Name: Generazione di transgenici Hydra Da Embryo microiniezione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Impara a generare linee transgeniche stabili di Hydra mediante microiniezione di DNA plasmidico in embrioni. Questo metodo consente di studiare funzioni geniche e dinamiche cellulari in un organismo modello rigenerativo.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un G. Harold e Leila Y. Mathers Premio per HL e una sovvenzione NIH (R24 GM080527) per RESCEJ stato un NRSA Postdoctoral Fellow (NIH F32GM9037222) ed è attualmente supportato da un Mentored Research Scientist Development Award dal National Institute on Aging (K01AG04435). Vorremmo ringraziare i revisori per utili commenti.

1 Preparazione di DNA plasmidico, aghi, e piatti iniezione <ol><li> Preparare il DNA plasmidico utilizzando un kit Maxi alta velocità o Midi e concentrare il DNA a 2,5 mg / ml mediante precipitazione in etanolo. Il pellet di DNA deve essere sciolto in acqua deionizzata priva di nucleasi. Conservare il DNA in 10-20 microlitri aliquote a -20 ° C. (Vedi Tabella supplementare 1 per un elenco di vettori disponibili) </li><li> Fare un piatto di iniezione utilizzando agarosio per costruire un trogolo per lo svolgimento di embrioni in una capsula di Petri di 100 x 15 mm. <ol><li> Posizionare un vetrino da microscopio 75 x 50 vetro in un piatto 100 x 15 mm Petri in un angolo. Versare circa 50 ml di 2% agarosio sciolto in Hydra medio 24 nella piastra di Petri. In alternativa, versare l&#39;agarosio nel piatto prima e galleggiare un &quot;Microiniezione pesce Mold&quot; in alto. </li><li> Dopo l&#39;agarosio si è solidificato, rimuovere il vetrino o lo stampo. Se è stato utilizzato un vetrino, tagliare via l&#39;eccesso di agarosio con un bla rasoiode per formare un muro. Versare Hydra media nel piatto e utilizzare immediatamente o conservarlo a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. Nota: i piatti iniezione possono essere riutilizzati se conservato a 4 ° C tra usi. </li></ol></li><li> Tirare aghi da capillari in vetro borosilicato con un filamento sul estrattore micropipetta con le seguenti condizioni: scaldare 525, tirare 75, velocità 100, tempo 50. Conservare gli aghi di loro premendo in una stretta striscia di argilla in una capsula di Petri tale che siano tenuto parallelo al fondo del piatto. </li><li> Per preparare la soluzione iniettabile, combinare 3 ml di / soluzione di DNA plasmidico ml 2,5 mg con 2 ml di 10% di rosso fenolo. Vortex la soluzione brevemente e poi girare per 10 min alla massima velocità in una microcentrifuga per rimuovere eventuali particelle che potrebbero intasare l&#39;ago. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, agganciare l&#39;ago a pochi millimetri dalla punta con una pinza per creare una piccola apertura. Nota: Vi è una certa flessibilità nella dimensione appropriata del apertozione perché la pressione può essere regolata nel passaggio 3.3 per accogliere questa variazione. </li><li> Porre la capsula di Petri in modo che sta tenendo l&#39;ago in posizione verticale con la punta verso il basso. Caricare l&#39;ago con circa 0,5 ml di soluzione iniettabile pipettando liquido nell&#39;estremità posteriore dell&#39;ago. Lasciare azione capillare per tirare la soluzione nella punta dell&#39;ago. </li></ol> 2 Preparazione di embrioni per iniezione <ol><li> Su base giornaliera eseguire la scansione della cultura ceppo Hydra AEP per polipi producono uova. Raccogliere questi polipi e metterli da parte in un piatto di cultura separata. Osservare questi polipi ogni poche ore durante il giorno per monitorare l&#39;andamento della formazione dell&#39;uovo. Quando le uova si rompono attraverso l&#39;ectoderma e si siedono su un anello di cellule ectodermiche retratti sono pronti per l&#39;iniezione 25. Posizionare questi polipi in un piatto con diversi Hydra che hanno testicoli per almeno 1 ora prima dell&#39;iniezione per consentire la fecondazione. Hydra &lt;/ Em&gt; maschi rilascerà spermatozoi senza alcuna manipolazione speciale. </li><li> Se le femmine si trovano nella colonia AEP con uova completamente formate, che sono circa 400 micron di diametro 25, o da 1 a 8 celle embrioni stadio, raccogliere anche questi per l&#39;iniezione. Iniettare immediatamente gli embrioni che hanno iniziato scissione. Nota: Non è possibile capire la differenza tra le uova completamente formate e zigoti unicellulari, quindi questi devono essere incubate con i maschi prima dell&#39;iniezione. </li><li> Prima dell&#39;iniezione, rimuovere la maggior parte del tessuto parentale sopra e sotto l&#39;embrione