Name: Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Scopri come identificare interazioni proteina-proteina in modo parallelo e non distorto utilizzando microarray di proteine funzionali. Questo metodo ad alto rendimento consente l'analisi di migliaia di interazioni simultaneamente.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del NIH. I saggi mostrati in Figura 1 sono stati eseguiti dal Dr. Joseph Fasolo. Ringraziamo il Dr. Rui Chen per gli utili commenti.

1. Preparazione della sonda <ol><li> Cultura e purificare le sonde chinasi V5-fusione utilizzate per esaminare le interazioni con altre proteine ​​come segue: <ol><li> Utilizzare appena striato ceppo di lievito Y258 (Mata pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) contenenti proteine ​​V5-fusion (espressa da GATEWAY vettoriali pYES-DEST52). Utilizzare la proteina isolata come sonda sui microarray. Piatto il lievito in sintetico complete-uracile (Sc-Ura) / 2% destrosio / Agar e crescere a 30 ° C per 3 giorni di cultura congelati (-80 ° C glicerolo magazzino). </li><li> Seminare colture starter (5-20 ml) da una singola colonia e crescere durante la notte in Sc-Ura / 2% destrosio sulla piattaforma (220-250 giri al minuto) o la rotella che agita a 30 ° C. </li><li> La mattina seguente, inoculare 400 ml di Sc-Ura / 2% cultura raffinosio con la cultura di avviamento sufficiente per un diametro finale 600 del 0.1. </li><li> Crescere i inoculums a OD 600 di 0,6, seguita da induzione galattosio del fu V5-chinasisione costruire espressione aggiungendo una soluzione di 3x Yeast Extract / Peptone (YEP) supplementato con 6% galattosio, aggiungendo abbastanza per diluire il supporto di induzione di un fattore 3 in modo che la concentrazione finale di galattosio è 2%. </li><li> Indurre le cellule a 30 ° C per 6 h su una piattaforma oscillante. Utilizzare un pallone da 2 L Erlenmeyer per garantire un&#39;adeguata aerazione. </li><li> Celle di raccolta utilizzando un rotore JA-10 (o comparabili) facendo girare 400 ml di sospensione cellulare a 1000 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule una volta con 50 ml di ghiaccio tampone PBS freddo e trasferirlo in una provetta da 50 ml. Lavare il pellet di nuovo in ghiaccio PBS freddo (senza detergenti o altri additivi) utilizzati per lisi e trasferimento in 2 ml snap-cap tubi per lisi. </li><li> Spin le cellule a 20.000 xg per 1 min a 4 ° C per un pellet e pipetta via buffer. </li><li> Mettere le provette su ghiaccio e procedere con il passaggio di lisi. </li><li> Lyse le cellule (250-350 ml pellet) con 00,5 millimetri perle zirconia in un 1: 1: 1 volume di pellet, perline, e PBS (PBS) Lysis Buffer e vortex la miscela utilizzando una piattaforma di agitazione per 3 volte a 2 min a intervalli di 4 ° C. </li><li> Centrifugare il lisato a 20.000 xg in una microcentrifuga da tavolo per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Dispensare surnatante in provetta da centrifuga in policarbonato ad alta velocità e chiarire da ulracentrufugation per 30 min a 150.000 xg a 4 ° C. </li><li> Trasferire il lisato chiarificato in una provetta contenente prelavato Ni 2 + resina di affinità (~ 100 ml) e incubare su un nutator per 2 ore a 4 ° C per catturare istidina (His) 6X tagged proteine ​​V5-fusion. </li><li> Lavare la resina tre volte per 10 minuti a 4 ° C con tampone di lavaggio. Pellet resina utilizzando una centrifuga da tavolo per 5 min a 1000 xga 4 ° C e aspirare il surnatante. Aggiungere tampone di lavaggio fresco per ogni lavaggio e restituire il tubo del nutator per l&#39;agitazione durante il lavaggio. </li><li> Dopo il lavaggio steps sono completi, applicare la resina lavato per un nuovo G-25 colonna per eluizione. </li><li> Applicare 25 microlitri di tampone di eluizione in maniera graduale iniziando con imidazolo 100 mM imidazolo 500 mM in incrementi di 50 mm per un totale di 9 frazioni. </li><li> Analizzare frazioni raccolte utilizzando gel di sodio dodecil solfato poliacrilammide (SDS-PAGE) e colorazione Coomassie identificare la frazione (s) più altamente arricchito per l&#39;uso nel saggio e aggiungere glicerolo al 30% e conservare a -80 ° C fino all&#39;uso nel test. </li></ol></li></ol> 2. Probing gli Array NOTA: Si prega di vedere il punto 2.6 di questa sezione per preparare la soluzione di anticorpi prima di iniziare il test. <ol><li> Per rilevare le interazioni, diluire l&#39;anticorpo coniugato V5-fluoroforo (cioè AlexaFluor 647) a 260 ng / ml in tampone sonda e mescolare accuratamente agitando. NOTA: Preparare questa soluzione di anticorpo 30 min prima dell&#39;uso e porre il tubo su una nutato o ruota per permettere una miscelazione completa e una sospensione omogenea di anticorpi. </li><li> Diluire la sonda proteica V5-fusione su un intervallo di concentrazione di 5-500 mg / ml. NOTA: Ottimizzato per ogni proteina-proteina test interazione, utilizzando tampone sonda. Ottimizzazione comporta l&#39;aggiunta più sonde per sondare buffer. Tipicamente 10 ug / ml viene usata come punto di partenza e regolati di conseguenza sulla base della forza del segnale. </li><li> Rimuovere i microarrays della proteina dal congelatore (-20 ° C) e portare a 4 ° C in frigorifero immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Aggiungere tampone di bloccaggio direttamente al titolare diapositiva contenente i micorarrays proteine ​​e coprire la parte superiore con parafilm per evitare perdite. Bloccare gli array in tampone bloccante per 1 ora agitando a 50 giri su un palco a 4 ° C. </li><li> Dopo il blocco, trasferire gli array ad una camera umidificata refrigerate a 4 ° C e aggiungere 90 ml di sonda diluito direttamente sulla superficie dell&#39;array. Sovrapporre il arrays con una scivolata sollevatore alzato e incubare statico (senza agitando) nella camera umidificata a 4 ° C per 1,5 ore. </li><li> Lavare gli array 3 volte per 1 min ciascuna in tampone sonda in tre provette da 50 ml coniche. Aggiungere la diapositiva per provette coniche contenenti abbastanza tampone sonda pre-raffreddata a busta completamente la diapositiva. Lasciare che la polizza sollevatore di scivolare delicatamente fuori del microarray di proteine ​​(non forzare fuori come questo potrebbe causare danni alla superficie array). </li><li> Applicare la soluzione di anticorpi direttamente a matrice immediatamente dopo aver completato il lavaggio (passo 2.5) e overlay con una scivolata sollevatore cresciuto come prima. Incubare le matrici per 30 min a 4 ° C in camera umidificata. </li><li> Eseguire la stessa fase di lavaggio come prima (3 volte 1 min in tampone sonda), e centrifuga in una provetta conica da 50 ml a 800 xg in una centrifuga da tavolo per 5 min a temperatura ambiente. Asciugare gli array in un supporto di diapositive al buio per 30 minuti prima scansione della matrice a 647 nm. </li></ol>

