Name: Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: Scopri come stimare la costante di dissociazione delle interazioni proteina-ligando utilizzando la fluorimetria a scansione differenziale. Questo metodo rapido richiede solo quantità moderate di campione.

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Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del BBSRC (numero di sovvenzione BB/H019685/1 e BB/E527663/1) all'Università di Exeter.

1 Determinazione di un valore approssimativo per la costante di dissociazione (cioè, entro un ordine di grandezza) <ol><li> Preparare l&#39;impasto indicato nella tabella 1. </li><li> Preparare scorte del ligando di interesse a più alta concentrazione disponibile, e poi a sei dieci diluizioni al raddoppio del presente. Qualora un approssimativo K d è noto dai dati precedenti, puntare ad avere almeno due concentrazioni al di sopra e al di sotto del K d. </li><li> Aliquota 18 ml della miscela in otto pozzetti in un piatto qPCR. Aggiungere 2 ml di solvente per il primo pozzo. Aggiungere 2 ml di ciascun membro della serie di diluizioni ligando (punto 1.2) per un bene ciascuno dei rimanenti sette pozzi. </li><li> Posizionare una guarnizione qPCR sopra la piastra. Per ottenere una buona tenuta della piastra, posizionare un applicatore mano (vedi tabelle di reagenti specifici) al centro della piastra. Smooth premuto il sigillo di lato e ripetere sull&#39;altra metà dila piastra. </li><li> Centrifugare la piastra a 500 xg per due minuti per rimuovere le bolle d&#39;aria. </li><li> Porre la piastra in uno strumento StepOne qPCR. Selezionare l&#39;opzione &quot;curva Melt&quot;, i filtri ROX, e scegliere la velocità di rampa veloce (questo fornisce una pausa di 2 min a 25 ° C, seguita da una rampa a 99 ° C oltre 40 minuti, e poi 2 minuti di pausa). Eseguire un denaturazione termica. NOTA: I file di script per l&#39;esecuzione di una corsa sono disponibili online all&#39;indirizzo http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Al termine della corsa dello strumento, fare clic sul pulsante &quot;Analizza&quot; sullo schermo. Salvare il file risultato. </li><li> Aprire il software Protein Maiusc termica. <ol><li> Creare un nuovo studio; nella scheda delle proprietà, dare a questo un nome, e nella scheda Condizioni, dettaglio i ligandi. </li><li> Passare alla scheda File Experiment, e importare il file salvato risultati (XXX.eds), e impostare il contenuto di ogni pozzetto (template files sono disponibili presso gli autori). </li><li> Passare alla scheda Analisi, e premere il pulsante &quot;Analizza&quot;. NOTA: Questo analizzerà i risultati. E &#39;possibile esportare i risultati di ulteriori indagini con Excel utilizzando la scheda Esporta. I risultati vengono esportati in un formato scheda delineata. E &#39;meglio aprire il file esportato in Excel, e immediatamente salvare in formato Excel. </li></ol></li><li> Verificare che la proteina in presenza del solo solvente dà un risultato simile a quello mostrato nella Figura 1A. Avanti, esaminare le temperature di fusione osservate nei risultati nel riquadro &quot;replicare&quot;. Assicurarsi che questa mostra un chiaro aumento della temperatura di fusione con l&#39;aumento della concentrazione di ligando. NOTA: Idealmente, questo fornirà un chiaro temperatura massima di fusione (supponendo che la proteina è completamente ligando legato), e un approssimativo K d dove la temperatura di fusione è a metà strada tra la proteina-ligando libero eil massimo. </li></ol> 2 set-up sperimentale per la determinazione della costante di dissociazione <ol><li> Preparare l&#39;impasto indicato nella tabella 2 come master mix. </li><li> Preparare le scorte di legante a quindici diverse concentrazioni, che saranno diluiti dieci volte l&#39;esperimento finale. Idealmente, includere le concentrazioni di almeno due ordini di grandezza al di sopra e al di sotto della stima K d, e centrare le concentrazioni sul stimata K d. Focus su sette dei punti all&#39;interno di un ordine di grandezza della stima K d, con altri quattro punti su entrambi i lati di questo; se vi è una scelta, includere più punti a valori che stanno saturando. NOTA: Se necessario, è possibile modificare le condizioni sperimentali in modo tale che le scorte ligando sono al doppio della concentrazione sperimentale, dove ligando solubilità è limitante. </li><li> Aggiungere 120 ml di mastermescolare a otto pozzetti in una piastra ben fondo a U 96, a fungere da serbatoio per una comoda erogazione del master mix. Utilizzare una pipetta a 8 canali per erogare 18 microlitri in una colonna di una piastra PCR. Ripetere per altri cinque colonne, per un totale di 48 pozzetti riempiti in un modello 6 x 8 sulla piastra. </li><li> Aggiungere 20 ml di stock ligando, o il solvente, pozzetti in una piastra ben U-fondo 96. Usando una pipetta a 8 canali, aspirare 2 ml di otto diversi stock ligando (o solvente). Aggiungi questi per una colonna della piastra PCR che era pieno di master mix al passo 2.3. Ripetere con gli stessi otto ligando / scorte solvente per due ulteriori colonne. Aspirare 2 ml di restanti otto titoli leganti o solventi, e aggiungere questi per una quarta colonna nel piatto. Ripetere questa operazione per altre due colonne. Questo darà campioni in triplicato per tutti i 16 campioni di legante e solvente. </li><li> Inserite un sigillo qPCR sopra la piastra (vedi passo 1.4). </li><li> Centrifugare la piastra a 500 xg perdue min. </li><li> Posizionare la piastra nello strumento qPCR. Eseguire una denaturazione termica utilizzando i parametri specificati al punto 1.6. </li><li> Al termine della corsa dello strumento, fare clic sul pulsante &quot;Analizza&quot; sullo schermo. Salvare il file risultato. </li><li> Aprire il software Protein Maiusc termica. Creare un nuovo studio; nella scheda delle proprietà, dare a questo un nome, e nella scheda Condizioni, dettaglio i ligandi. </li><li> Passare alla scheda File Experiment, e importare il file salvato risultati (XXX.eds), e impostare il contenuto di ciascun pozzetto. NOTA: file di modello sono disponibili online all&#39;indirizzo http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Passare alla scheda Analisi, e premere il pulsante &quot;Analizza&quot;. <ol><li> Selezionare la scheda &quot;replicati&quot; dal menu sul lato sinistro dello schermo per mostrare i risultati come triplica. Valutare l&#39;affidabilità dei dati in base a come sono stretti i triplica. Should i triplicato mostrano scarsa riproducibilità, esaminare i dati grezzi da vicino. </li><li> Analizzare i dati utilizzando sia il Boltzmann o metodi derivati ​​per valutare la temperatura di fusione. Selezionare la scheda &quot;Replicare risultati&quot;, e nella &quot;Replica risultati complotto&quot;, spostare il &quot;complotto:&quot; tasto tra &quot;Tm - Boltzmann&quot; e &quot;Tm - Derivata&quot;. Selezionare il metodo che conferisce maggiore riproducibilità per il campione. Esportare i risultati di ulteriori indagini con Excel utilizzando la scheda Esporta. NOTA: Per i campioni che mostrano molteplici transizioni, è quasi sempre meglio usare il metodo Derivata in modalità multipla fusione. I risultati vengono esportati in un formato scheda delineata. E &#39;meglio aprire il file esportato in Excel, e immediatamente salvare in formato Excel. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento almeno due volte, tra cui una ripetizione in un giorno separato, al fine di garantire la riproducibilità dei risultati. In caso di analisi dei dati (vedere il punto 3 di seguito)indicano che il valore di K d è significativamente diverso alla stima originale, alterare le concentrazioni di ligando di conseguenza (vedi punto 2.2) per garantire una buona gamma di valori intorno K d. </li></ol> 3 Analisi dei dati per determinare la costante di dissociazione sotto denaturazione termica <ol><li> Creare una tabella in Excel delle concentrazioni di ligando e la temperatura di fusione. </li><li> Aprire il software GraphPad Prism, e creare una tabella XY. Inserire i dati, utilizzando la colonna X per le concentrazioni di ligando e la colonna Y per la fusione risultati di temperatura. NOTA: un esempio è mostrato Figura 1B. Uno script con equazioni precaricati, e le istruzioni alternative per l&#39;utilizzo del pacchetto statistico SPSS, è disponibile online all&#39;indirizzo http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Nella scheda Analisi, selezionare l&#39;opzione per cambiare il parametro di analisis (Ctrl + T). Per inserire il modello corretto, selezionare &quot;Nuovo&quot; e &quot;Crea nuova equazione&quot;. Inserire l&#39;equazione indicato nella Tabella 3 come &quot;legame unico sito ligando&quot;. NOTA: Un esempio di questi passi è mostrato in Figura 1C. Quando si utilizza lo script con le equazioni precaricati, l&#39;equazione in questione può essere diretto scelti dalla lista piuttosto che inseriti. Derivazione di questa equazione è riportato in appendice. </li><li> Selezionare il &quot;Regolamento per i valori iniziali&quot; casella e inserire le regole per i valori iniziali come indicato nella tabella 3. </li><li> Vincolare il parametro P, come &quot;costante uguale a&quot; e inserire la concentrazione finale di proteine ​​(nelle stesse unità come il legante è dato in). </li><li> Selezionare OK per eseguire l&#39;analisi. NOTA: Un esempio di questi passi è mostrato in Figura 1D. Il software grafica produce una figura che mostra i dati e l&#39;adattamento al modello. Esempi di tanalisi hese sono riportati nei dati rappresentativi. </li></ol> 4. Montaggio dati a modelli cooperativi Per inserire i dati di un modello cooperativo, scegliere tra una un semplice modello cooperativo, o un modello in cui sono definite due costanti di dissociazione separati. Il primo approccio è preferito nel caso di cooperatività negativa, o come un primo esame. Tuttavia, in linea di principio è meglio in caso di cooperatività positiva per modellare due diverse costanti di dissociazione 18. In questo caso, la modellazione può procedere assumendo o sequenziale legame di ligandi, o un legame indipendente di leganti. <ol><li> Seguire gli stessi passi iniziali come nel protocollo 3 Tuttavia, al punto 3.3, inserire una delle equazioni nella tabella 3 elencata come &quot;Simple modello cooperativo&quot;, &quot;sequenziale vincolante di due ligandi&quot;, o &quot;Independent legame di due ligandi&quot; 18. </li><li> Selezionare le regole per i valori inizialiassociato a ciascuna di queste equazioni nella tabella 3. </li><li> Esaminare l&#39;adattamento del modello ai dati. Qualora i dati adattarsi male, prendere in considerazione un altro modello. NOTA: è anche importante esaminare con attenzione il montaggio della temperatura di fusione di dati da parte del software Maiusc termica Protein (passo 2,9): a volte è necessario modificare i parametri qui per ottenere i migliori risultati. Un&#39;altra considerazione è se la gamma di punti dati è l&#39;ideale, e se ci sono punti anomali: o una serie limitata di dati su entrambi i lati di K d, o un unico punto anomalo (specialmente alle più alte concentrazioni di ligando), può influenzare in modo significativo i risultati. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento almeno due volte (vedi punto 2.12) per garantire la riproducibilità. </li></ol> 5. Montaggio dei dati per le curve che indicano Spostamenti binari in fusione Temperatura Di tanto in tanto, piuttosto che una risposta graduata a ligando, le proteine ​​sono stateosservato adottare una risposta binaria, dove campione legata sia chiaramente separata dalle campione non legato. Un esempio è fornito nei risultati rappresentativi (Figura 4). In questo caso, il montaggio delle temperature di fusione non fornirà una buona misura per K d. <ol><li> Esportare l&#39;output di dati grezzi dal Proteine ​​software Maiusc termica. Per ogni punto di temperatura, calcolare la fluorescenza media per il ligando zero e alte concentrazioni di ligando. Tabulare i risultati di ciascun punto dati accanto a questi. NOTA: L&#39;errore creato qui è inferiore errore nelle temperature di fusione a muro. </li><li> Aprire il pacchetto statistico SPSS. Copiare le temperature, le due serie di dati medi, e dati per ogni esperimento di una finestra di dati in SPSS. Nella scheda variabile, impostare il set di dati media per nessun ligando come &quot;Low&quot;, e il set di dati media per la più alta concentrazione di ligando come &quot;alto&quot;. </li><li> Scaricare il file di sintassi disponibileonline all&#39;indirizzo http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular</a> . Selezionare &quot;Esegui → Esegui tutti&quot;. </li><li> Copiare la proporzione risultati legati ad una nuova cartella di lavoro di Excel, con le relative concentrazioni di ligando. </li><li> Aprire il software GraphPad, e creare una tabella XY. Inserire i dati, utilizzando la colonna X per le concentrazioni di ligando e la colonna Y per la fusione risultati di temperatura. Nella scheda di analisi, selezionare &quot;Parametri cambiamento di analisi&quot;. Per inserire il modello corretto, selezionare &quot;Nuovo&quot; e &quot;Crea nuova equazione&quot;. Inserire l&#39;equazione data nella tabella 3, indicato come &quot;Analisi degli spostamenti binari a temperatura di fusione&quot;. </li><li> Selezionare la casella &quot;Norme per valori iniziali&quot;, e inserire le regole per i valori iniziali specificati nella tabella 3. Vincolare il parametro P, come &quot;costante uguale a&quot; e inserire la concentrazione finale di proteine ​​(nelle stesse unità della ligand è dato in). NOTA: esempi di completare queste scatole per il protocollo nella sezione 3 sono mostrati in figura 1C, D. </li><li> Se c&#39;è una buona misura, i risultati possono essere migliorati estrapolando al risultato atteso a una concentrazione del ligando infinita. Dal modello della percentuale legata a ciascuna concentrazione ligando, esaminare il valore per il valore più alto di concentrazione di ligando. Se questa è la 0.99 o superiore, ulteriori analisi è improbabile per migliorare i risultati. </li><li> Se la proporzione è minore di 0,99, un passaggio aggiuntivo è richiesto per correggere gli effetti della proteina non legata nel più alto campione concentrazione del ligando. Al punto 5.2, scrivere la percentuale di legante legato al più alto punto di concentrazione del ligando (dal punto 5.7) nella cella R2 (una cella diversa può essere utilizzato, e R2 sostituito opportunamente nell&#39;equazione nella tabella 3). Creare una colonna supplementare dopo la media dei risultati più alti di concentrazione ligando. Negli abeticellule T, copiare l&#39;equazione elencati nella Tabella 3 come &quot;estrapolazione all&#39;infinito concentrazione di ligando&quot;. Copia questa formula per le celle rimanenti in questa colonna. NOTA: Questo calcolo elimina l&#39;effetto della proteina non legata a più alta concentrazione di ligando. La differenza tra la proteina ligando libero e la più alta concentrazione ligando viene moltiplicato per il reciproco della proporzione vincolato alla massima concentrazione ligando per fornire la differenza attesa tra stati proteiche completamente legati e non legati ad ogni punto di temperatura. Questa differenza viene aggiunto o sottratto dallo stato non legato per dare la fluorescenza previsto per la proteina legante completamente legata. </li><li> Sostituire la colonna di concentrazione massima ligando nella scheda tecnica SPSS con questa nuova rubrica, e ripetere il raccordo dei dati. NOTA: i passaggi 5,7-5,9 può avere bisogno di essere ripetuta se il modello suggerisce un ulteriore cambiamento significativo della percentuale legata ai concentrazi massime ligando(se questo è il caso, probabilmente sarebbe l&#39;ideale per ripetere l&#39;esperimento con un più alto punto di concentrazione del ligando incluso). </li><li> Nei casi in cui la proteina mostra un comportamento cooperativo traslazione binaria e display, l&#39;equazione suggerito nel passaggio 5.5 dovrebbero essere sostituite con quelle dal punto 4.1. I parametri &quot;bottom&quot; &quot;Top&quot; e dovrebbero essere sostituiti da 1 e 0, rispettivamente. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento almeno due volte (vedi punto 2.12) per garantire la riproducibilità. </li></ol></li></ol>