utilizzando un bisturi con lama # 15. Lasciare solo l&#39;embrione con un piccolo pezzo di colonna corpo attaccato, da utilizzare per manipolare l&#39;embrione con una pinza se necessario. Nota: Il tessuto che viene sezionato dalla embrione si rigenera e dovrebbe essere salvato per garantire che le femmine rimangono nella colonia di Hydra. </li><li> Usando una pipetta Pasteur, spostare embrioni al piatto di iniezione, disponendole parallele alla parete dellaattraverso agarosio. </li></ol> 3. Microiniezione di DNA plasmidi <ol><li> Montare il microinjector su un supporto magnetico che si siede su una lastra di ferro. Montare il supporto di iniezione, che è la parte del microinjector che contiene l&#39;ago, su un micromanipolatore joystick. Montare il manipolatore joystick per la piastra di ferro, con un supporto magnetico. Posizionare questo intero set-up sul lato destro di un microscopio da dissezione e posizionare il supporto di iniezione in modo che sia visibile nel campo di osservazione. </li><li> Porre la capsula iniezione con embrioni al microscopio da dissezione, orientato in modo tale che la parete verticale della vasca agarosio è a sinistra. Inserire l&#39;ago nel supporto di iniezione e abbassare la punta dell&#39;ago nel mezzo Hydra nel piatto. </li><li> Ruotare lentamente la manopola della siringa in senso orario fino olio minerale riempie la parte superiore dell&#39;ago e un flusso continuo di soluzione iniettabile si osserva uscire l&#39;ago nel Hydrun mezzo. Se il flusso è troppo forte, abbassare la pressione ruotando la manopola in senso antiorario. Pratica questo passo per ottenere ordinariamente una pressione adeguata, che dipende dalle dimensioni dell&#39;apertura dell&#39;ago (cioè, come l&#39;ago è stato fermato nella fase 1.5). Nota: Se il flusso è troppo forte, l&#39;embrione non sopravviverà l&#39;iniezione. </li><li> Durante la visualizzazione attraverso il microscopio da dissezione, spostare il piatto iniezione, in modo che il primo embrione è al centro del campo. Spostare l&#39;ago in modo che sia a contatto con quella dell&#39;embrione. Utilizzare il micromanipolatore per perforare l&#39;embrione con l&#39;ago. Nota: La parete verticale della vasca agarosio manterrà l&#39;embrione di essere messo da parte dal ago. </li><li> Lasciare che la soluzione iniettabile di fluire in embrione 1 o 2 secondi e poi rimuovere l&#39;ago rapidamente. Se l&#39;embrione ha più di una cella, iniettare ogni cella singolarmente. Usare pinze per riorientare l&#39;embrione per allineare la cella successiva con la punta dell&#39;ago. </li><li> Dopo il primo Embryo viene iniettato, spostare il piatto in modo che la prossima embrione è nella posizione di iniezione e ripetere la procedura; continuare fino a quando sono state iniettate tutti gli embrioni. </li></ol> 4. coltura e cova di embrioni <ol><li> Spostare tutti gli embrioni iniettati in un piatto con un paio di Hydra che hanno testicoli (questo è quello di garantire che tutti gli embrioni sono fecondati). Incubare gli embrioni in un 18 ° C incubatore mentre continuano embriogenesi. </li><li> Una volta raggiunta la fase della cuticola, spostare ogni embrione iniettato ad un pozzo individuale di una piastra da 24 pozzetti riempiti con Hydra medie. </li><li> Incubare gli embrioni iniettati per 2 settimane al buio a 18 ° C. </li><li> Dopo il periodo di incubazione 2 settimane, controllare ogni embrione iniettato sotto il microscopio da dissezione. Nota casi in cui l&#39;embrione cuticola stadio ha staccati dal piccolo pezzo di tessuto parentale e il tessuto dei genitori ha rigenerati. Rimuovere questo polipo rigenerato immediatamente in modo che non è mistaken per un nuovo cucciolo. </li><li> Spostare il piatto di embrioni iniettati sotto una luce acquario a temperatura ambiente. Controllare le piastre ogni giorno e raccogliere larve. Le nuove larve saranno bianco perché il tipico colore rosa di polipi Hydra nasce dalla Artemia di cui si nutrono. </li><li> Osservare i piccoli sotto un microscopio a fluorescenza per rilevare l&#39;espressione del transgene. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Hydra riproduce asessualmente di routine, ma richiede stimoli ambientali per iniziare la produzione di gameti. Questi stimoli non sono ben definiti, per la maggior parte delle specie Hydra e possono differire da ceppo a ceppo. Un ostacolo significativo alla produzione di transgenico Hydra è l&#39;ottenimento di embrioni su base regolare, perché può essere difficile in un ambiente di laboratorio per indurre Hydra per diventare sessuale. Il ceppo AEP 25, tuttavia, produce gam...

