Name: Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-04T23:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Impara la preparazione ex vivo della lampadina olfattiva accessoria del topo con connettività funzionale intatta. Questo metodo elettrofisiologico consente di studiare la codifica sensoriale dei feromoni mantenendo i circuiti neurali collegati.

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Questa ricerca è stata sostenuta da R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) e fondi di avvio UT Southwestern (JPM).

Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo protocolli approvati dal Sud Institutional Animal Care ed uso commissione UT, e sono stati scelti in modo da minimizzare lo stress, il disagio e il dolore provato dagli animali sperimentali. 1. Dissezione Camera Una camera di dissezione costume e piccolo, sottile tavola di plastica sono necessari per ottenere i migliori risultati (Figura 1). Costruire o ottenere tale camera in anticipo di tentare questo protocollo. 2. Dissezione Solutions <ol><li> Preparare 1 L di liquido cerebrospinale artificiale standard (aCSF) per l&#39;uso in Piazza di 3,22-5,4. Aggiungi NaCl 125 mM, KCl 2,5 mm, CaCl 2 2 mM, MgCl2 1 mM, NaHCO 3 a 25 mm, NaH 2 PO 4 da 1,25 mm, mio-inositolo 3 mM, piruvato di sodio 2 mM, ascorbato di sodio 0,4 mM e glucosio 25 mm a 1 L di acqua apirogena. </li><li> Preparare la aCSF dissezione iniziale (200 ml) perutilizzare nei passaggi 3,3-3,22. Prendere 200 ml di aCSF standard ed aumentare la concentrazione MgCl 2 da 9 mM aggiungendo 0,366 g di MgCl 2 esaidrato. </li><li> Preparare soluzione standard di Ringer per portare stimoli alla VNO attraverso la cannula per l&#39;uso in fasi 4,11-5,4 contenente NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl 2, 2 mM, MgCl 2, 2 mM, NaHCO 3 25 mM, HEPES 10 mM, glucosio 10 mm. </li><li> Bubble il 0,8 L di aCSF norma e 0,5 L di Ringer con 95% O 2, 5% CO 2 gas in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per un minimo di 15 min fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Bubble 200 ml di aCSF dissezione iniziale con 95% O 2, 5% CO 2 gas in ghiaccio per 15-20 minuti fino a raggiungere 4 ° C. </li></ol> 3. Dissezione primaria <ol><li> Preparare l&#39;area dissezione. Mettere tre piatti 35 millimetri Petri, ossigenato aCSF, forbici decapitazione, curve dissezione forbici, diritto dissezione forbici, pinze Adson, un cuoio capelluto # 11el lama e manico e una lama di rasoio sul ghiaccio. </li><li> Dopo ossigenato aCSF è stata raffreddata a 4 ° C, profondamente anestetizzare l&#39;animale in una camera di essiccazione con 2-5 ml Isothesia (99,9% isofluorano). Eseguire i test pizzico di coda e piedi per garantire l&#39;animale è profondamente anestetizzato. </li><li> Una volta che l&#39;anestesia profonda è confermata, decapitare l&#39;animale e collocare immediatamente la testa in una capsula di Petri riempita con la dissezione aCSF refrigerata. NOTA: immergere il tessuto nella dissezione refrigerati aCSF per tenerlo fresco durante tutta la procedura quando non in uso. </li><li> Rimuovere l&#39;aspetto inferiore (ventrale faringe, mascella inferiore, e la lingua), con un paio di forbici curve. </li><li> Utilizzando Adson forcipe deglove (buccia), la pelle superficiale e inserzioni muscolari del cranio. Sbucciare il cuoio capelluto da caudale al rostrale fino a quando l&#39;unico sito di attacco è sopra i denti anteriori. Tagliare il tessuto al punto di attacco con un paio di forbici curve. Rimuovere gli occhi afferrandolo con una pinza e tirarlo fuori dalla preparazione. Norecchio termine della procedura degloving, evitare una forza eccessiva sulla cartilagine nasale delicato in base alle pinze Adson agli allegati muscolari liberi dalle ossa mascellari superiori. NOTA: Staccare il cuoio capelluto dalla parte caudale del cranio con le forbici diritte. </li><li> Con le forbici dritte, tagliare lungo la linea mediana del cranio da caudale a rostrale fino a quando le punte delle forbici sono pochi mm nelle ossa frontali (appena prima il seno rhinal). </li><li> Rimuovere il parietale e ossa frontali del cranio con pinze Adson. NOTA: Pezzi di osso frontale spesso rimangono attaccati alle ossa nasali caudali al seno rhinal. Rimuovere questi pezzi con cura adottate non a contattare i bulbi olfattivi. </li><li> Utilizzare il bisturi per fare un taglio coronale attraverso il lobo frontale 2 millimetri caudale ai seni e poi togliere la