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<li>Wan, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+fluorimetry+as+secondary+screening+platform+for+small+molecule+inhibitors+of+Bcl-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL.</a> Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).</li>
<li>Koropatkin, N. M., Holden, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+alpha-D-glucose-1-phosphate+cytidylyltransferase+from+Salmonella+typhi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi.</a> J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nulla da rivelare.

Fluorimetria differenziale a scansione ha dimostrato il suo potere come un metodo robusto e versatile per la caratterizzazione delle proteine, e identificare potenziali ligandi proteici. I successi ben documentati in expediting stabilizzazione proteica, la scoperta di farmaci (in particolare nei laboratori meno ben finanziati) e cristallizzazione 10,23-25 ​​hanno reso un metodo interessante per lo screening iniziale dei composti. Composti aggiunti alle proteine ​​mostrano una dose di chiara dipendente aumento della temperatura di fusione apparente 7,9. Tuttavia, ci sono stati alcuni tentativi di utilizzare i risultati di questi esperimenti per determinare le costanti di legame apparente per aiutare nella classifica composti per la loro affinità. Qui, presentiamo un metodo per determinare sistematicamente una costante di dissociazione apparente di proteine ​​in presenza di un ligando. I risultati qui presentati dimostrano che DSF può rapidamente e robusta fornire stime della costante di dissociazione peruna combinazione di proteina-ligando. I dati osservati possono essere manipolati con gli strumenti disponibili in commercio di fornire una rapida determinazione di K d, senza la necessità di effettuare assunzioni riguardanti il valore probabile di parametri. Il metodo ha un vantaggio significativo su alcuni metodi comparabili di essere parsimoniosi in proteine ​​e tempo necessario. L'esperimento descritto qui consumerà 0,13 mg di proteine ​​per dell'esperimento (circa 0,4 mg per esperimenti ripetuti in triplice copia). Questo confronto con Calorimetria isotermica di titolazione (ITC), in cui un singolo esperimento con una media di 40 kDa consumerà un importo simile. La serie completa di esperimenti necessari per questo protocollo sarebbe consumare circa 4 ore, compresa la preparazione, per un singolo set di esperimenti. Ancora una volta, questo è probabile che sia molto più veloce di metodi come ITC o risonanza plasmonica di superficie, che pur potenti spesso richiedono notevole ottimizzazione per ottenere migliori dati. I nostri risultati dimostrano che permane l'obbligo di esaminare attentamente i dati grezzi, la misura di questi dati per determinare la temperatura di fusione, e la misura dei dati di temperatura di fusione per determinare la costante di dissociazione. Un primo problema è la forma dei dati grezzi prodotti nella proteina di fusione. In alcuni casi, la forma non può approssimare a quello osservato nella Figura 1A. Problemi comuni includono bassi turni di temperatura sulla ligando vincolanti, sfondo di alta fluorescenza, e inusuali più transizioni di temperatura. A bassa temperatura turni sono visti sul legame un numero di ligandi. Per questo metodo, il parametro più critico è l'errore nella misurazione T m, rispetto al cambiamento di temperatura. I dati di solito può essere montato abbastanza bene quando la deviazione standard delle misurazioni triplice copia non supera il 10% del turno di temperatura di fusione tra proteine ​​non legato e completamente legato. La nostra esperienza è che quando tale temperaturaturni lette- sono solo 2 ° C, questo può essere sufficiente per il montaggio dei dati, se i singoli punti di dati sono molto accurate. Un secondo problema è insolitamente a forma di curve. Questi spesso differiscono tra proteina libera e forme ligando legato, come il legame ligando influisce modalità della proteina dispiegarsi. In questi casi, l'utente deve esaminare se i dati possono essere utilizzati con idonei considerazione dei modelli da utilizzare per la determinazione della temperatura di fusione e la costante di dissociazione. Un altro problema comune è che l'aggiunta di un cofattore per la proteina (ad esempio, MgCl 2 nel nostro esempio con esochinasi) è necessario per ottenere i dati più affidabili. La nostra esperienza è stata che un attento esame di tutti i fattori che possono nell'esperimento in fase di prendere dei valori iniziali è essenziale per ottenere i migliori risultati. Inoltre, i trattamenti teorici alternativi possono rivelare le caratteristiche di questi dati 15,17. Infine, non è raro che alcune proteine ​​che contain nativamente esposto regioni idrofobiche di mostrare sfondo ad alta fluorescenza. Ci sono una serie di soluzioni a questi problemi, che sono stati ampiamente recensito altrove 6,9. In particolare, l'utente deve valutare se usare la Boltzmann o modelli derivati ​​(ad esempio, figura 4), ​​e nel caso di utilizzo di derivati, se più fusi devono essere modellati. I due metodi di modellazione del dispiegamento termico differiscono dal fatto che il metodo di Boltzmann adatta ai dati sperimentali di Boltzmann, assumendo una forma sigmoidale regolare la curva di dispiegamento. Al contrario, il metodo derivato prende la derivata prima dei dati sperimentali in ogni punto (pannello inferiore nella Figura 1A), e considera la temperatura di fusione di essere il punto di massima derivata prima. Il metodo derivato restituisce generalmente una temperatura di fusione più elevata di circa 2 - 3 ° C. La maggior parte delle proteine ​​torneranno una più coerenterisultato (ovvero, l'errore standard della temperatura di fusione per esperimenti in triplo è inferiore) per uno dei due metodi. Questo è di solito intimamente legata alla forma precisa della proteina dispiegarsi curva, ed è necessario determinare empiricamente il metodo migliore in ciascun caso. Quando viene utilizzato il modello derivato, è anche importante considerare più eventi di fusione. Alcuni dati mostrano chiaramente le prove per più transizioni, e