Hydra è stato utilizzato per studiare la rigenerazione, formazione di pattern, e cellule staminali per circa 250 anni 2 Hydra ha un piano corpo semplice che consiste di tre linee cellulari:. Epiteliale ectodermica, endodermico epiteliale, e interstiziale. Il corpo tubolare è formato dalla ectodermica e linee dell&#39;epitelio endodermico, ciascuno dei quali è un singolo strato di cellule. Tutte le cellule epiteliali della colonna corpo sono mitotico. Quando le cellule epiteliali vengono spostati nelle estremità 3, la testa (bocca e tentacoli) alla fine della bocca o il piede (disco basale) alla fine aborale, arrestano nella fase G2 del ciclo cellulare e cambiate destino cellulare 4. Le cellule della linea interstiziale risiedono negli interstizi tra le cellule epiteliali. Questa linea è sostenuta da cellule staminali multipotenti che si trovano nello strato epiteliale ectodermica della colonna corpo 5. Le cellule staminali interstiziali danno origine a tre cel somaticaTipi L (nervi, cellule della ghiandola, e nematocytes) e le cellule germinali 6,7. Come membro del phylum Cnidari, il gruppo sorella a tutti bilaterians, Hydra può far luce sui processi biologici fondamentali condivisi tra gli animali multicellulari. Fino a poco tempo, questi sforzi sono stati ostacolati dalla mancanza di metodi affidabili per la perturbazione della funzione del gene. Tuttavia, con lo sviluppo della metodologia transgenica 1, siamo ora in grado di sfruttare appieno Hydra per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi di base comuni ad animali pluricellulari, come ad esempio la funzione delle cellule staminali, la rigenerazione, e patterning. Linee transgeniche Hydra sono stabiliti mediante iniezione di DNA plasmidico in embrioni, che si traduce in integrazione casuale ed espressione chimerico in frequenza sostanziale di larve. Una linea con l&#39;espressione uniforme in un particolare lignaggio può essere stabilita per propagazione asessuata. La capacità di propagare clonale transgENIC Hydra righe è un vantaggio rispetto alla maggior parte dei modelli animali, che possono essere propagate solo da riproduzione sessuale. Inoltre, cellule transgeniche possono essere seguiti facilmente in vivo a causa della trasparenza dell&#39;animale e l&#39;assenza di proteine ​​fluorescenti endogene 8. Nei sette anni dalla prima linea Hydra transgeniche sono state effettuate 1, tali linee sono stati utilizzati per una varietà di applicazioni. Espressione di proteine ​​fluorescenti in diversi tipi di cellule ha permesso di monitorare il movimento delle cellule, osservare cambiamenti di forma delle cellule, e tenere traccia destini cellulari sia in condizioni di tipo selvatico e dopo perturbazione chimica 1,5,9-12. Inoltre, l&#39;espressione di proteine ​​fluorescenti differenti nelle diverse linee consente FACS isolamento di specifiche popolazioni cellulari. Questa tecnica è stata utilizzata per la sequenza di mRNA specifici di cellule staminali e le specifiche del lineage piccoli RNA 13,14. Mentre il promotore diuno dei due geni di actina Hydra è stato più utilizzato, a poche cellule di tipo promotori specifici sono stati identificati e utilizzati per guidare l&#39;espressione di GFP in transgenici Hydra 9,11,15,16. In futuro, i promotori specifici delle cellule di tipo permetteranno l&#39;osservazione e la raccolta di qualsiasi tipo di cellula specifico. Inoltre, un approccio transgenico è stato usato con successo per definire cis-agenti elementi regolatori del promotore Wnt3 17. Lo sviluppo di metodi transgenici in Hydra fornisce un valido approccio per testare la funzione dei geni dall&#39;espressione ectopica, sovraespressione, e atterramento. Gli animali transgenici sono stati fatti che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato, al fine di esaminare sia la funzione e