caudale cervello al taglio. Assicurarsi che la punta dei contatti bisturi del contorno osseo del cranio ventrale di recidere completamente il tessuto posteriore. NOTA: Questo consenterimozione della maggior parte del cervello senza mettere sollecitazioni meccaniche sui tratti olfattivi laterali o bulbi olfattivi. </li><li> Rimuovere gli aspetti caudali esposte del cranio ventrale con le forbici diritte. Lasciare i seni e le restanti tessuto nervoso. </li><li> Rimuovere zigomatica e muscoli facciali sul lato anatomico destro del cranio con le forbici diritte </li><li> Girare il muso sopra (lato ventrale) per esporre il tetto della bocca. </li><li> Tagliare e rimuovere il palato immediatamente caudale agli incisivi. Fare inserendo la punta della lama bisturi sotto il palato parallelo al tetto della bocca e quindi spostare la lama verso gli incisivi. </li><li> Afferrare l&#39;(rostrale) bordo liberato del palato con una pinza Adson e rimuovere tirando caudale. </li><li> Sul lato sinistro anatomica del cranio, utilizzare il bisturi per estendere il forame palatino caudalmente, partendo dalle piccole forame vicino molari. Conseguire questo inserendo la punta del bisturi blade nel vuoto in prossimità dei molari e rotazione del polso. NOTA: Utilizzare estrema cautela per usare solo la punta della lama - un taglio profondo può danneggiare il tessuto del setto. </li><li> Utilizzando la punta della lama del bisturi, tagliare dal forame palatino attraverso gli incisivi, a partire rostrale alla anatomica sinistra, organo vomeronasale. Utilizzare più tagli di punteggio. Non danneggiare il tessuto del setto e nervi vomeronasali inserendo la lama troppo profondo. </li><li> Ruotare il tessuto in modo che il cranio dorsale è rivolto verso l&#39;alto e poi orientare la lama di rasoio verticale (parallelo alla linea mediana) all&#39;estremità caudale della preparazione. </li><li> Sul bordo ventrale del tessuto, toccare il tagliente della lama di rasoio immediatamente alla sinistra della linea mediana. Agitare delicatamente la lama e muoversi lungo il forame palatino sinistra (tagliate regione introdotto nel passaggio 3.14). </li><li> Al bordo dorsale del tessuto, posizionare il tagliente del rasoio immediatamente alla sinistra della linea mediana (meno di 1 mm). </li><li> Conservazionela lama parallelamente alla linea mediana, Rock il lama lentamente con pressione verso la parte anteriore del tessuto. Notare resistenza a lamina cribrosa. Interrompere immediatamente dopo la rottura attraverso questa resistenza. NOTA: A questo punto, l&#39;emisfero destro è allentato dalla emisfero sinistro. Il collegamento Rimane solo tra gli emisferi lungo la dorsale muso anteriore alla piastra cribrosa. </li><li> Separare gli emisferi da loro afferrando vicino ai lati caudale con le dita guantate e delicatamente ruotare lateralmente e anteriormente. NOTA: Questo passaggio è una fonte di variabilità sperimentale, soprattutto in topi con musi deviate o fragili (ad esempio, topi anziani). Inoltre, durante il tentativo di ruotare gli emisferi distanti, se forte resistenza si incontra segnare il muso dorsale (anteriore alla piastra cribrosa) per indebolire i tessuti connettivi. Nel farlo, fare estrema attenzione a non inserire il bisturi in profondità, che possono danneggiare il setto tissue e nervi vomeronasale. </li><li> Applicare una piccola quantità (50-100 ml) di colla tessuto per la tavola e inserire delicatamente il bordo laterale dell&#39;emisfero destro sulla colla utilizzando le pinze Adson. Rimuovere l&#39;umidità in eccesso dal lato laterale della preparazione con un tovagliolo di carta per evitare premature polimerizzazione della colla e l&#39;adesione allentato per la tavola. NOTA: Applicare alcune gocce di aCSF dissezione refrigerata sul campione di accelerare la polimerizzazione colla dopo tessuto viene posizionato sulla colla. Questo assicura che il tessuto rimane saldamente in attesa alla plancia. </li><li> Mettere una piccola quantità (diametro 3-5 mm, 2 mm di profondità) di grasso per vuoto nel centro della camera di dissezione secondaria e posizionare il lato della doga di fronte al tessuto saldamente contro il grasso. Riempire subito la camera di dissezione con refrigerati dissezione aCSF, il trasferimento alla zona dissezione fine e cominciare perfusione con lo standard ossigenato aCSF. Orientare la tavola in modo che il bulbo olfattivo è direttamente nelflusso di appena ossigenato aCSF standard. </li></ol> 