<ol><li>Fasolo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+protein+kinase+interactions+identified+by+protein+microarrays+reveal+novel+connections+between+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes.</a> Genes. 25, 767-778 (2011).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il protocollo è stato originariamente presentato effettuata utilizzando 85 proteine ​​del lievito proteine ​​chinasi-V5 fusione unica di confrontare attività di legame attraverso distinte famiglie e connessi di protein chinasi lievito conseguente individuazione di nuove reti di interazione in vivo chinasi 1. Come un emergente tecnologia profilazione proteomica, lo sviluppo di High Throughput (HTP) proiezione del proteoma usando microarrays della proteina invocato librerie peptidiche e eucarioti e pro...

La necessità di effettuare analisi globali di biochimica delle proteine ​​e di attività in vivo legame ha portato allo sviluppo di nuovi metodi di profiling interazioni proteina-proteina (PPI) e le modificazioni post-traduzionali di proteomi interi 1,3-8. Microarrays proteine ​​sono prodotte come microarray proteici funzionali utilizzando proteine ​​funzionali full-length 4-6,8,9 o microarrays della proteina analitiche contenenti anticorpi 10,11. Essi sono progettati per contenere una alta densità di proteine ​​disposte su vetrini da microscopio con una varietà di chimiche superficiali per facilitare una varietà di condizioni sperimentali necessari per condurre ampio biochimico analisi 12. Nitrocellulosa e di superficie aldeide chimiche per il fissaggio chimico tramite lisina o attaccamento affinità metodi come diapositive chelati nichel per fissare le proteine ​​His-tag e glutatione per il fissaggio affinità tra gli altri 13. </p&gt; L&#39;uso di microarray della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina richiede l&#39;accesso a una elevata qualità library proteina funzionale 14. S. cerevisiae è suscettibile di produrre una tale biblioteca attraverso l&#39;abbinamento di alta copia affinità tagged costrutti di proteine ​​ad alto throughput tecniche di purificazione cromatografica. La stragrande maggioranza del genoma del lievito è stato sequenziato e quasi l&#39;intero proteoma può essere espresso da un plasmide alta copia per la purificazione e biochimico analisi 12. Una volta che le proteine ​​sono ottenuti e disposte in formato da 384 pozzetti, vengono stampate su un vetrino da microscopio che permette una rapida analisi biochimica multi-parametrica parallelo e interrogatori bioinformatica 8,14-16. Microarrays della proteina sono stati utilizzati per saggi enzimatici e interazioni con proteine, lipidi, piccole molecole, e acidi nucleici tra molte altre applicazioni. L&#39;accessibilità delle proteine ​​sulla superficie del proteomaarray li rendono suscettibili di diversi tipi di rilevazione analitica, tra cui, immuno-affinità, risonanza plasmonica di superficie, fluorescenza e molte altre tecniche. Inoltre, esso consente un controllo preciso della condizione sperimentale dove potrebbe essere difficile da fare in vivo. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare l&#39;uso appropriato di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina. Questa applicazione consente l&#39;analisi biochimica in parallelo ad alta produttività delle attività di legame alle proteine ​​usando un analita altamente purificato (proteina) di interesse. Una C-terminale (carbossi-terminale) etichettato V5-fusione esca proteina di interesse è prodotta da un plasmide alta copia in un ceppo di lievito ottimizzato per la purificazione della proteina. C-terminale codifica assicura che l&#39;intera lunghezza proteina è stato tradotto. La proteina utilizzata in questo studio è TDA1-V5 proteina di fusione chinasi, che viene potabilizzata con resina nichel affinità tramite un tag His6X. La costru fusione TDA1-V5t è purificato tramite eluizione seriale utilizzando un gradiente di imidazolo per eluire la frazione più altamente arricchito per l&#39;uso nel saggio.