la localizzazione cellulare 18-20. Inoltre, l&#39;espressione di forcine RNA nel 3&#39;UTR di un transgene GFP conduce atterramento di geni bersaglio 21,22. In questi approcci è necessaria GFP per identificaree monitorare il tessuto transgenico durante la creazione della linea transgenica. Tuttavia, è probabile che in alcuni casi la molecola GFP potrebbe interferire con la funzione della proteina tag. Uno studio recente dimostra che i geni Hydra possono essere organizzati in una configurazione operone, cioè, trascrizioni policistronici sono fatti, che vengono poi separati da trans-impiombato Inoltre leader e tradotto separatamente 23. Inserendo un gene codificante una proteina o una forcina RNA nella posizione a monte di un operone e un gene della proteina fluorescente nella posizione a valle, si può tracciare tessuto transgenico senza dover codificare il gene codificante la proteina o RNA hairpin. Questo metodo è stato utilizzato per esprimere un tornante RNA in una configurazione operone con DsRed2 al fine di raggiungere gene knockdown 14.

<table><tbody><tr><td>AEP Hydra Strain</td><td></td><td></td><td>E-mail: Celina Juliano a celina.juliano@yale.edu o Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>Kit Maxi ad alta velocità</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Piastre di Petri</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 x 50 mm Vetro Microscopio Stampo</td><td>Sigma</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Microiniezione</td><td>IBI Scientific</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>Vetro borosilicato con filamento</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-50-10</td><td>O.D.: 1,0 mm, I.D.: 0,50 mm, lunghezza 10 cm</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette fiammato/marrone</td><td>Strumento Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo Rosso</td><td>Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per gioiellieri, Durmont #5</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi #15</td><td>Fisher</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di ferro</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Joystick Micromanipolatore</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di transgenici hydra da embryo microiniezione

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Come membro del phylum Cnidaria, il gruppo gemello di tutti i bilateriani, Hydra può far luce sui processi biologici fondamentali condivisi tra gli animali pluricellulari. Hydra è usato come modello per lo studio della rigenerazione, della formazione di modelli e delle cellule staminali. Tuttavia, gli sforzi della ricerca sono stati ostacolati dalla mancanza di un metodo affidabile per le perturbazioni geniche per studiare la funzione molecolare. Lo sviluppo di metodi transgenici ha rivitalizzato lo studio della biologia dell'idra 1. Le idre transgeniche consentono il tracciamento di cellule vive, lo smistamento per produrre popolazioni cellulari pure per l'analisi biochimica, la manipolazione della funzione genica mediante knockdown e sovraespressione e l'analisi della funzione del promotore. Il DNA plasmidico iniettato negli embrioni in fase iniziale si integra casualmente nel genoma all'inizio dello sviluppo. Ciò si traduce in piccoli che esprimono transgeni in chiazze di tessuto in uno o più dei tre lignaggi (epiteliale ectodermico, epiteliale endodermico o interstiziale). Il tasso di successo nell'ottenere un cucciolo con tessuto transgenico è compreso tra il 10% e il 20%. La propagazione asessuata del cucciolo transgenico viene utilizzata per stabilire una linea uniformemente transgenica in un particolare lignaggio. Generare Hydra transgenico è sorprendentemente semplice e robusto, e qui descriviamo un protocollo che può essere facilmente implementato a basso costo.

