Determinazione delle interazioni proteina-ligando Utilizzo scansione differenziale Fluorimetria

L'obiettivo generale di questa procedura è stimare la costante di dissociazione per un'interazione con un ligando proteico. Ciò si ottiene preparando prima miscele della proteina con diverse concentrazioni del ligando insieme a un colorante indicatore. Il secondo passo consiste nel riscaldare questi campioni mentre si registra la fluorescenza dell'indicatore per monitorare il dispiegamento della proteina.

Successivamente, le curve di dispiegamento delle proteine vengono convertite in una serie di temperature di fusione. Il passo finale consiste nell'adattare questi dati a un modello appropriato per stimare la costante di dissociazione. In definitiva, la fluorimetria a scansione differenziale viene utilizzata per comprendere meglio l'interazione di una proteina con i suoi ligandi.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'isotermia, la titolazione, la calorimetria e la risonanza del plasma di superficie è che questo metodo può essere completato in poche ore utilizzando solo quantità moderate di campione in uno strumento già disponibile nella maggior parte degli istituti. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della chimica delle proteine, come l'affinità dei ligandi per le proteine e la forza relativa delle interazioni. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avrebbero difficoltà perché la scelta dei campioni da utilizzare e l'analisi dei dati possono essere entrambe difficili.

Prima di iniziare questa procedura, preparare le seguenti soluzioni. Una miscela contenente i reagenti descritti in questa tabella e le scorte del ligando di interesse alla massima concentrazione disponibile, nonché sei diluizioni decuplicate di questa concentrazione. Se una costante di dissociazione approssimata è nota da dati precedenti, preparare almeno due concentrazioni sopra e sotto il kd.

Di seguito è riportata una tabella di esempio. Aliquotare 18 microlitri della miscela in ciascuno degli otto pozzetti. Nella piastra A-Q-P-C-R, aggiungere due microlitri di solvente al primo pozzetto in ciascuno dei sette pozzetti rimanenti, aggiungere due microlitri di ciascun membro della serie di diluizione del ligando.

Posizionare la guarnizione A-Q-P-C-R sulla piastra per ottenere una buona tenuta della piastra. Posizionare un applicatore a mano al centro della piastra, lisciare il sigillo su un lato e quindi ripetere sull'altra metà della piastra. Centrifugare la piastra a 500 volte G per due minuti per eliminare le bolle d'aria.

Quindi, posizionare la piastra in uno strumento QPCR di passaggio uno. Seleziona l'opzione della curva di fusione, i filtri delle rocce e scegli la velocità di rampa veloce. Eseguire una denaturazione termica al termine della corsa dello strumento.

Fare clic sul pulsante Analizza sullo schermo. Salvare il file dei risultati. Aprire il software di spostamento termico delle proteine.

Creare un nuovo studio nella scheda delle proprietà. Assegnargli un nome e, nella scheda delle condizioni, dettagliare i ligandi. Passare alla scheda dei file dell'esperimento e importare il file dei risultati salvato.

Imposta il contenuto di ciascuno. Bene, passa alla scheda di analisi e premi il pulsante di analisi per analizzare i risultati. Verificare che la proteina in presenza del solvente da sola dia un risultato simile a quello mostrato in questa figura.

Successivamente, esaminare le temperature di fusione osservate nei risultati del dolore replicato. Assicurarsi che questo mostri un chiaro aumento della temperatura di fusione con l'aumentare della concentrazione del ligando. Questi dati saranno utilizzati per fornire un valore approssimativo per la costante di dissociazione come descritto nell'articolo di accompagnamento.

Queste soluzioni sono necessarie per la procedura per determinare la costante di dissociazione, una miscela master come descritto in questa tabella e scorte del ligando a 15 diverse concentrazioni, che saranno diluite dieci volte. Nell'esperimento finale. Idealmente includere le concentrazioni di ligando, almeno due ordini di grandezza sopra e sotto la kd stimata, e centrare le concentrazioni sulla kd stimata.

Di seguito è riportato un esempio di serie di diluizione. Concentrati su sette dei punti all'interno di un ordine di grandezza del KD stimato con altri quattro punti su entrambi i lati di questo. Se c'è una scelta, includi più punti a valori che sono saturi.

Aggiungere 120 microlitri della miscela master a ciascuno degli otto pozzetti in una piastra a 96 pozzetti con fondo a U che funge da serbatoio per una comoda erogazione della miscela master. Quindi utilizzare una pipetta a otto canali per erogare 18 microlitri della miscela master in una colonna di una piastra PCR. Ripetere per altre cinque colonne per ottenere un totale di 48 pozzetti riempiti in uno schema sei per otto sulla piastra.

Quindi, aggiungere 20 microlitri di gambi del ligando o del solvente a ciascuno degli otto pozzetti. In un'altra piastra a 96 pozzetti con fondo a U Utilizzando una pipetta a otto canali, aspirare due microlitri di otto diverse stock di ligandi o solventi e aggiungerli a una colonna della piastra PCR che è stata riempita con la miscela master. Ripetere con gli stessi otto leganti o solventi.