<table><tbody><tr><td>Piastre di Petri</td><td>VWR</td><td>NC-10747</td><td>o</td></tr><tr><td>equivalente Estratto di lievito Bacto</td><td>Difco</td><td>0217-17</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>Difco</td><td>0118-17</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Raffinosio</td><td>Sigma</td><td>R0514</td><td></td></tr><tr><td>Galattosio</td> Terreno di estrazione <td>Sigma</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Sc-Ura</td><td>MP Bio</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>Piccole provette per coltura</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacone di Erlenmeyer grande</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotore</td><td></td><td></td><td></td>JA-10</tr><tr><td>Provette per centrifuga (500 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provetta Falcon (50 ml)</td><td>VWR/Fisher</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Compresse PBS Sigma</td><td></td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Provette FastPrep (tubo con tappo a vite da 2 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macchina FastPrep</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Perline di zircone</td><td>BioSpec</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazolo (pH = 7,4)</td><td>Sigma</td><td>I5513&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori (senza EDTA)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della fosfatasi 1</td><td>sigma</td><td>P2850</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A1852&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice a scuotimento (30 &deg; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Resina di affinità del nichel Life</td><td>Technologies</td><td>colonna R901-01</td><td></td></tr><tr><td>G25</td><td>GE scienze della vita</td><td>27-5325-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Gel (NuPage)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue Stain</td><td>Life Technologies Anticorpo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>monoclonale V5</td><td>Life Technologies</td><td>R960-25</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 Tagged monoclonale V5 Anticorpo</td> Life <td>Technologies</td><td>451098</td><td></td></tr><tr><td>Microarray di proteine Kit</td><td>Life Technologies</td><td>PAH0525013</td><td></td></tr><tr><td>Genepix Scanner</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lifter scivola</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/</td></tr> <tr><td>tampone di lisi: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazolo (pH 7,4), cocktail completo di inibitori della proteasi ... Cocktail di inibitori della fosfatasi senza EDTA 1, 1 mM PMSF&nbsp; (aggiungere appena prima dell'uso)</td><td></td><td></td><td>Aggiungere i reagenti a 1x PBS (tampone fosfato 0,01 M, cloruro di potassio 0,0027 M, cloruro di sodio 0,137 M; pH 7,4) per ottenere il volume desiderato di soluzione di lisi</td></tr><tr><td>Tampone bloccante: 1% albumina sierica bovina (BSA), 0,1% Tween-20</td><td></td><td></td><td>Aggiungere i reagenti a 1x PBS per ottenere il volume desiderato di tampone</td></tr> <tr><td>bloccanteTampone sonda: 2 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 &mu; M ATP (per chinasi), 1% BSA</td><td></td><td></td><td>Aggiungere il reagente a 1x PBS per ottenere il volume desiderato di tampone sonda</td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio: 0,1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 50 mM imidazolo (pH 7,4), 2 mM MgCl2</td><td></td><td></td><td>Aggiungere il reagente a 1x PBS per ottenere il volume desiderato di tampone sonda</td></tr><tr><td>Tampone di eluizione: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 - ndash; 500 mM di imidazolo (pH 7,4), cocktail completo di inibitori della proteasi Cocktail di inibitori della fosfatasi senza EDTA 1, 1 mM PMSF (aggiungere appena prima dell'uso)</td><td></td><td></td><td>Prima di iniziare, è importante annotare il gradiente di concentrazione di imidazolo (50 &ndash; 500 mM) e creare provette separate per ogni concentrazione (si consiglia di creare l'intervallo utilizzando incrementi di 50 mM). Aggiungere il reagente a 1x PBS per ottenere il volume desiderato di tampone sonda</td></tr><tr><td>3x YEP +6% galattosio: sciogliere 30 g di estratto di lievito e 60 g di peptone in 700 ml di H2O e sterilizzare in autoclave. Aggiungere 300 ml di filtro sterilizzato al 20% di galattosio (wt/vol)</td><td></td><td></td><td>&nbsp; Il galattosio non deve essere sterilizzato in autoclave</td></tr></tbody></table>

probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Ad alta densità di microarrays della proteina funzionali contenenti ~ 4.200 proteine ​​ricombinanti di lievito vengono esaminati per le interazioni proteina-proteina chinasi utilizzando una proteina di fusione purificate per affinità lievito chinasi contenente un tag V5-epitopi per read-out. Chinasi purificata è ottenuto attraverso la cultura di un ceppo di lievito ottimizzato per alta copia la produzione di proteine ​​ospitare un plasmide contenente una fusione chinasi-V5 costruire sotto un elenco indirizzi globale promotore inducibile. Il lievito viene coltivato in mezzi restrittiva con una fonte di carbonio neutro per 6 ore seguita da induzione con 2% galattosio. Successivamente, la coltura è raccolta e chinasi è purificato mediante affinità standard di tecniche cromatografiche per ottenere una proteina chinasi altamente purificata per uso nel saggio. La chinasi purificata è diluita con tampone chinasi ad una gamma appropriata per il dosaggio e microarray della proteina sono bloccate prima ibridazione con il microarray della proteina. Dopo l&#39;ibridazione, gli array vengono sondati con un anticorpo monoclonale V5 ANTIBody per identificare le proteine ​​legate dalla proteina chinasi-V5. Infine, gli array vengono sottoposti a scansione utilizzando uno scanner microarray standard ei dati vengono estratti per l&#39;informatica a valle dell&#39;analisi 1,2 per determinare una elevata fiducia insieme di interazioni proteiche per la convalida a valle in vivo.

L'attività di interazione proteina-proteina è stata osservata utilizzando un lettore di chip standard per valutare l'TDA1-V5 proteina chinasi di fusione costrutto come proteina esca contro un lievito microarray proteina funzionale contenente circa 4,200 unica S. cerevisiae proteine ​​di fusione GST-. Ulteriore interrogatorio con il software GenePix rivelato una moltitudine di eventi di intensità variabili vincolanti. L'affinità è stato misurato l'intensità graduata del segnale derivato da un anticorpo monoclona...

Utilizzando microarray proteici contenenti quasi tutta la S. cerevisiae proteoma è sondato per un rapido interrogatori imparziale di migliaia di interazioni proteina-proteina in parallelo. Questo metodo può essere utilizzato per la proteina-piccola molecola, modificazione post-traslazionale, e altri saggi in high-throughput.