Stabilire linee transgeniche Hydra Alimentare larve transgeniche ogni 2-3 giorni con Artemia nauplii. I piccoli a volte non mangiano per un giorno o due dopo la schiusa. Alcuni nuovi nascituri saranno mai mangiare, e quindi non sopravviverà. Se il cucciolo è transgenico sia nel ectodermica (Figura 1A) o tessuto epiteliale endodermico, permettere all'animale di germoglio e raccogliere le gemme che hanno il tessuto più transgenico (Figura 1B, C).</strong...

Le Hydra transgeniche stabili sono prodotte mediante microiniezione di DNA plasmidico negli embrioni seguita da integrazione genomica casuale e propagazione asessuata per stabilire una linea uniforme. Le idre transgeniche vengono utilizzate per tracciare i movimenti cellulari, sovraesprimere i geni, studiare la funzione del promotore o abbattere l'espressione genica utilizzando l'RNAi.

Generazione di transgenici Hydra Da Embryo microiniezione

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di microiniettare DNA plasmatico in embrioni di idra per produrre linee transgeniche. Ciò si ottiene preparando prima una soluzione di DNA plasmatico e caricandola in un ago per iniezione. Successivamente, la soluzione di DNA plasmatico viene iniettata in embrioni di idra tra uno e otto stadi cellulari.Quindi gli embrioni di idra vengono lasciati sviluppare e schiudere e vengono selezionati i giovani con tessuto transgenico. Il passo finale è quello di produrre una linea transgenica uniforme per gemmazione asessuata dell'animale transgenico originale. In definitiva, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per visualizzare l'espressione transgenica nell'idra.Questo metodo è stato progettato per i ricercatori che desiderano realizzare linee idroelettriche transgeniche a basso costo, consentendo così una più ampia applicazione di questa utile tecnologia, sia per gli attuali ricercatori idroelettrici, ma anche per coloro che vogliono solo iniziare a utilizzare questo modello. Le idre transgeniche sono utilizzate per studiare la dinamica dei tessuti, la funzione genica di localizzazione delle proteine mediante knockdown e sovraespressione e anche la funzione del promotore. Dopo aver preparato il DNA plasmatico secondo il protocollo di testo, preparare una piastra per iniezione posizionando prima un microscopio in vetro 75 per 50.Scivolare in una capsula di Petri da 100 x 15 millimetri ad angolo e sciogliere il 2% di agro in 50 millilitri di idra media. Lasciate raffreddare. Versatelo poi nella capsula di Petri Dopo che l'agros si sarà solidificato, togliete il vetrino e con la lametta tagliate via gli agros in eccesso fino a formare un muro.Quindi versare immediatamente hydra medium nel piatto e utilizzarlo immediatamente o conservarlo a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Per preparare la soluzione iniettabile, combinare tre microlitri di 2,5 milligrammi per millilitro di soluzione di DNA plasmatico con due microlitri di soluzione di rosso fenolo al 10%. Agitare brevemente la soluzione e poi farla girare per 10 minuti alla massima velocità in una microcentrifuga per rimuovere eventuali particelle che potrebbero ostruire l'ago al microscopio da dissezione.Usa una pinza per agganciare l'ago a pochi millimetri dalla punta per creare una piccola apertura. Orientare la piastra di Petri contenente l'ago in modo che l'ago sia in posizione verticale con la punta rivolta verso il basso. Quindi pipettare circa 0,5 microlitri di soluzione iniettabile nell'estremità posteriore dell'ago.Per preparare gli embrioni per l'iniezione, inizia scansionando un'idra, una coltura di ceppo EP per i polipi che producono ovuli. Raccogli questi polipi e trasferiscili in una piastra di coltura separata. Osserva questi polipi ogni poche ore durante il giorno per monitorare l'andamento della formazione delle uova.Quando le uova sfondano l'ectoderma e si siedono su un anello di cellule dermiche retratte, sono pronte per l'iniezione, posizionare i polipi che hanno uova pronte per l'iniezione in un piatto con diverse idre che hanno testicoli per almeno un'ora prima dell'iniezione per consentire la fecondazione se le femmine si trovano in una colonia EP con uova completamente formate o embrioni in stadio da uno a otto cellule. Raccogli anche questi per l'iniezione prima dell'iniezione. Usa un bisturi con una lama numero 15 per rimuovere la maggior parte del tessuto parentale sopra e sotto gli embrioni che hanno iniziato a sfaldarsi, lasciandoli con solo un