Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare le interazioni proteiche tra proteine e proteine all'interno di un dato proteoma in modo parallelo e imparziale, cosa che non è possibile con altre tecnologie. Ciò si ottiene ibridando prima la proteina di interesse ibridata e marcata con l'epitopo con una libreria proteica funzionale altamente purificata, a lunghezza intera, depositata in un piano di coordinate sulla superficie di un vetrino da microscopio. Una volta che la proteina ha raggiunto l'equilibrio con ciascuna delle sue rispettive proteine bersaglio sull'array, la frazione non legata viene lavata via e le interazioni proteiche vengono rilevate con un anticorpo monoclonale contro l'epitopo coniugato a una porzione fluorescente utilizzando uno scanner microarray standard.

Le immagini risultanti sono interlacciate con informazioni riguardanti l'intensità di ciascuna caratteristica rispetto alla proteina legata e al segnale fluorescente. Queste informazioni vengono estrapolate con l'aiuto del software di analisi dei microarray per generare un elenco di valori di intensità per ogni caratteristica dell'array. Le informazioni relative alla coppia di interazione proteina-proteina possono essere esportate nel software di analisi bioinformatica a valle per valutare i dati specifici della caratteristica e identificare le interazioni proteina proteina tra la proteina di interesse e le proteine sul microarray.

I dati grezzi sull'intensità del segnale vengono compilati su due o più microarray di proteine per tenere conto della variazione tra e tra i saggi e i dati vengono normalizzati per valutare ciascuna delle interazioni. L'output risultante genera un elenco di proteine interagenti, che può essere utilizzato per guidare ulteriori interrogazioni delle interazioni proteina-proteina. Il microarray proteico funzionale in vivo è stato sviluppato nel laboratorio di Michael Snyder oltre 15 anni fa.

Da allora, ci sono state molte applicazioni di successo di questa tecnologia grazie alla sua versatilità e ai saggi di proteomica biochimica. Questa tecnica facilita lo studio delle interazioni proteiche e delle reti di segnalazione modulari, nonché della connettività alternativa e delle cascate di segnalazione precedentemente note Per coltivare e purificare le sonde chinasi di fusione V five utilizzare il ceppo di lievito Y 2 58 appena striato contenente la piastra proteica di fusione V five, il lievito su uracile completo sintetico, agar destrosio al 2% e crescere a 30 gradi Celsius per tre giorni dalla coltura congelata. Inoculare le colture starter da una singola colonia e crescere durante la notte in uracile completo sintetico.

2% di destrosio su una piattaforma di agitazione o una ruota a 30 gradi Celsius. La mattina seguente, inoculare 400 millilitri di un uracile completo sintetico. Coltura di raffinosio al 2% con coltura starter sufficiente per ottenere una densità ottica finale a 600 nanometri o un OD 600 di 0,1.

Far crescere gli inoculi fino a un OD 600 di 0,6, quindi indurre l'espressione del costrutto di fusione V cinque chinasi aggiungendo una quantità sufficiente di estratto di lievito tre x. Pep tone integrato con il 6% di galattosio per diluire il mezzo di induzione di un fattore tre o una concentrazione finale di galattosio del 2%Indurre le cellule a 30 gradi Celsius per sei ore su una piattaforma di agitazione. Utilizzare un pallone da due litri per garantire un'aerazione adeguata.

Raccogli le cellule facendo girare 400 millilitri di sospensione cellulare a 1000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Lavare le cellule una volta con 50 millilitri di tampone PBS ghiacciato e trasferirle in una provetta conica da 50 millilitri. Lavare nuovamente il pellet in soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato o tampone PBS A e trasferirlo in provette con tappo a scatto da due millilitri per la lisi.

Dopo aver fatto girare le cellule a 20.000 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius, rimuovere il tampone con una pipetta e posizionare le provette sul ghiaccio. Licare le celle con 0,5 millimetri di perle di zirconia in un volume uno a uno di pellet di cellule in perle di lisi PBS, tampone. Quindi agitare la miscela tre volte utilizzando una piattaforma di agitazione per intervalli di due minuti a quattro gradi Celsius.

