La combinazione di ordinamento magnetico di cellule madri e test di fluttuazione per analizzare genoma instabilità mitotica Durante l'invecchiamento cellulare in Saccharomyces cerevisiae

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare se i cambiamenti nelle frequenze di mutazione con l'aumento della replicazione. L'età delle cellule di lievito è dovuta semplicemente a cicli aggiuntivi di divisione cellulare o a cambiamenti specifici dell'età nei tassi di accumulo di mutazioni. Ciò si ottiene misurando prima le frequenze e i tassi di mutazione nelle cellule giovani diffondendo le cellule su terreni selettivi e non selettivi per calcolare una frequenza di mutazione prevista per le cellule di età crescente a causa dell'accumulo di mutazioni ad ogni ciclo di divisione cellulare.

Successivamente, una popolazione di cellule di lievito viene etichettata con biotina coltivata in coltura liquida e le cellule marcate originali vengono recuperate mediante smistamento magnetico per ottenere cellule madri invecchiate che hanno subito diverse divisioni cellulari. Quindi le cellule madri invecchiate vengono ricresciute per aumentare la loro età e quindi ordinate di nuovo o colorate per le cicatrici del sedere, e quindi distribuite su terreni selettivi e non selettivi al fine di determinare la loro età replicativa media e si ottengono risultati che mostrano se ci sono aumenti o diminuzioni specifici dell'età nell'accumulo di mutazioni sulla base di un confronto della frequenza di mutazione osservata sperimentalmente con la frequenza di mutazione prevista per le cellule del età media osservata. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'invecchiamento, come ad esempio i cambiamenti nei tassi di accumulo del danno genetico contribuiscono al normale invecchiamento, o gli effetti di alterazione della durata della vita di vari fattori genetici e ambientali, in parte a causa di cambiamenti nei tassi di mutazione.

A dimostrare la procedura sarà Melissa Patterson, una studentessa laureata nel mio laboratorio, per stabilire un tasso di mutazione di base per generazione cellulare utilizzando test di fluttuazione per cellule coltivate in condizioni di coltura standard. Per ogni coltura replicata, diluire le cellule da una a 2000 e distribuirle da uno a quattro microlitri su un terreno non selettivo per determinare le unità formanti colonie per millilitro. Pellettare le cellule rimanenti a 2.400 Gs per un minuto in una microcentrifuga e utilizzare 100 microlitri di acqua per risospenderle prima di spargerle su terreno selettivo per identificare i mutanti.

Dopo aver incubato le piastre a 30 gradi Celsius per tre giorni, contare le colonie, determinare il tasso di mutazione iniziale e la frequenza secondo il protocollo di testo di accompagnamento per etichettare la CCI charmy con biotina Inizia strisciando la coltura da uno stock di glicerolo su un terreno YPD e incuba a 30 gradi Celsius per uno o tre giorni. Utilizzando un puntale per pipetta sterile, trasferire le cellule dalla piastra ad almeno un millilitro d'acqua. Tenendo presente che da uno a un centimetro e mezzo di una porzione densamente cresciuta della striscia darà circa 10 alle otto cellule.

Utilizzare un emocitometro per determinare l'esatta densità cellulare per ogni ceppo o condizione di trattamento. Utilizzare una scorta di reagenti di biotina da cinque millimolari per etichettare da 10 a otto cellule per punto di raccolta secondo la procedura standard del produttore. Eseguire tutte le fasi di centrifugazione per cinque minuti a quattro gradi Celsius dopo il lavaggio finale.

Utilizzare l'acqua per sospendere le cellule marcate a una concentrazione finale di 10-8 cellule per millilitro per verificare la vitalità cellulare: diluire 10 microlitri di cellule con 23 microlitri di acqua e 67 microlitri di triam blue allo 0,4% in un XPBS, incubare le cellule per 40 minuti a temperatura ambiente prima di utilizzare un emocitometro per valutare le cellule vive o non colorate e morte o colorate. Dopo aver misurato i valori basali per l'età cellulare e la frequenza di mutazione, secondo il protocollo di testo, trasferire le cellule marcate con biotina a 20 millilitri di terreno YPD. Fai finta di guardare le otto celle.

Coltiva le colture per 16-18 ore a 20 gradi Celsius a circa 10-otto cellule per millilitro. Non lasciare che le cellule raggiungano la fase stazionaria e, se necessario, mantenere le cellule a quattro gradi Celsius per diverse ore per ottimizzare i tempi del periodo di crescita e raccolta. Dopo aver determinato la densità cellulare e aver pellettato le cellule a quattro gradi Celsius, lavare le celle aggiungendo 30 millilitri di etichettatura a microsfera, tampone e vortex, quindi far girare la sospensione e versare il surnatante.

Dopo un secondo lavaggio, sospendiamo le cellule in 50 microlitri di tampone per l'etichettatura delle perline. Fingi di avere un vortice per le otto celle totali. Aggiungere due microlitri di perle magnetiche, fingere alle otto celle totali e dopo aver girato brevemente incubare sul ghiaccio per 10 minuti capovolgendo periodicamente.

Quindi, utilizzare 30 millilitri di tampone per l'etichettatura delle perline per lavare le cellule tre volte. Quindi aggiungere 0,5 millilitri di tampone per l'etichettatura delle perline. Fingi di avere le otto celle totali e fai vorticare brevemente il pellet su un'impostazione media fino a quando le celle non vengono risospese.