piccolo pezzo della colonna del corpo del genitore attaccato.Conserva il tessuto sezionato nel terreno Hydra in quanto si rigenererà e assicurerà che le femmine rimangano nella colonia di idra. Utilizzare una pipetta da pascolo per trasferire gli embrioni scissisi in una piastra per iniezione, disponendoli parallelamente alla parete dell'agros. Per preparare il micro iniettore montato su un supporto magnetico che poggia su una piastra di ferro.Montare il supporto per l'iniezione, che fa parte del micro iniettore che tiene l'ago su un manipolatore microm a joystick. Utilizzando un supporto magnetico, montare il manipolatore a joystick sulla piastra di ferro. Quindi posizionare l'intera configurazione sul lato destro di un microscopio da dissezione e posizionare il supporto per iniezione in modo che sia visibile nel campo di osservazione.Posizionare la capsula per iniezione con gli embrioni sotto il microscopio da dissezione orientato in modo che la parete verticale della depressione agroscopica sia rivolta a sinistra. Inserire l'ago nel supporto per iniezione e abbassare la punta dell'ago nel mezzo idra nel piatto. Quindi, ruotare lentamente la manopola della siringa in senso orario fino a quando l'olio minerale riempie la parte superiore dell'ago e si osserva un flusso costante di soluzione iniettabile che esce dall'ago nel mezzo dell'idra.Se il flusso è troppo forte, abbassare la pressione ruotando la manopola in senso antiorario. Centrare un embrione nel campo visivo e spostare l'ago in modo che tocchi l'embrione. Quindi utilizzare il manipolatore microm per perforare l'embrione con l'ago e lasciare che la soluzione per iniezione fluisca nell'embrione per uno o due secondi prima di rimuovere rapidamente l'ago.Se l'embrione ha più di una cellula, inietta ogni cellula individualmente. Continuare fino a quando tutti gli embrioni sono stati iniettati. Una volta che tutti gli embrioni sono stati iniettati, trasferiscili in un piatto con alcuni Hydra, un polipi EP che hanno i testicoli e incubali a 18 gradi Celsius mentre continuano a subire l'embriogenesi.Quando gli embrioni raggiungono lo stadio di cuticola, spostare ogni embrione in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti riempita con terreno di idra e incubare per due settimane al buio a 18 gradi Celsius. Quindi, sotto un microscopio da dissezione, controlla che ogni embrione non si stacchi dal piccolo pezzo di tessuto parentale e che si rigeneri quel tessuto. Se presente, rimuovilo immediatamente in modo che non venga scambiato per un nuovo cucciolo.Dopo aver controllato ogni embrione, sposta il piatto sotto la luce di un acquario a temperatura ambiente. Controlla le piastre ogni giorno e raccogli i piccoli. I nuovi piccoli saranno di colore bianco perché non hanno ancora mangiato.Osservali al microscopio a fluorescenza per l'espressione transgenica. Usa art napoli per nutrire i piccoli transgenici ogni due o tre giorni. Quando i piccoli che sono transgenici nel tessuto epiteliale elettrodermico o endodermico producono gemme, vengono valutati per l'espressione transgenica.Qui è mostrato un cucciolo con espressione chimerica di un rosso Ds, due transgeni sotto il controllo di un promotore dell'actina e una chiazza di cellule epiteliali ectodermiche. La gemmazione continua da parte dell'animale può eventualmente produrre una linea con espressione uniforme del transgene sia nella linea epiteliale elettrodermica che in quella endodermica. Come si vede qui, il cucciolo originale sta ora producendo due nuovi germogli.La gemma, etichettata con un asterisco, non ha tessuto transgenico ed è stata utilizzata come animale fondatore per una linea di controllo geneticamente identica alla linea transgenica tranne che per la presenza del transgene. Questo animale è il primo germoglio con tessuto transgenico prodotto dal pulcino originale. Attraverso questi esperimenti che utilizzano transgeni che non hanno alcun impatto sulla funzione biologica, sono state stabilite linee cellulari epiteliali uniformi da circa il 30% delle idre che si schiudono con il tessuto transgenico epiteliale.Una linea elettrodermica uniforme, come si vede qui, si stabilisce dal 33 al 50% in meno rispetto a una linea endodermica. Quindi, dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come realizzare linee idro transgeniche, che si aggiungeranno al repertorio di studi funzionali che puoi fare con questo modello.

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