Centrifugare il lisato a 20.000 volte, G in una micro-fuge da tavolo per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il lisato chiarificato in una provetta contenente circa 100 microlitri di resina di affinità al nichel prelavata e incubare su un nutato per due ore a quattro gradi Celsius. Per catturare l'istamina, sei x marcato V cinque proteine di fusione, pellet la resina utilizzando una centrifuga da tavolo per cinque minuti a 1000 volte G e quattro gradi Celsius dopo la rimozione del surnatante.

Lavare la resina con il tampone di lavaggio per 10 minuti a quattro gradi Celsius sul mutatore. Ripetere il lavaggio altre due volte con un tampone di lavaggio fresco. Eluire le proteine con due volumi da 100 microlitri di olo da 200 millimolari.

Aggiungere glicerolo a una concentrazione finale del 30% dei campioni e conservare a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'utilizzo nel saggio. Per rilevare le interazioni. Diluire l'anticorpo coniugato V cinque fluoro quattro a 260 nanogrammi per millilitro in sonda, tamponare e mescolare accuratamente agitando.

Quindi diluire la sonda per proteina di fusione V 5 in un intervallo di concentrazione compreso tra cinque e 500 microgrammi per millilitro. Quindi, rimuovere i microarray proteici dal congelatore e portarli a quattro gradi Celsius in frigorifero appena prima dell'uso. Aggiungere il tampone di blocco direttamente al supporto del vetrino contenente i microarray di proteine e coprire la parte superiore con paraforma per evitare perdite.

Bloccare gli array nel buffer di blocco per un'ora agitandoli a 50 RP su uno stadio a quattro gradi Celsius. Dopo il blocco, trasferire gli array in una camera umidificata, piastrellata a quattro gradi Celsius e aggiungere 90 microlitri di sonda diluita direttamente sulla superficie dell'array. Sovrapporre gli array con un lifter slip rialzato e incubare senza agitare nella camera umidificata a quattro gradi Celsius per un'ora e mezza Dopo l'incubazione, aggiungere il vetrino a una provetta conica da 50 millilitri contenente una quantità sufficiente di tampone sonda pre-raffreddato per avvolgere completamente il vetrino, consentendo allo scivolo del sollevatore di scivolare delicatamente fuori dal microarray proteico.

Lavare gli array tre volte per un minuto ciascuno in tre tubi conici. Applicare la soluzione di anticorpi direttamente sull'array subito dopo aver completato il lavaggio e sovrapporre con lo slip lifter cancellato. Come in precedenza, incubare gli array per 30 minuti a quattro gradi Celsius nella camera umidificata.

Eseguire la stessa fase di lavaggio di prima e centrifugare in una provetta conica da 15 millilitri a 800 volte G in una centrifuga da tavolo per cinque minuti. A temperatura ambiente, asciugare all'aria gli array in un supporto per vetrini al buio per 30 minuti prima di scansionare l'array a 647 nanometri. In questo esperimento, è stata studiata l'attività di legame di TDA one V five.

I microarray di proteine di lievito individuati in duplicato con circa 4.200 proteine di fusione GST a lunghezza intera sono stati incubati con il controllo a vettore vuoto o con sonde TDA one V five. I pannelli interni confrontano la stessa regione in entrambe le matrici. Di particolare rilievo è RIM 11, che è stato anche identificato come bersaglio fosforilato di TDA one in uno studio precedentemente pubblicato.

Una volta identificati i bersagli, questi possono essere testati per l'attività biochimica e funzionale in vivo. Se stai guardando questo video, dovresti avere una migliore comprensione di come utilizzare i microarray proteici funzionali come mezzo per identificare le interazioni proteiche candidate per un'ulteriore convalida e interrogazione in vivo.