4. Dissezione secondario <ol><li> Rimuovere eventuali controlaterale (a sinistra) bulbo olfattivo visibile o tessuto corticale dalla preparazione utilizzando una pinza sottile. Pizzicare insieme le belle pinze (formando un semi smussato), e poi metterlo alla dorsale e caudale porzione del tessuto vicino alla linea mediana. Eseguire delicatamente la pinza pizzicato lungo la linea mediana, peeling il tessuto lontano dal emisfero destro lentamente in moto anteriore. Rimuovere tutto il tessuto controlaterale, compreso il tessuto bulbo olfattivo controlaterale. Fate molta attenzione a non colpire attraverso il tessuto, che può causare danni al AOB o vomeronasale nervo. </li><li> Osservare la dura madre bianca lungo la superficie dorsale / mediale del bulbo olfattivo. Strappare questa dura madre lungo il bordo dorsale / caudale del bulbo olfattivo afferrandolo in corrispondenza della porzione più bianco della dura con due coppie di pinza sottile e tirare via da quel punto. La durata è strettamenteavvolto intorno bulbi olfattivi, e si può facilmente tagliare attraverso il tessuto mentre viene rimosso. Evitare danni alla superficie mediale del bulbo olfattivo e la AOB stessa. NOTA: Se la dura resiste strappare facilmente, a questo punto, introdurre un piccolo taglio con punta fine primavera forbici dissezione per facilitare la separazione. </li><li> Lentamente e con attenzione staccarsi la corteccia frontale con una pinza sottile senza danneggiare i bulbi olfattivi sottostanti. Osservare una collezione di vasi sanguigni appaiono come una rete semi-trasparente immediatamente caudale al AOB. Rimuovi questa rete con una pinza sottile per facilitare la penetrazione elettrodo in esperimenti di elettrofisiologia. Afferrare la rete con una pinza come si separa dalla AOB durante la corteccia retrazione frontale e rimuoverlo tirando caudalmente e medialmente, facendo attenzione a non toccare la AOB. Una volta che la corteccia frontale è stato separato dai bulbi olfattivi, rimuoverla tagliando con una pinza ventrali e posteriori alla AOB. NOTA: Prendere extreme attenzione con la rimozione rete, perché se è fatto troppo grosso modo il livello glomerulare può danneggiarsi. </li><li> Nella cavità nasale controlaterale esposto, rimuovere ogni residuo di tessuto del setto controlaterale (foglio di velina gialla contenente i vasi sanguigni) utilizzando le belle pinze. Afferrare il tessuto in corrispondenza della regione caudale / dorsale (vicino all&#39;osso del setto) e poi tirare / sollevare il tessuto verso il lato anteriore. NOTA: Il tessuto del setto controlaterale può essere inavvertitamente rimosso durante la fase di emisezione (Step 3.20). In tal caso, osservare un bianco, avascolare cartilagine settale e la leggermente trasparente, vascolarizzato setto osseo. Se questo è il caso, Passaggio 4.4 può essere saltata. </li><li> Rimuovere con attenzione il controlaterale VNO eseguendo un unico punto delle belle pinze tra la cartilagine del setto e la &quot;ala&quot; VNO (un sottile pezzo di tessuto osseo che corre lungo il bordo dorsale di entrambi vnos. <ol><li> Dopo il distacco dell&#39;ala dalla cartilagine, spostare la punta della pinza ventrenel VNO controlaterale nei pressi della linea mediana. Ripetere questo passaggio in diverse località lungo l&#39;asse rostrale / caudale del controlaterale VNO per allentarla, le consente di essere rimosso da afferrare con una pinza e di sollevamento di distanza. </li></ol></li><li> Preparare per rimuovere la cartilagine del setto effettuando un taglio sul bordo ventrale / caudale (dove si restringe a un bianco avascolare striscia che corre lungo il bordo ventrale dell&#39;osso del setto) con una pinza sottile. </li><li> Togliere la cartilagine del setto pizzicando insieme i pinza sottile per fare un semi punto smussato. Identificare il taglio fatto nella Fase 4.6, inserire le pinze pizzicato dietro (laterale) a quel taglio, e poi sollevare lentamente la cartilagine lontano dal tessuto settale e procedendo rostralmente. NOTA: Non distruggere il tessuto del setto sottostante. Poiché la cartilagine viene sollevato, osservare il foglio sottostante tratto di tessuto del setto causa di aderenze sciolti alla cartilagine. Un movimento periodico, dolce e stabile delle pinza sottile pizzicato lungo questo sito di perdere undhesion può facilitare notevolmente efficace separazione delle due strutture. </li><li> Usare un paio di # 3 pinze con una punta piegata per rimuovere