in questi casi i risultati sono suscettibili di essere più facile da interpretare, se questi eventi di fusione più sono modellati. Nel contesto di questo protocollo, è spesso il caso che l'aggiunta del ligando può causare una proteina di passare da avere più transizioni di fusione di una singola transizione (ad esempio, stabilizzando il sottodominio più fragile termicamente), o viceversa. Vorremmo quindi sostenere che i dati grezzi vengono esaminati insieme prima di considerare quale approccio sarà meglio usare. Seguendo il modelling delle singole temperature di fusione, ulteriori problemi possono sorgere in raccordo questi per i modelli presentati nella sezione del protocollo. E 'indispensabile esaminare attentamente la misura di dissociazione equazione costante utilizzando una scala logaritmica, in quanto questa analisi evidenzia spesso discrepanze tra i dati osservati e il modello (es., Figura 3). Sebbene i risultati ottenuti sono generalmente robusti, cura nella interpretazione offre la possibilità di estrarre i risultati migliori, e più significato, dai dati. Un particolare problema sollevato da questi dati è l'interpretazione che deve essere posizionato su proteine ​​che mostrano cooperatività, o più eventi vincolanti, in DSF. Abbiamo, ad oggi, solo osservato questo fenomeno in proteine ​​che sono tenuti ad avere più eventi di legame specifici (ad esempio, WCBM, una proteina il cui omologo migliore è un Multimer 26, e che agisce come un Multimer sulla dimensione cromatografia di esclusione [dati nonmostrato]). Non è affatto chiaro che la cooperatività negativa osservata in DSF denaturazione indica che l'enzima mostrerà infine cooperatività negativa: anzi, questo può essere un indizio del legame complesso che deve essere esplorato più a fondo utilizzando una vasta gamma di metodi. Ciò suggerisce a noi, però, che più studi approfonditi di tali proteine ​​sono suscettibili di individuare gli effetti interessanti. I valori indicati per la costante di dissociazione con questo metodo sono generalmente dello stesso ordine di quelli forniti da altri metodi, come ad esempio Calorimetria isotermica di titolazione e risonanza plasmonica di superficie. Tuttavia, i valori assoluti osservati sono spesso superiori a quelli osservati con questi metodi. Questo è almeno in parte una conseguenza del fatto che la costante di dissociazione si osserva alla temperatura di fusione della proteina con ligando. Questo Kd è generalmente superiore a quella a temperature fisiologiche. Il dissociation costante è correlata alla temperatura della reazione dalle equazioni: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg"> [1] <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg"> [2] (Dove c θ è la concentrazione di riferimento standard, Δ r G è la variazione di energia libera di Gibbs della reazione, R è la costante dei gas molare, Δ H è la variazione di entalpia nella reazione, e Δ S è la variazione di entropia nella reazione .) Reazioni con costanti di dissociazione nell'intervallo misurabile di questo metodo generalmente hanno un negativo Δ r G, e quindi l'effetto di un aumento della temperatura sulla equazione [1] saranno aumentare la costante di dissociazione. Entrambi i termini Δ H e Δ S che costituiscono l'energia libera di Gibbs (equazione [2]) sono temperature 27 dipendenti, e l'effetto sulla costante di dissociazione dipenderanno dalla grandezza e segno di queste dipendenze di temperatura, e saranno necessariamente interazione dipendente. Di conseguenza, non è inaspettato che le costanti di dissociazione determinate con questo metodo sono a volte superiori a quelli determinati con metodi che operano a RT. Dipendenza dalla temperatura è, naturalmente, anche un avvertimento di molti altri metodi, che tendono a fornire la costante di dissociazione a temperature inferiori alla temperatura fisiologica. Un altro avvertimento del metodo DSF è che è un metodo marcato, a differenza ITC. L'etichetta fluorescente utilizzato (SYPRO arancione) è idrofobo, e così in alcuni casi può competere con il legame di ligandi idrofobici alle proteine. Di conseguenza, è probabile che in alcuni casi, la costante di dissociazione ottenuto sarà artificialmente elevato a causa della competizione con l'etichetta. Tuttavia, per il confronto di diversi ligandi, (l'uso primario diDSF), le differenze è improbabile che siano sufficientemente significativo ai fini della graduatoria di composti per affinità. Un potenziale svantaggio di questo metodo è il limite di rilevamento che può essere raggiunto. In linea di principio, non dovrebbe essere possibile misurare con precisione un valore per K d, che è inferiore al 50% della concentrazione di proteine, e anche i valori di questa gamma sono suscettibili di essere di dubbia precisione. Mentre il limite di rivelazione in questo fine dell'intervallo può essere esteso un po riducendo le concentrazioni di proteine ​​e colorante, la sensibilità dello strumento impedirà un'ulteriore riduzione della concentrazione proteica. Analogamente, l'estremità superiore della sensibilità sarà determinata dalla solubilità del ligando. Per ottenere una stima matematicamente robusto per K d, è molto importante per ottenere dati con il 90% delle proteine ​​presenti nella forma ligando-bound, che richiede concentrazioni di ligando ad essere approssimativaly dieci volte K d (supponendo che non cooperatività). Il limite di rivelazione sarà quindi necessariamente essere un decimo della solubilità del ligando nel buffer pertinente. Ciò significa che i limiti di rivelazione del metodo in genere compresi tra 1 mM e tra 1 e 100 mm, a seconda della proteina e ligando. In conclusione, a scansione differenziale fluorimetria è una tecnica versatile applicabile ad una vasta gamma di proteine. Usando i metodi qui presentati, è possibile determinare rapidamente ed economico l'affinità di una proteina per diversi ligandi. Questo ha un grande potenziale per l'applicazione nella purificazione della proteina e la stabilizzazione, chiarendo la funzione o la specificità degli enzimi provenienti da metagenomi, e nella scoperta della droga, soprattutto nei piccoli laboratori.