Per altre due colonne, aspirare due microlitri delle restanti otto stock di leganti o solventi e aggiungerli a una quarta colonna della piastra. Ripeti l'operazione per altre due colonne. Questo darà campioni triplicati per tutti i 16 campioni di ligando e solvente.

Posizionare la guarnizione A-Q-P-C-R sulla piastra. Centrifugare la piastra a 500 volte G per due minuti. Posizionare la piastra nello strumento QPCR ed eseguire una denaturazione termica utilizzando i parametri specificati in precedenza al termine della corsa dello strumento.

Fare clic sul pulsante Analizza sullo schermo. Salvare il file dei risultati. Aprire il software di spostamento termico delle proteine.

Creare un nuovo studio nella scheda delle proprietà. Assegnargli un nome e nella scheda delle condizioni, dettagliare i ligandi. Passa alla scheda dei file dell'esperimento, importa il file dei risultati salvato e imposta il contenuto di ciascuno.

Bene, passa alla scheda di analisi e premi il pulsante Analizza. Scegli la scheda Repliche dal menu sul lato sinistro dello schermo per mostrare i risultati. Come triplicato.

Valutare l'affidabilità dei dati in base al livello di strettezza dei triplicati. Se i triplicati mostrano scarsa riproducibilità. Esamina attentamente i dati grezzi.

Analizza i dati utilizzando sia il metodo boltman che quello derivato. Per valutare la temperatura di fusione, selezionare la scheda Replica risultati e nel grafico Replica risultati, alternare il pulsante Traccia per tra tm, boltzmann e derivata TM. Selezionare il metodo che offre la maggiore riproducibilità del campione.

Per i campioni che mostrano più transizioni, è quasi sempre meglio utilizzare il metodo derivativo in modalità di fusione multipla. Esporta i risultati per ulteriori indagini con Excel utilizzando la scheda di esportazione. Inizia questa analisi creando una tabella in Excel delle concentrazioni del ligando e della temperatura di fusione.

Apri il software del prisma GraphPad e crea una tabella XY. Inserire i dati utilizzando la colonna X per le concentrazioni del ligando e la colonna Y per i risultati della temperatura di fusione. Nella scheda Analisi, selezionare l'opzione di adattamento della curva di regressione non lineare.

Per inserire il modello corretto, selezionare nuovo e creare una nuova equazione. Inserire l'equazione appropriata come legame del ligando a sito singolo. Selezionare la casella Regole per i valori iniziali e immettere le regole per i valori iniziali.

Vincolare il parametro P come costante uguale per inserire la concentrazione finale di proteina. Selezionare Analizza per eseguire l'analisi, un'analisi aggiuntiva per adattare i dati a un modello cooperativo o per adattare i dati alle curve. I cambiamenti binari che mostrano la temperatura di fusione sono descritti nel testo del protocollo di accompagnamento.

Questo metodo è stato utilizzato per misurare l'interazione dell'esochinasi con il glucosio. Uno screening iniziale suggerisce una probabile KD da 0,2 a 1,7 millimolari. I risultati di uno schermo più grande mostrano un buon adattamento al modello per un singolo evento di legame con un KD di 1,2 più o meno 0,1 millimolare, la putativa HETO SQUA L transferasi WCBM mostra un forte spostamento termico sul legame con GTP.

Uno screening iniziale suggeriva una KD da 200 a 500 micromolari. Un esperimento dettagliato suggerisce una KD apparente di 120 più o meno 20 micromolari. Tuttavia, quando si utilizza una scala logaritmica per l'asse X, c'è una discrepanza significativa tra il modello e l'analisi dei dati degli stessi dati con un modello cooperativo che mostra un eccellente adattamento ai dati, il che implica che WCBM è anticooperativo nel suo legame con GTPA, si osserva un risultato piuttosto insolito con il PIL putativo 60, oxy Beta D mano, Heur due oh, ACE WCBI.

Senza ligando, e ad alte concentrazioni di ligando, si osserva un semplice pattern di fusione monofasico. Tuttavia, a concentrazioni intermedie di ligando, si osservano due picchi di fusione distinti. La transizione tra le due serie di picchi dipende dalla dose nell'intera gamma di modelli di concentrazione della fusione bifasica.

Come somma di una proporzione del ligando, i risultati del ligando libero e alto danno un buon adattamento ai dati. Questo adattamento è migliorato estrapolando il risultato osservato per un'alta concentrazione di ligando alla piena occupazione. I dati ottenuti per la proporzione di WCBI legata al ligando mostrano un eccellente adattamento a un modello di legame semplice.

Con un KD di 58 più o meno due micromolari Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro o cinque ore, comprese le ripetizioni se viene eseguita correttamente Seguendo questa procedura. È possibile eseguire altri metodi, come la fluorescenza venosa e la calorimetria di titolazione isotermica, per rispondere a ulteriori domande come la dipendenza dalla temperatura e la geometria STA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare una stima per la costante di dissociazione di un'interazione utilizzando l'influenza a scansione differenziale.