l&#39;osso del setto. Avvicinarsi l&#39;osso del setto con un angolo quasi parallela al piano dell&#39;osso settale. Inserire il dente curvo tra il tessuto del setto e setto osseo. Afferrare l&#39;osso con la pinza e delicatamente spostare l&#39;osso e indietro fino a quando si incrina vicino alla lamina cribrosa. NOTA: In alcuni casi, l&#39;osso settale resisterà rottura in prossimità della piastra cribrosa. In questo caso, utilizzare una pinza sottile a segnare delicatamente l&#39;osso del setto lungo l&#39;asse / ventrale dorsale appena anteriormente alla piastra cribrosa, quindi ripetere il punto 4.8. </li><li> Togliere la cartilagine bianca appena rostrale alla VNO pizzicando con un paio di pinze sottili all&#39;ingresso e tirando rostralmente con un altro paio di pinze sottili. </li><li> Fissare la cannula poliimmide ad un dispositivo perfusione veloce e avviare il flusso di soluzione di Ringer (0,1-0,3 ml / min) attraverso la cannula poliimmide.NOTA: la portata di misura con una, flussometro in linea piccolo volume. L&#39;uso del dispositivo di commutazione stimolo pneumatico controllato da computer riduce variazioni di portata durante la stimolazione. Confronta risposte neurali per testare stimoli con le risposte ad uno stimolo finto (controllare la soluzione di Ringer) per garantire risposte sono specifici stimoli. </li><li> Orientare la cannula parallelo all&#39;ingresso VNO. Quando la cannula è soddisfacente parallelo all&#39;ingresso VNO, osservare come la pressione di uscita fa sì che il VNO a &quot;gonfiare&quot;, che consenta l&#39;evacuazione del vaso sanguigno. Inserire immediatamente la cannula nel VNO, mantenendo l&#39;angolo della costante cannula in modo che rimanga parallelo all&#39;apertura VNO. NOTA: Può essere utile per tenere la cannula con un paio di pinze fini contro la plancia plastica e utilizzare un altro paio di pinze sottili angolare l&#39;estremità della cannula leggermente verso l&#39;alto. Se si mette inavvertitamente la cannula dietro la VNO, il deflusso può anche causare il vaso sanguigno VNOevacuare, determinando l&#39;impressione di una corretta incannulamento stata eseguita. Posizione corretta può essere confermata incorporando un colorante in soluzione di Ringer l&#39;. Quando la cannula viene posizionato correttamente, il colorante deve unica uscita tramite l&#39;ingresso VNO. Inoltre, si può confermare il corretto posizionamento facendo in modo che la cannula è facilmente visibile attraverso l&#39;aspetto mediale semi-trasparente del VNO. </li><li> Spostare la plancia in plastica lentamente fino a quando la AOB è nel flusso diretto della norma aCSF, facendo attenzione a non spostare la cannula dal VNO. La dissezione è completo e la valutazione della funzione fisiologica può iniziare immediatamente. Fase 5 descrive brevemente un approccio per fare una tale valutazione. </li></ol> 5. Valutazione <ol><li> Penetrare la superficie della AOB con un 2-4 mW microelettrodo vetro borosilicato collegato ad un amplificatore extracellulare e oscilloscopio. </li><li> Far avanzare lentamente l&#39;microelettrodo ad una profondità di 100-200 micron dallasuperficie ad una velocità di 50 um / min. Nota: A questa profondità il tessuto, uno incontrerà occasionali azione spontanea potenziali forme d&#39;onda esemplificate dalla taglienti, brevi (~ 1-2 msec) deviazioni della tensione microelettrodo. </li><li> Su incontrare un potenziale forma d&#39;onda d&#39;azione, interrompere avanzare il microelettrodo. </li><li> Osservare e / o registrare il tasso potenziale di azione mentre si cambia la modalità di consegna da stimolo Controllo suoneria di un attivatore noto di attività VSN (ad esempio, la soluzione di Ringer contenente 50 mM KCl). Se la dissezione era successo, un cambiamento di stimolo-dipendente in azione tasso potenziale o potenziale ambito locale può essere osservato. NOTA: Non tutti i neuroni AOB risponderanno ad ogni stimolo con un aumento della frequenza di scarica (tra cui la soluzione di Ringer contenente 50 mM KCl). Una diminuzione stimolo-dipendente della frequenza di scarica indica anche connettività funzionale e una dissezione di successo. Nel caso in cui due o più neuroni che si incontranonon rispondono alla stimolazione VNO, o se non potenziali d&#39;azione si osservano dopo più penetrazioni degli elettrodi, questo suggerisce una dissezione senza successo. Se questo è il caso, un nuovo dissezione può essere avviata nella Fase 3. </li></ol>