Tutte le proteine ​​si legano, con affinità diverse, ad una vasta gamma di altre molecole di ioni semplici ad altre grandi macromolecole. In molti casi, le proteine ​​si legano a molecole piccole parti come parte della loro normale funzionamento (ad esempio, una chinasi legame ATP). Altre interazioni possono essere estranei alla funzione, ma sono sperimentalmente utili come strumenti (ad esempio, piccole molecole che stabilizzano le proteine ​​per migliorare il successo di cristallizzazione, o aiutare a mantenere le proteine ​​in soluzione); mentre piccole molecole che si legano ai siti attivi e siti allosterici di proteine ​​può agire come inibitori, e quindi modulare l&#39;attività degli enzimi. Vi è un&#39;ampia gamma di tecniche che possono essere utilizzate per determinare l&#39;affinità di proteine ​​per molecole partner. Calorimetria isotermica di titolazione 1 è ampiamente considerato come un &quot;gold-standard&quot;, in quanto fornisce informazioni sulle reazioni ricco, è l&#39;etichetta libera, e ha limitato le opportunità per unrtifacts dell&#39;esperimento. Tuttavia, nonostante i recenti miglioramenti nella sensibilità della strumentazione e automazione del set-up sperimentale, è ancora relativamente costoso in termini di fabbisogno proteico, ha al massimo un rendimento basso-medio, ed è più adatto alle interazioni con moderata a affinità alta (10 Nm a 100 mM K d) 2. Altra etichetta metodi gratuiti come risonanza plasmonica di superficie o doppio strato interferometria 3 offerta throughput più elevati, e hanno raggiunto la sensibilità per rilevare molecole più piccole a partire da 100 bis. Tuttavia, gli strumenti high throughput per questi metodi sono relativamente costosi, sono giustificati solo se ci sarà un continuo rendimento di progetti rilevanti, e quindi sono suscettibili di essere inaccessibile a molti laboratori universitari. Fluorimetria differenziale a scansione (DSF, o thermofluor) è stato descritto nel 2001 4 come metodo per la scoperta di nuovi farmaci. In questo metod, proteine ​​vengono incubati con un colorante fluorescente (stati usati coloranti inizialmente naftalen-solfonico), che ne modifica la fluorescenza dopo il legame alle regioni idrofobiche delle proteine. Il campione di proteina-colorante viene poi riscaldata, e la fluorescenza monitorato come aumenta il calore. Il dispiegamento della proteina, e l&#39;esposizione di parti idrofobiche della proteina, dà luogo ad un pattern caratteristico della fluorescenza in funzione della temperatura (Figura 1A). L&#39;esperimento può essere eseguita in piccoli volumi in qualsiasi strumento commerciale quantitativa PCR, e quindi in un singolo esperimento, un gran numero di campioni può essere simultaneamente testati (solitamente 48, 96 o 384 campioni, a seconda del modello di strumento). Esperimenti di solito può essere eseguita in circa un ora, fornendo la possibilità di alto rendimento analisi dei campioni 5. Ulteriori miglioramenti della metodologia hanno visto l&#39;adozione di coloranti con migliori proprietà spettrali 6,7 </sup&gt;, strumenti generici per l&#39;analisi dei dati, e suggerito protocolli per lo screening iniziale di 8,9. La gamma di applicazioni del metodo è stato esteso, con un focus particolare sulla creazione di condizioni ottimali per la preparazione e la conservazione delle proteine ​​10, e sull&#39;identificazione di potenziali partner di legame per aiutare la cristallizzazione 11. Il relativamente alto rendimento del metodo, costo relativamente basso contenuto di proteine ​​(~ 2 mg per reazione), e l&#39;applicabilità di studiare molecole leganti deboli ha fatto DSF uno strumento prezioso per frammento basato progettazione di farmaci, soprattutto in un contesto accademico 12-14. Nonostante l&#39;ampia applicazione di DSF per studiare le interazioni proteina-ligando, pochi studi hanno descritto determinazione delle costanti di dissociazione da questi studi. Tuttavia, questi hanno la tendenza a produrre equazioni dettagliate che descrivono lo svolgersi della proteina, con molti parametri che devono essere installati i dati sparsi o in alcuni casi estimated 7,15-17. Questi metodi sono di particolare rilevanza nei casi difficili, come ad esempio i composti strettamente vincolanti, o proteine ​​che mostrano le transizioni insolite. Tuttavia, per molti laboratori, queste analisi dettagliate sono troppo ingombranti per l&#39;uso di routine. Proponiamo quindi trattamenti alternativi per diversi scenari, e dimostrare come questi possono essere usati per adattare i dati risultanti dalle diverse interazioni proteina-ligando. Il nostro metodo utilizza lo strumento StepOne qPCR, per la quale software di analisi dei dati su misura è disponibile; mentre questo accelera l&#39;analisi dei dati, i risultati da altri strumenti possono essere elaborati con i metodi precedentemente pubblicati 9, e la stessa analisi a valle possono essere eseguite.

