine ​​a basso Abbondanza

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