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Gli autori non hanno significativi conflitti di interesse da dichiarare.

L&#39;ex vivo di preparazione VNO-AOB descritto in questo protocollo è una valida alternativa alla anestetizzato in vivo 5-7 e acuta fetta vivo 17 esperimenti di funzione AOB. A differenza acuti esperimenti fetta AOB, che espongono anche elementi circuitali per le registrazioni elettrofisiologiche e ottici, questa preparazione conserva tutte le afferenze sensoriali e collegamenti intra-AOB. Anche se questo può anche essere detto di anestetizzato negli approcci vivo, la pr...

Elaborazione sensoriale nel cervello dei mammiferi si estende in genere più circuiti neuronali reciprocamente collegate, ciascuna delle quali estrae particolari caratteristiche da input sensoriali. In percorsi sensoriali, elaborazione delle informazioni precoce è di vitale importanza per la percezione e il comportamento normale. Nel sistema olfattivo accessorio (AOS), il bulbo olfattivo accessorio (AOB) è il principale circuito neurale che collega la periferia sensoriale alle strutture a valle che determinano l&#39;equilibrio ormonale 1,2, aggressività 3, e l&#39;eccitazione 4. Come tale, l&#39;elaborazione delle informazioni all&#39;interno di questo circuito è fortemente legata ai cambiamenti nel comportamento animale. Il bulbo olfattivo accessorio è situato in topi e ratti nella parte dorsale / caudale / posteriore del bulbo olfattivo principale (MOB) sotto la fitta, vascolarizzato seno rhinal. L&#39;AOB riceve afferente innervazione da assoni dei neuroni sensoriali vomeronasali periferico (VSNs) che risiedono nell&#39;organo vomeronasale (VNO), un small tubo cieco-ended nel muso anteriore, appena sopra il palato molle. Questi assoni attraversano il delicato strato di tessuto settale al confine mediale dei passaggi nasali. Diversi studi hanno sondato AOB risposte neurali alle fonti di odori AOS (come l&#39;urina del mouse) in vivo utilizzando topi anestetizzati 5-7 o animali liberamente esplorare 8. L&#39;eroico anestetizzati studi in vivo coinvolti (a) tracheotomia per garantire l&#39;anestesia profonda e prevenire l&#39;aspirazione di stimoli liquido 5-7, (b) stimolazione del ganglio cervicale simpatico 6 o incannulamento diretta dell&#39;organo vomeronasale 5,7 per introdurre gli odori volatili e (c) craniotomie con o senza ablazione del lobo frontale per consentire elettrodo avanzamento nella AOB 6. Awake / comportarsi studi 8-10 coinvolti impianto chirurgico di un microdrive. In sintesi, questi paradigmi sperimentali sono potenti, ma estremamente difficile e spesso richiedono l&#39;anestesia. (ex vivo) con un certo successo 11-15. Poiché i collegamenti tra il VNO e AOB rimangono omolaterale, e perché il tessuto linea mediana del setto può essere esposto a superfusate ossigenato in un singolo emisfero, abbiamo cercato di sviluppare un ex vivo approccio unico emisfero isolare queste strutture pur mantenendo la loro connettività funzionale. Recentemente siamo riusciti a raggiungere questo obiettivo 16. Questa preparazione mantiene sia il VNO e AOB vivo e funzionalmente collegato per almeno 4-6 ore perché entrambi gli assoni (lungo la linea mediana del setto tessuti molli) e AOB sono relativamente poco profonde &lt;600 micron caratteristiche che sono accessibili a superfuse ossigenato liquido cerebrospinale artificiale ( aCSF). Questo ex vivo preparazione VNO-AOB permette l&#39;introduzione di stimoli controllati nel VNO tramite una cannula sottile, eaccesso visivo diretto al piccolo AOB per il posizionamento degli elettrodi e / o alla microscopia a fluorescenza diretta. Questo metodo è vantaggioso se la si vuole studiare questi circuiti in assenza di anestetici. Poiché questo approccio recide le connessioni centrifughe, non è adatto a inchieste modulazione centrifuga della funzione AOB. L&#39;ex vivo di preparazione VNO-AOB è difficile da imparare, ma una volta raggiunto produce una piattaforma affidabile su cui indagare l&#39;organizzazione del circuito, elaborazione delle informazioni, e la plasticità neurale in questo circuito sensoriale potente.

<table><tbody><tr><td>Forbici dritte Strumenti per</td><td>le scienze</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per</td><td></td> le scienze <td>14060-10 Forbici per le scienze 14060-10</td><td></td></tr> Strumenti <tr><td>per</td> le <td>scienze 14061-10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinze Adson</td><td>Strumenti per le scienze 11006-12</td><td></td><td></td></tr> <tr><td># 3 Manico per bisturi</td><td>Strumenti per le scienze 10003-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#11 Lame per bisturi</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>Lame per rasoio dritte in acciaio al carbonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-21</td><td></td></tr><tr><td>Camera di dissezione</td><td>personalizzata&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Vedi Figura 1</td></tr><tr><td>Tavola di plastica Delrin 0,6 cm x 1,5 cm x 0,1 cm</td><td>Custom&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Silicone Grasso sottovuoto</td><td>Fisher Scientific</td><td>146355D</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinze, Studente</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinze, Biologie Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinze, Studente</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Forbici</td><td>Fine Science Strumenti</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>1/16" Maschio Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-00</td><td></td></tr><tr><td>1/16" Tubo</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td></td></tr><tr><td>Due tonnellate epossidica</td><td>Grainger</td><td>5E157</td><td></td></tr><tr><td>ValveBank Kit di perfusione pressurizzata</td><td>AutoMate Scientific</td><td>09-16</td><td></td></tr><tr><td>ValveLink controller digitale/manuale</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>myo-inositolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>Na-piruvato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>Na-ascorbato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>vari</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>vari</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo preparati della lampadina vomeronasale organo e accessori olfattivo intatto