<table><tbody><tr><td>Lo strumento per PCR in tempo reale StepOne</td><td>Life Technologies</td><td>4376357</td><td>DSF può essere eseguito con molti altri strumenti. Lo strumento StepOne dispone di un software molto comodo per l'analisi dei dati.</td></tr><tr><td>Software per lo spostamento termico delle proteine v1.0</td><td>Life Technologies</td><td>4466037</td><td></td></tr><tr><td>Piastre ottiche veloci a 48 pozzetti MicroAmp&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375816</td><td></td></tr><tr><td>Nastro sigillante ottico&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>4375323</td><td>Bio-rad codice 223-9444 è un fornitore alternativo</td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti con fondo a U</td><td>Fisher</td><td>11521943</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S6650</td><td>Per un fornitore di volume inferiore, utilizzare Sigma codice S5692</td></tr><tr><td>Statistiche SPSS versione 20</td><td>IBM</td><td></td><td>Altri pacchetti statistici forniranno funzionalità simili</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.02</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Altri pacchetti statistici forniranno funzionalità simili</td></tr><tr><td>Applicatore manuale (PA1)</td><td>3M</td><td>75-3454-4264-6</td><td></td></tr><tr><td>Esochinasi da Saccharomyces cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Fisher 10141520</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> scientifico

determinazione delle interazioni proteina-ligando utilizzo scansione differenziale fluorimetria

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Una vasta gamma di metodi attualmente disponibili per determinare la costante di dissociazione tra una proteina e interagendo piccole molecole. Tuttavia, la maggior parte di questi richiedono l&#39;accesso alle attrezzature specialistiche, e spesso richiedono un certo grado di esperienza per stabilire efficacemente esperimenti affidabili e analizzare i dati. Fluorimetria a scansione differenziale (DSF) viene sempre più utilizzato come metodo affidabile per lo screening iniziale delle proteine ​​per interagire piccole molecole, sia per identificare i partner fisiologiche o per la scoperta colpo. Questa tecnica ha il vantaggio che richiede solo una macchina PCR adatti per PCR quantitativa, e quindi idonea strumentazione è disponibile nella maggior parte delle istituzioni; un&#39;eccellente gamma di protocolli sono già disponibili; e vi sono forti precedenti nella letteratura per molteplici utilizzi del metodo. Lavoro passato ha proposto diverse modalità di calcolo costanti di dissociazione dai dati DSF, ma questi sono matematicamente esigente. Qui, abbiamo DEMstrare un metodo per stimare le costanti di dissociazione da una moderata quantità di DSF dati sperimentali. Questi dati possono generalmente essere raccolti e analizzati in un solo giorno. Dimostriamo come i diversi modelli possono essere utilizzati per adattare i dati raccolti da semplici eventi vincolanti, e dove sono presenti siti di legame di cooperazione o indipendenti vincolante. Infine, presentiamo un esempio di analisi dei dati nel caso in cui non si applicano modelli standard. Questi metodi sono illustrati con i dati raccolti sulle proteine ​​di controllo disponibili in commercio, e due proteine ​​del nostro programma di ricerca. Nel complesso, il nostro metodo fornisce un modo semplice per i ricercatori di acquisire rapidamente una visione più interazioni proteina-ligando con DSF.

La fluorimetria differenziale a scansione è un metodo ampiamente utilizzato per lo screening di librerie di piccole molecole per interazioni con le proteine. Qui, presentiamo un metodo semplice per estendere queste analisi per fornire una stima della costante di dissociazione tra una piccola molecola e il suo partner proteico.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