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le interazioni proteiche tra proteine e proteine all'interno di un dato proteoma in modo parallelo e imparziale, cosa che non è possibile con altre tecnologie. Ciò si ottiene ibridando prima la proteina di interesse ibridata e marcata con l'epitopo con una libreria proteica funzionale altamente purificata, a lunghezza intera, depositata in un piano di coordinate sulla superficie di un vetrino da microscopio. Una volta che la proteina ha raggiunto l'equilibrio con ciascuna delle sue rispettive proteine bersaglio sull'array, la frazione non legata viene lavata via e le interazioni proteiche vengono rilevate con un anticorpo monoclonale contro l'epitopo coniugato a una porzione fluorescente utilizzando uno scanner microarray standard.Le immagini risultanti sono interlacciate con informazioni riguardanti l'intensità di ciascuna caratteristica rispetto alla proteina legata e al segnale fluorescente. Queste informazioni vengono estrapolate con l'aiuto del software di analisi dei microarray per generare un elenco di valori di intensità per ogni caratteristica dell'array. Le informazioni relative alla coppia di interazione proteina-pr

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Questo video mostra esperimenti con successiva analisi delle interazioni proteina-proteina mediante l'uso di micro-fantasia superfici. L'approccio offre la possibilità di rilevare le interazioni delle proteine ​​nelle cellule viventi e combina le elevate capacità di throughput con la possibilità di estrarre informazioni quantitative.

In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici

In questo studio, si descrive un protocollo migliorato per un multiplato ad alta resa microarray anticorpo con metodo di rilevazione lectina che può essere utilizzato in profili glicosilazione di proteine ​​specifiche. Questo protocollo offre nuovi reagenti affidabili e riduce sensibilmente i tempi, i costi e alle attrezzature di laboratorio rispetto alla procedura precedente.

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

Questo video mostra una tecnica che utilizza peptidi biotinilati che penetrano nelle cellule per rilevare le interazioni intracellulari proteina-proteina. I peptidi che penetrano nelle cellule facilitano l'ingresso del peptide coniugato in una cellula e si legano specificamente alle sue proteine interagenti. La biotina, dopo essersi legata all'avidina, permette la purificazione del complesso proteico interagente da un lisato cellulare.

Sonda peptidica biotinilata a penetrazione cellulare per rilevare le interazioni proteina-proteina

Questo video dimostra la visualizzazione delle interazioni proteina-proteina alla giunzione neuromuscolare di Drosophila (NMJ) utilizzando il Proximity Ligation Assay (PLA). Dopo aver isolato le pareti corporee, le proteine interagenti vengono sondate con anticorpi primari e anticorpi secondari coniugati con PLA. La vicinanza delle proteine interagenti facilita la legatura delle sonde con oligonucleotidi connettori, formando DNA circolare, che viene poi amplificato dall'amplificazione del...

Rilevamento delle interazioni proteina-proteina nelle larve di Drosophila utilizzando un saggio di legatura di prossimità

Lo screening dell'array di peptidi è un test ad alto rendimento per identificare i siti di interazione proteina-proteina. Ciò consente di mappare più interazioni di una proteina bersaglio e può servire come metodo per identificare i siti per gli inibitori che prendono di mira una proteina. Qui descriviamo un protocollo per lo screening e l'analisi degli array di peptidi.

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

Le proteine interagiscono tra loro e queste interazioni determinano in gran parte le loro funzioni. I partner di interazione proteica possono essere identificati ad alto rendimento in vivo utilizzando un saggio di fitness del lievito basato sul saggio di complementazione del frammento proteico diidrofolato reduttasi (DHFR-PCA).

Genome-wide proteina-proteina interazione Screening per Protein-frammento Complementation Assay (PCA) in cellule viventi

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un'etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Qui, presentiamo un protocollo di microarrays della proteina extracellulare dello schermo per l'identificazione delle interazioni recettore-ligando romanzo in elevato throughput. Inoltre descriviamo un metodo per migliorare la rilevazione delle interazioni proteina-proteina transitoria utilizzando complessi proteina-Microperlina.

Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Le proteine Cognate J-domain cooperano con l'accompagnatore Hsp70 per assistere in una miriade di processi biologici che vanno dal ripiegamento proteico alla degradazione. Qui, descriviamo un analisi di legatura di prossimità in situ, che consente il monitoraggio di questi macchinari chaperone tradotti transitoriamente in cellule batteriche, lieviti e umane.

Monitoraggio in Situ di gruppi di chaperone molecolari formati in farmaci, lieviti e cellule umane

Qui, presentiamo un protocollo per consentire la cattura e l'identificazione di interazioni proteina-proteina specifiche della malattia da cellule e tessuti nativi utilizzando sonde chimiche e spettrometria di massa. I set di dati di interazione risultanti vengono analizzati attraverso una piattaforma web dedicata per rivelare disfunzioni dinamiche della rete e alterazioni del percorso legate alla malattia.

Mappatura delle interazioni disfunzionali proteina-proteina nella malattia

Scopri come identificare interazioni proteina-proteina in modo parallelo e non distorto utilizzando microarray di proteine funzionali. Questo metodo ad alto rendimento consente l'analisi di migliaia di interazioni simultaneamente.

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

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