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Il sistema olfattivo accessorio mouse (AOS) è un percorso sensoriale specializzato per rilevare gli odori volatili sociali, feromoni, e cairomoni. Il primo circuito neurale nel pathway AOS, chiamato il bulbo olfattivo accessorio (AOB), svolge un ruolo importante nello stabilire comportamenti sesso tipico come l&#39;aggressività territoriale e accoppiamento. Questo piccolo circuito (&lt;1 mm 3) possiede la capacità di distinguere gli stati comportamentali unici, come il sesso, tensione, e lo stress da spunti chemiosensoriali nelle secrezioni ed escrezioni di conspecifici. Mentre l&#39;organizzazione compatta di questo sistema offre opportunità uniche per la registrazione da grandi porzioni del circuito contemporaneamente, ricerca di elaborazione sensoriale nel AOB rimane impegnativo, in gran parte dovuto alla sua posizione svantaggiosa sperimentalmente nel cervello. Qui, dimostriamo una dissezione più stadi che rimuove il AOB intatto all&#39;interno di un singolo emisfero del mouse cranio anteriore, lasciando collegareioni ad entrambi i vomeronasali periferica neuroni sensoriali (VSNs) e circuiti neuronali locali intatti. La procedura espone la superficie AOB dirigere ispezione visiva, facilitando elettrofisiologica e registrazioni ottiche da elementi circuitali AOB in assenza di anestetici. Dopo l&#39;inserimento di una cannula sottile nell&#39;organo vomeronasale (VNO), che ospita le VSNs, si può esporre direttamente la periferia agli odori sociali e feromoni durante la registrazione di attività a valle nella AOB. Questa procedura consente indagini controllate in AOS elaborazione delle informazioni, che possono far luce sui meccanismi che legano l&#39;esposizione feromone a cambiamenti nel comportamento.

Raggiungere il successo con questa preparazione richiede pratica estesa, e ha diverse fasi in cui si può fallire. Ci si dovrebbe aspettare da richiedere molti tentativi prima di raggiungere il successo. È richiesta la camera di dissezione personalizzata per il completamento di questo protocollo, e deve essere ottenuto prima di avviare le fasi successive della dissezione. Il disegno della camera illustrato nella figura 1 è sufficiente per questo scopo, e può essere realizzato in materia plastica relativa...