L'obiettivo generale di questa procedura è stimare la costante di dissociazione per un'interazione con un ligando proteico. Ciò si ottiene preparando prima miscele della proteina con diverse concentrazioni del ligando insieme a un colorante indicatore. Il secondo passo consiste nel riscaldare questi campioni mentre si registra la fluorescenza dell'indicatore per monitorare il dispiegamento della proteina.Successivamente, le curve di dispiegamento delle proteine vengono convertite in una serie di temperature di fusione. Il passo finale consiste nell'adattare questi dati a un modello appropriato per stimare la costante di dissociazione. In definitiva, la fluorimetria a scansione differenziale viene utilizzata per comprendere meglio l'interazione di una proteina con i suoi ligandi.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'isotermia, la titolazione, la calorimetria e la risonanza del plasma di superficie è che questo metodo può essere completato in poche ore utilizzando solo quantità moderate di campione in uno strumento già disponibile nella maggior parte degli istituti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della chimica delle proteine, come l'affinità dei ligandi per le proteine e la forza relativa delle interazioni. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avrebbero difficoltà perché la scelta dei campioni da utilizzare e l'analisi dei dati possono essere entrambe difficili.Prima di iniziare questa procedura, preparare le seguenti soluzioni. Una miscela contenente i reagenti descritti in questa tabella e le scorte del ligando di interesse alla massima concentrazione disponibile, nonché sei diluizioni decuplicate di questa concentrazione. Se una costante di dissociazione approssimata è nota da dati precedenti, preparare almeno due concentrazioni sopra e sotto il kd.Di seguito è riportata una tabella di esempio. Aliquotare 18 microlitri della miscela in ciascuno degli otto pozzetti. Nella piastra A-Q-P-C-R, aggiungere due microlitri di solvente al primo pozzetto in ciascuno dei sette pozzetti rimanenti, aggiungere due microlitri di ciascun membro della serie di diluizione del ligando.Posizionare la guarnizione A-Q-P-C-R sulla piastra per ottenere una buona tenuta della piastra. Posizionare un applicatore a mano al centro della piastra, lisciare il sigillo su un lato e quindi ripetere sull'altra metà della piastra. Centrifugare la piastra a 500 volte G per due minuti per eliminare le bolle d'aria.Quindi, posizionare la piastra in uno strumento QPCR di passaggio uno. Seleziona l'opzione della curva di fusione, i filtri delle rocce e scegli la velocità di rampa veloce. Eseguire una denaturazione termica al termine della corsa dello strumento.Fare clic sul pulsante Analizza sullo schermo. Salvare il file dei risultati. Aprire il software di spostamento termico delle proteine.Creare un nuovo studio nella scheda delle proprietà. Assegnargli un nome e, nella scheda delle condizioni, dettagliare i ligandi. Passare alla scheda dei file dell'esperimento e importare il file dei risultati salvato.Imposta il contenuto di ciascuno. Bene, passa alla scheda di analisi e premi il pulsante di analisi per analizzare i risultati. Verificare che la proteina in presenza del solvente da sola dia un risultato simile a quello mostrato in questa figura.Successivamente, esaminare le temperature di fusione osservate nei risultati del dolore replicato. Assicurarsi che questo mostri un chiaro aumento della temperatura di fusione con l'aumentare della concentrazione del ligando. Questi dati saranno utilizzati per fornire un valore approssimativo per la costante di dissociazione come descritto nell'articolo di accompagnamento.Queste soluzioni sono necessarie per la procedura per determinare la costante di dissociazione, una miscela master come descritto in questa tabella e scorte del ligando a 15 diverse concentrazioni, che saranno diluite dieci volte. Nell'esperimento finale. Idealmente includere le concentrazioni di ligando, almeno due ordini di grandezza sopra e sotto la kd stimata, e centrare le concentrazioni sulla kd stimata.Di seguito è riportato un esempio di serie di diluizione. Concentrati su sette dei punti all'interno di un ordine di grandezza del KD stimato con altri quattro punti su entrambi i lati di questo. Se c'è una scelta, includi più punti a valori che sono saturi.Aggiungere 120 microlitri della miscela master a ciascuno degli otto pozzetti in una piastra a 96 pozzetti con fondo a U che funge da serbatoio per una comoda erogazione della miscela master. Quindi utilizzare una pipetta a otto canali per erogare 18 microlitri della miscela master in una colonna di una piastra PCR. Ripetere per altre cinque colonne per ottenere un totale di 48 pozzetti riempiti in uno schema sei per otto sulla piastra.Quindi, aggiungere 20 microlitri di gambi del ligando o del solvente a ciascuno degli otto pozzetti. In un'altra piastra a 96 pozzetti con fondo a U Utilizzando una pipetta a otto canali, aspirare due microlitri di otto diverse stock di ligandi o solventi e aggiungerli a una colonna della piastra PCR che è stata riempita con la miscela master. Ripetere con gli stessi otto leganti o solventi.Per altre due colonne, aspirare due microlitri delle restanti otto stock di leganti o solventi e aggiungerli a una quarta colonna della piastra. Ripeti l'operazione per altre due colonne. Questo darà campioni triplicati per tutti i 16 campioni di ligando e solvente.Posizionare la guarnizione A-Q-P-C-R sulla piastra. Centrifugare la piastra a 500 volte G per due minuti. Posizionare la piastra nello strumento QPCR ed eseguire una denaturazione termica utilizzando i parametri specificati in precedenza al termine della corsa dello strumento.Fare clic sul pulsante Analizza sullo schermo. Salvare il file dei risultati. Aprire il software di spostamento termico delle proteine.Creare un nuovo studio nella scheda delle proprietà. Assegnargli un nome e nella scheda delle condizioni, dettagliare i ligandi. Passa alla scheda dei file dell'esperimento, importa il file dei risultati salvato e imposta il contenuto di ciascuno.Bene, passa alla scheda di analisi e premi il pulsante Analizza. Scegli la scheda Repliche dal menu sul lato sinistro dello schermo per mostrare i risultati. Come triplicato.Valutare l'affidabilità dei dati in base al livello di strettezza dei triplicati. Se i triplicati mostrano scarsa riproducibilità. Esamina attentamente i dati grezzi.Analizza i dati utilizzando sia il metodo boltman che quello derivato. Per valutare la temperatura di fusione, selezionare la scheda Replica risultati e nel grafico Replica risultati, alternare il pulsante Traccia per tra tm, boltzmann e derivata TM. Selezionare il metodo che offre la maggiore riproducibilità del campione.Per i campioni che mostrano più transizioni, è quasi sempre meglio utilizzare il metodo derivativo in modalità di fusione multipla. Esporta i risultati per ulteriori indagini con Excel utilizzando la scheda di esportazione. Inizia questa analisi creando una tabella in Excel delle concentrazioni del ligando e della temperatura di fusione.Apri il software del prisma GraphPad e crea una tabella XY. Inserire i dati utilizzando la colonna X per le concentrazioni del ligando e la colonna Y per i risultati della temperatura di fusione. Nella scheda Analisi, selezionare l'opzione di adattamento della curva di regressione non lineare.Per inserire il modello corretto, selezionare nuovo e creare una nuova equazione. Inserire l'equazione appropriata come legame del ligando a sito singolo. Selezionare la casella Regole per i valori iniziali e immettere le regole per i valori iniziali.Vincolare il parametro P come costante uguale per inserire la concentrazione finale di proteina. Selezionare Analizza per eseguire l'analisi, un'analisi aggiuntiva per adattare i dati a un modello cooperativo o per adattare i dati alle curve. I cambiamenti binari che mostrano la temperatura di fusione sono descritti nel testo del protocollo di accompagnamento.Questo metodo è stato utilizzato per misurare l'interazione dell'esochinasi con il glucosio. Uno screening iniziale suggerisce una probabile KD da 0,2 a 1,7 millimolari. I risultati di uno schermo più grande mostrano un buon adattamento al modello per un singolo evento di legame con un KD di 1,2 più o meno 0,1 millimolare, la putativa HETO SQUA L transferasi WCBM mostra un forte spostamento termico sul legame con GTP.Uno screening iniziale suggeriva una KD da 200 a 500 micromolari. Un esperimento dettagliato suggerisce una KD apparente di 120 più o meno 20 micromolari. Tuttavia, quando si utilizza una scala logaritmica per l'asse X, c'è una discrepanza significativa tra il modello e l'analisi dei dati degli stessi dati con un modello cooperativo che mostra un eccellente adattamento ai dati, il che implica che WCBM è anticooperativo nel suo legame con GTPA, si osserva un risultato piuttosto insolito con il PIL putativo 60, oxy Beta D mano, Heur due oh, ACE WCBI.Senza ligando, e ad alte concentrazioni di ligando, si osserva un semplice pattern di fusione monofasico. Tuttavia, a concentrazioni intermedie di ligando, si osservano due picchi di fusione distinti. La transizione tra le due serie di picchi dipende dalla dose nell'intera gamma di modelli di concentrazione della fusione bifasica.Come somma di una proporzione del ligando, i risultati del ligando libero e alto danno un buon adattamento ai dati. Questo adattamento è migliorato estrapolando il risultato osservato per un'alta concentrazione di ligando alla piena occupazione. I dati ottenuti per la proporzione di WCBI legata al ligando mostrano un eccellente adattamento a un modello di legame semplice.Con un KD di 58 più o meno due micromolari Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro o cinque ore, comprese le ripetizioni se viene eseguita correttamente Seguendo questa procedura. È possibile eseguire altri metodi, come la fluorescenza venosa e la calorimetria di titolazione isotermica, per rispondere a ulteriori domande come la dipendenza dalla temperatura e la geometria STA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare una stima per la costante di dissociazione di un'interazione utilizzando l'influenza a scansione differenziale.