Versare la sospensione attraverso un colino cellulare da 40 micron in un tubo da 50 millilitri per rimuovere eventuali grumi di cellule rimanenti. Se necessario, lasciare le celle in ghiaccio per una o due ore prima di caricarle sulla colonna. Seguire il protocollo consigliato dal produttore per le colonne magnetiche utilizzando fino a due volte 10 per il totale di nove celle ciascuna.

Fare attenzione a rimuovere qualsiasi materiale aerabile durante il caricamento delle colonne e rimuovere e sostituire la colonna sul separatore tra un lavaggio e l'altro per evitare che le celle rimangano intrappolate tra le perline. Quando si utilizzano separatori multicolonna per l'elaborazione di più colonne dello stesso campione, eluirli tutti nella stessa provetta di raccolta per ridurre i tempi di manipolazione e diminuire la perdita di cellule, se lo si desidera. Risparmiare il flusso attraverso le fasi di legame e lavaggio per analizzare le cellule giovani prodotte dalle cellule madri dopo aver concentrato le cellule mediante centrifugazione a 3000 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius, aspirare tutto tranne un millilitro di tampone.

Fingi di avere le otto cellule originali marcate con la biotina. Quindi vorticare brevemente per sospendere le celle nel tampone rimanente. Utilizzare il triam blue per colorare un'aliquota di cellule diluite e utilizzare un emocitometro per determinare la densità e la vitalità cellulare.

Quindi calcola il numero totale di celle recuperate. Se il numero di cellule è sostanzialmente superiore al previsto, far passare il campione di eluizione attraverso un'altra colonna per cercare di rimuovere le cellule giovani contaminanti. Se il numero di celle è sostanzialmente inferiore al previsto, far passare il flusso salvato.

Campionare attraverso un'altra colonna per cercare di migliorare la resa delle cellule madri, se lo si desidera. Ricrescere le cellule per aumentare l'età replicativa e seguire l'etichettatura e l'ordinamento delle perle senza l'etichettatura della biotina. Per determinare l'età replicativa, trasferire 25 microlitri di cellule recuperate in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri e utilizzare un millilitro di XPBS per lavare le cellule due volte per etichettare le cicatrici sulle gemme sulla superficie delle cellule.

Utilizzare 180 microlitri di un XPBS e 20 microlitri di WGA coniugato fluorescente per risospendere le cellule, coprire la provetta da centrifuga da 1,5 millilitri con un foglio e incubare con un leggero dondolo a 30 gradi Celsius per 30 minuti dopo l'incubazione. Usa un XPBS per lavare le celle tre volte. Quindi, per la microscopia a fluorescenza, utilizzare un reagente Antifa per montare le cellule sui vetrini per evitare il movimento delle cellule durante l'imaging.

Polimerizzare completamente i vetrini al buio per un massimo di alcuni giorni. Contare le cicatrici delle gemme su almeno 50 cellule per campione per ottenere una misura rappresentativa dell'età cellulare. In alternativa, dopo aver sospeso le cellule in un XPBS, eseguire la citometria a flusso utilizzando le impostazioni descritte nel protocollo di testo: grafico delle cicatrici delle gemme sulle cellule giovani e sulle cellule dell'età contate al microscopio sull'asse Y rispetto alla media geometrica normalizzata della fluorescenza coniugata WGA dalle stesse popolazioni cellulari sull'asse x.

Infine, ottenere l'equazione di una linea di tendenza lineare per questa relazione Per la successiva sostituzione, la media geometrica normalizzata di WGA coniuga l'intensità di fluorescenza di una popolazione cellulare per X nell'equazione e risolve per Y per determinare l'età media delle cellule di un campione. Questo grafico illustra che il tasso di mutazione nel gene can one era simile prima e dopo la marcatura della biotina Nelle popolazioni di lieviti giovani indipendenti, le frequenze di mutazione erano simili anche nelle cellule giovani prima e dopo la marcatura della biotina quando coltivate a 20 gradi Celsius o 30 gradi Celsius. Il grafico mostrato qui mostra cosa si può osservare quando si contano le cellule recuperate dopo l'etichettatura della biotina e lo smistamento di cellule non trattate o di cellule trattate con un millimolare di perossido di idrogeno dopo il primo smistamento.

Il numero di cellule può apparire più alto del previsto dopo il primo ordinamento e ci si aspetta una piccola perdita progressiva di cellule con lo smistamento continuo. L'età replicativa è stata determinata mediante il conteggio manuale delle cicatrici marcate in fluorescenza, ma anche sulle cellule, come mostrato qui come si vede in questa figura. Il segnale fluorescente ma cicatriziale della citometria a flusso è stato confrontato con i conteggi manuali per ottenere una relazione lineare che consente di determinare l'età replicativa delle popolazioni di cellule madri e di controllo mediante citometria a flusso.

Questi grafici mostrano esempi di frequenze di mutazione osservate simili o elevate di cellule madri invecchiate rispetto alle frequenze previste calcolate dall'età media delle cellule madri e dalle frequenze e dai tassi di mutazione ottenuti per le popolazioni di cellule giovani. A seconda della posizione genomica del gene può uno Seguendo questa procedura. Altri metodi possono essere utilizzati come la colorazione per le specie reattive dell'ossigeno o la morfologia ulare per rispondere a domande aggiuntive come quali cambiamenti nella fisiologia cellulare sono associati a cambiamenti legati all'età nell'accumulo di mutazioni.