L&#39;accessorio bulbo olfattivo mouse (AOB) è stato difficile studiare nel contesto della codifica sensoriale. Qui, dimostriamo una dissezione che produce un vivo preparazione franco in cui i neuroni AOB rimangono funzionalmente collegati agli ingressi periferici, facilitando la ricerca di elaborazione delle informazioni dei feromoni mouse e cairomoni.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di produrre una preparazione ex vivo dell'organo ronasale del topo funzionalmente connesso, o VNO, di un bulbo olfattivo accessorio o di un OB. Ciò si ottiene eseguendo prima una dissezione grossolana del cranio del topo per isolare un singolo emisfero del muso e del bulbo olfattivo. Nella seconda fase, i delicati assoni VNO e un OB vengono esposti attraverso una dissezione secondaria in una camera di perfusione tissutale. Infine, una sottile cannula viene inserita nel VNO attraverso la quale è possibile introdurre l'odore e lo stimolo.In definitiva, le registrazioni elettrofisiologiche possono essere utilizzate per misurare l'attività neurale all'interno dell'OB A durante la stimolazione VNO. Il vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti come l'elettrofisiologia a fette in vitro, è che con questa tecnica, l'organo sensoriale e i circuiti neurali a valle rimangono funzionalmente collegati. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché ci sono molte fasi di dissezione delicate che sono difficili da imparare e perché gli errori su uno qualsiasi di questi passaggi possono causare una dissezione fallita. Per iniziare la dissezione primaria, utilizzare prima la pinza Addin per rimuovere le ossa parietali e frontali del cranio del topo, facendo attenzione a non entrare in contatto con i bulbi olfattivi.Quindi, usa un bisturi per fare un taglio coronale attraverso il lobo frontale, due millimetri di coccola ai seni paranasali, e poi rimuovi la coccola cerebrale al taglio. Usa le forbici dritte per rimuovere gli aspetti esposti del cranio ventrale, lasciando i seni paranasali e il tessuto nervoso rimanente. Rimuovere l'arco zigomatico e i muscoli facciali sul lato destro anatomico del cranio, quindi girare il muso verso l'alto.Per esporre il palato, inserire immediatamente la punta della lama del bisturi sotto la paletta parallela al palato, quindi spostare la lama verso gli incisivi. Afferrare il bordo rostrale liberato della tavolozza con la pinza e rimuovere il palato tirando con delicatezza. Quindi, sul lato sinistro anatomico del cranio, inserire solo la punta della lama del bisturi nel vuoto vicino ai molari e ruotare il polso per estendere il forame palatino in modo coccoloso.Partendo dal piccolo forame vicino ai molari, utilizzare la punta della lama del bisturi per continuare a tagliare dal forame palatino attraverso gli incisivi, iniziando rostralmente al VNO anatomico sinistro con tagli multipli. Quindi girare il tessuto in modo che il cranio dorsale sia rivolto verso l'alto e orientare una lama di rasoio a destra verticalmente e parallelamente alla linea mediana sul bordo della coccola del preparato al bordo ventrale del tessuto, toccare il bordo tagliente della lama di rasoio immediatamente a sinistra della linea mediana e far oscillare delicatamente la lama muovendosi lungo il palatino sinistro per Raymond, mantenendo la pala parallela alla roccia della linea mediana. La lama del rasoio lentamente con pressione verso la parte anteriore del tessuto, fermandosi immediatamente dopo aver sfondato la resistenza alla placca cribriforme.Afferrare gli emisferi esposti vicino ai lati della coccola con le dita guantate e ruotarli delicatamente lateralmente e anteriormente per separare i tessuti. Ora applica da 50 a 100 microlitri di colla per fazzoletti su una sottile tavola di plastica. Afferrare il fazzoletto con una pinza e tamponare il preparato con un tovagliolo di carta per rimuovere l'umidità in eccesso dal lato laterale.Usa le pinze per posizionare delicatamente il bordo laterale dell'emisfero destro sulla colla. Quindi posizionare una goccia di grasso sottovuoto da tre a cinque millimetri di diametro e due millimetri di profondità nel mezzo di una camera di dissezione secondaria e posizionare saldamente il lato della tavola opposto al tessuto contro il grasso. Riempire immediatamente la camera di dissezione con dissezione refrigerata, liquido cerebrospinale artificiale o A CSF e trasferire la camera nell'area di dissezione fine.Quindi iniziare la profusione della camera con lo standard A ossigenato CSF orientando la tavola in modo che il bulbo olfattivo sia direttamente nel flusso del fluido appena ossigenato per eseguire. La dissezione secondaria Iniziare utilizzando una pinza fine per rimuovere qualsiasi bulbo olfattivo controlaterale visibile o tessuto corticale. Dalla preparazione, individuare la dura madre bianca lungo la superficie mediale dorsale del bulbo olfattivo, quindi utilizzando due paia di pinze sottili, strappare la dura madre afferrandola nella parte più bianca e separando la pinza.Quindi, lentamente e con attenzione, staccare la corteccia frontale con una pinza sottile senza danneggiare i bulbi olfattivi sottostanti. Una volta separata la corteccia frontale, tagliare e asportare il tessuto ventrale e posteriore all'OB A facendo attenzione a non danneggiare lo strato glomerulare. Quindi eseguire un singolo punto della pinza sottile tra la cartilagine del setto nasale e l'ala del VNO, un sottile pezzo di tessuto osseo che corre lungo il bordo dorsale di entrambi i VN Os.To rimuovere con cura il VNO controlaterale dopo aver rimosso completamente il VNO utilizzare una pinza sottile per fare un taglio sul bordo ventrale della cartilagine del setto, dove si restringe a un avascolare bianco che corre lungo il bordo ventrale dell'osso del setto.Pizzicare insieme le pinze sottili per creare una punta semi smussata e inserire le pinze di pizzicamento lateralmente al taglio. Quindi sollevare lentamente la cartilagine dal tessuto settale procedendo roly e senza disturbare il tessuto settale sottostante. Afferrare l'osso con una pinza e muoverlo delicatamente avanti e indietro finché non si rompe vicino alla piastra di riforma della culla.Ora, collegare una cannula in poliammide a un dispositivo di perfusione rapida e avviare un flusso di soluzione di suoneria a una velocità compresa tra 0,1 e 0,3 millilitri al minuto attraverso la cannula in poliammide. Misurare la portata con un misuratore di portata volumetrico in linea. Infine, orientare la cannula parallelamente all'ingresso VNO.Quando la cannula è in posizione, osservare come la pressione di uscita provoca il gonfiaggio del VNO portando all'evacuazione del vaso sanguigno. Quindi inserire immediatamente la cannula nel VNO, mantenendo costante l'angolo della cannula in modo che rimanga parallela all'apertura del VNO e iniziare la valutazione della funzione fisiologica. Una grande fonte di variabilità tra i preparati è la densità e la fragilità delle ossa del cranio e del muso degli animali da esperimento.Non è raro che i tessuti del setto rimangano attaccati all'emisfero controlaterale, soprattutto vicino ai punti di attacco alle ossa dorsali del muso. Altri errori di dissezione comuni si verificano durante la dissezione fine secondaria, durante la quale gli assoni del nervo nasale RO possono essere danneggiati nel tessuto settale vicino al VNO o vicino all'OB. Questi e altri eventi simili risulteranno in una connettività incompleta tra i neuroni sensoriali nasali RO e il rendering A OB. I preparati sono inutilizzabili al completamento con successo della procedura.La connettività funzionale può essere verificata utilizzando un saggio fisiologico come registrazioni elettrofisiologiche di singole unità dell'attività neurale in risposta alla stimolazione VNO con odoranti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere la calma e fare brevi pause. Se ti affatica, piccoli errori nell'esecuzione di questa tecnica possono danneggiare queste delicate strutture neurali.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire dissezioni ex vivo del sistema di fabbrica dei primi accessori per studi elettrofisiologici o di imaging.