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

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In questo video, descriviamo la tecnica dell'anisotropia a fluorescenza per studiare le interazioni tra la proteina della sindrome di Shwachman-diamond (SBDS) marcata con fluorofori e la 1 GTPasi simile al fattore di allungamento (EFL1). All'incubazione di proteine SBDS con concentrazioni gradualmente crescenti di EFL1, si osserva un costante aumento dell'anisotropia, indicando una riuscita interazione tra le due proteine.

Rilevamento basato sull'anisotropia della fluorescenza delle interazioni proteina-proteina

Questo video dimostra la calorimetria differenziale a scansione, una tecnica per studiare l'interazione tra una biomolecola e un ligando. Il legame di un aptamero di DNA e di un ligando termolabile viene studiato applicando ripetuti cicli di riscaldamento e raffreddamento al campione e ottenendo scansioni per l'analisi termodinamica.

Calorimetria differenziale a scansione per studiare l'interazione tra aptamero e ligando termolabile del DNA

I protocolli che seguono descrivono saggi cinetici di interazioni proteina-proteina con Bio-strato Interferometria. F-tipo ATP sintasi, che è coinvolto nel metabolismo energetico cellulare, può essere inibita dalla sua subunità ε nei batteri. Abbiamo adattato Bio-strato interferometria per studiare le interazioni del complesso catalitico con il dominio C-terminale inibitorio di ε.

Bio-strato Interferometria per Cinetica di interazioni proteina-proteina e allosterici effetti Ligand di misura

interazioni proteina sono al centro della funzione di una cellula. tecniche calorimetriche e spettroscopiche sono comunemente usati per caratterizzare loro. Qui si descrive anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare l'interazione tra la proteina mutata nella sindrome di Shwachman-Diamond (SBDS) e il fattore di allungamento-simile 1 GTPase (EFL1).

Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

Qui presentiamo un bilingue lipidico supportato nel contesto di una piattaforma microfluidica per studiare le interazioni proteine-fosfoinositide usando un metodo senza etichetta basato sulla modulazione del pH.

PIP-on-a-chip: Uno studio privo di etichette delle interazioni proteine-fosfoinositide

Vi presentiamo un protocollo per la rapida caratterizzazione biomolecolare pieghevole e associazione interazioni con ligandi termolabile mediante calorimetria differenziale a scansione.

Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni

Il Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) può essere utilizzato per identificare piccole proteine leganti il ligando di un organismo utilizzando una libreria ORFeome.

Identificazione delle proteine leganti di piccoli ligandi con l'azione capillare radiale differenziale del ligando Assay (DRaCALA)

Il monitoraggio delle variazioni della temperatura di fusione di una proteinabersaglio (ad es.saggio di spostamento termico, TSA) è un metodo efficiente per lo screening di librerie di frammenti di poche centinaia di composti. Presentiamo un protocollo TSA che implementa la fluorimetria a scansione nano-differenziale assistita da robotica (nano-DSF) per il monitoraggio della fluorescenza intrinseca del triptofano e la retrodepersione della luce per lo screening dei frammenti.

Fluorimetria a scansione nano-differenziale per lo screening nella scoperta di piombo basata su frammenti

Questo protocollo descrive un metodo unico per rilevare il legame tra composti e molecole proteiche, offrendo i vantaggi di una perdita minima di campioni proteici e di un'elevata precisione dei dati.

Rilevamento dell'interazione proteina-umbelliferone CD40 tramite fluorescenza a scansione differenziale

Questo protocollo mette in evidenza i principi e le applicazioni pratiche di fase e contrasto interferenziale differenziale (DIC)...

Contrasto di fase e interferenza differenziale contrasto (DIC) Microscopia

Scopri come stimare la costante di dissociazione delle interazioni proteina-ligando utilizzando la fluorimetria a scansione differenziale. Questo metodo rapido richiede solo quantità moderate di campione.

Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

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