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Research

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JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Multielectrode array (MEA), le registrazioni forniscono un metodo per studiare l'attività elettrica di ampie popolazioni di neuroni. Qui, vi presentiamo i dettagli di una preparazione MEA per registrare dal epitelio del mouse vomeronasale mentre simultaneamente stimola il tessuto.

Array registrazioni Multielectrode dell&#39;epitelio Vomeronasal

Nei topi, la capacità di rilevare i feromoni è principalmente mediata dall'organo vomeronasale (VNO). Qui, un acuto preparazione fetta di tessuto VNO per eseguire l'imaging calcio è descritto. Questo approccio permette osservazioni fisiologiche di sottopopolazioni e / o di singoli neuroni in un tessuto vivente ed è comodo per l'identificazione del recettore-ligando.

Imaging Pheromone Sensing in preparazione dei tessuti Vomeronasal acuta Slice mouse

L'organo vomeronasale (VNO) rileva i segnali chimici intraspecie che veicolano informazioni sociali e riproduttivi. Abbiamo effettuato Ca2 + esperimenti di imaging con topi transgenici che esprimono G-CaMP2 nel tessuto VNO. Questo approccio ci consente di analizzare i modelli di risposta dei neuroni complicato vomeronasale a un gran numero di stimoli feromone.

Le risposte di imaging neuronale in preparazione Fetta di organo vomeronasale Esprimere un sensore di calcio geneticamente codificato

Questo video descrive l'isolamento di un organo vomeronasale di topo (VNO) e la preparazione del tessuto per il sezionamento del vibratomo. Le sezioni vengono utilizzate per caratterizzare gli attributi biofisici e fisiologici di uno specifico gruppo di neuroni sensoriali.

Preparazione dell'organo vomeronasale di topo per il sezionamento del vibratomo

Questo video mostra la registrazione elettrofisiologica dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) nei topi utilizzando una tecnica di patch-clamp perforata. L'epitelio olfattivo, contenente OSN con recettori degli odori marcati con fluorofori, viene isolato da un topo e fissato in una camera di registrazione. Una pipetta di registrazione è fissata alla manopola dendritica di un OSN e la nistatina all'interno della pipetta perfora la membrana per formare la connettività elettrica con la cellula.

Registrazione perforata con patch-clamp dei neuroni sensoriali olfattivi nei topi

Il video del protocollo descrive la creazione di un patch clamp a cellula intera per la registrazione elettrofisiologica dai neuroni sensoriali dell'organo vomeronasale (VNO) nei topi. Una fetta di VNO coronale con neuroni sensoriali marcati in fluorescenza viene collocata in una configurazione di registrazione. Un neurone marcato viene patchato con una pipetta di registrazione in una configurazione di cellula intera per la registrazione elettrofisiologica in risposta a stimoli chimici.

Definizione di un patch clamp a cellula intera per la registrazione elettrofisiologica dai neuroni sensoriali vomeronasali

Un efficace manuale disosso metodo per preparare intatto il mouse tessuto nasale con organizzazione anatomica Conservato

L'analisi delle proprietà fisiologiche dei neuroni sensoriali olfattivi incontra ancora limitazioni tecniche. Qui li registriamo attraverso un patch-clamp perforato in una preparazione intatta dell'epitelio olfattivo in topi geneticamente mirati. Questa tecnica consente la caratterizzazione delle proprietà di membrana e delle risposte a specifici ligandi di neuroni che esprimono recettori olfattivi definiti.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Qui, descriviamo un approccio fisiologico che consente l'identificazione e l'analisi approfondita di una popolazione definita di neuroni sensoriali in fette di tessuto coronale acuto dell'organo vomeronasale del topo utilizzando registrazioni di patch-clamp a cellula intera.

Approfondita fisiologica Analisi di popolazioni di cellule definite nel acuta del tessuto Fette del mouse Vomeronasal Organo

I neuroni sensoriali olfattivi esprimono un'ampia varietà di molecole di selezione dell'assone per stabilire una corretta circuiteria neurale. Questo protocollo descrive un metodo di colorazione immunohistochemical per visualizzare le espressioni combinatorie delle molecole di selezione dell'assone all'estensione degli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi.

Quadrupla Immunostaining della lampadina olfattiva per la visualizzazione di codici di identificazione molecolare Axon sensoriale olfattiva

Questo articolo fornisce un protocollo semplificato per la dissezione e la dissociazione dell'epitelio olfattivo murino ai fini del sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo.

Dissezione rapida e dissociazione dell'epitelio olfattivo di topo per sospensioni a nucleo singolo

Impara la preparazione ex vivo della lampadina olfattiva accessoria del topo con connettività funzionale intatta. Questo metodo elettrofisiologico consente di studiare la codifica sensoriale dei feromoni mantenendo i circuiti neurali collegati.

Ex Vivo preparati della lampadina vomeronasale Organo e accessori olfattivo intatto

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