Name: Generazione di transgenici Hydra Da Embryo microiniezione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Impara a generare linee transgeniche stabili di Hydra mediante microiniezione di DNA plasmidico in embrioni. Questo metodo consente di studiare funzioni geniche e dinamiche cellulari in un organismo modello rigenerativo.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un G. Harold e Leila Y. Mathers Premio per HL e una sovvenzione NIH (R24 GM080527) per RESCEJ stato un NRSA Postdoctoral Fellow (NIH F32GM9037222) ed è attualmente supportato da un Mentored Research Scientist Development Award dal National Institute on Aging (K01AG04435). Vorremmo ringraziare i revisori per utili commenti.

1 Preparazione di DNA plasmidico, aghi, e piatti iniezione <ol><li> Preparare il DNA plasmidico utilizzando un kit Maxi alta velocità o Midi e concentrare il DNA a 2,5 mg / ml mediante precipitazione in etanolo. Il pellet di DNA deve essere sciolto in acqua deionizzata priva di nucleasi. Conservare il DNA in 10-20 microlitri aliquote a -20 ° C. (Vedi Tabella supplementare 1 per un elenco di vettori disponibili) </li><li> Fare un piatto di iniezione utilizzando agarosio per costruire un trogolo per lo svolgimento di embrioni in una capsula di Petri di 100 x 15 mm. <ol><li> Posizionare un vetrino da microscopio 75 x 50 vetro in un piatto 100 x 15 mm Petri in un angolo. Versare circa 50 ml di 2% agarosio sciolto in Hydra medio 24 nella piastra di Petri. In alternativa, versare l&#39;agarosio nel piatto prima e galleggiare un &quot;Microiniezione pesce Mold&quot; in alto. </li><li> Dopo l&#39;agarosio si è solidificato, rimuovere il vetrino o lo stampo. Se è stato utilizzato un vetrino, tagliare via l&#39;eccesso di agarosio con un bla rasoiode per formare un muro. Versare Hydra media nel piatto e utilizzare immediatamente o conservarlo a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. Nota: i piatti iniezione possono essere riutilizzati se conservato a 4 ° C tra usi. </li></ol></li><li> Tirare aghi da capillari in vetro borosilicato con un filamento sul estrattore micropipetta con le seguenti condizioni: scaldare 525, tirare 75, velocità 100, tempo 50. Conservare gli aghi di loro premendo in una stretta striscia di argilla in una capsula di Petri tale che siano tenuto parallelo al fondo del piatto. </li><li> Per preparare la soluzione iniettabile, combinare 3 ml di / soluzione di DNA plasmidico ml 2,5 mg con 2 ml di 10% di rosso fenolo. Vortex la soluzione brevemente e poi girare per 10 min alla massima velocità in una microcentrifuga per rimuovere eventuali particelle che potrebbero intasare l&#39;ago. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, agganciare l&#39;ago a pochi millimetri dalla punta con una pinza per creare una piccola apertura. Nota: Vi è una certa flessibilità nella dimensione appropriata del apertozione perché la pressione può essere regolata nel passaggio 3.3 per accogliere questa variazione. </li><li> Porre la capsula di Petri in modo che sta tenendo l&#39;ago in posizione verticale con la punta verso il basso. Caricare l&#39;ago con circa 0,5 ml di soluzione iniettabile pipettando liquido nell&#39;estremità posteriore dell&#39;ago. Lasciare azione capillare per tirare la soluzione nella punta dell&#39;ago. </li></ol> 2 Preparazione di embrioni per iniezione <ol><li> Su base giornaliera eseguire la scansione della cultura ceppo Hydra AEP per polipi producono uova. Raccogliere questi polipi e metterli da parte in un piatto di cultura separata. Osservare questi polipi ogni poche ore durante il giorno per monitorare l&#39;andamento della formazione dell&#39;uovo. Quando le uova si rompono attraverso l&#39;ectoderma e si siedono su un anello di cellule ectodermiche retratti sono pronti per l&#39;iniezione 25. Posizionare questi polipi in un piatto con diversi Hydra che hanno testicoli per almeno 1 ora prima dell&#39;iniezione per consentire la fecondazione. Hydra &lt;/ Em&gt; maschi rilascerà spermatozoi senza alcuna manipolazione speciale. </li><li> Se le femmine si trovano nella colonia AEP con uova completamente formate, che sono circa 400 micron di diametro 25, o da 1 a 8 celle embrioni stadio, raccogliere anche questi per l&#39;iniezione. Iniettare immediatamente gli embrioni che hanno iniziato scissione. Nota: Non è possibile capire la differenza tra le uova completamente formate e zigoti unicellulari, quindi questi devono essere incubate con i maschi prima dell&#39;iniezione. </li><li> Prima dell&#39;iniezione, rimuovere la maggior parte del tessuto parentale sopra e sotto l&#39;embrione utilizzando un bisturi con lama # 15. Lasciare solo l&#39;embrione con un piccolo pezzo di colonna corpo attaccato, da utilizzare per manipolare l&#39;embrione con una pinza se necessario. Nota: Il tessuto che viene sezionato dalla embrione si rigenera e dovrebbe essere salvato per garantire che le femmine rimangono nella colonia di Hydra. </li><li> Usando una pipetta Pasteur, spostare embrioni al piatto di iniezione, disponendole parallele alla parete dellaattraverso agarosio. </li></ol> 3. Microiniezione di DNA plasmidi <ol><li> Montare il microinjector su un supporto magnetico che si siede su una lastra di ferro. Montare il supporto di iniezione, che è la parte del microinjector che contiene l&#39;ago, su un micromanipolatore joystick. Montare il manipolatore joystick per la piastra di ferro, con un supporto magnetico. Posizionare questo intero set-up sul lato destro di un microscopio da dissezione e posizionare il supporto di iniezione in modo che sia visibile nel campo di osservazione. </li><li> Porre la capsula iniezione con embrioni al microscopio da dissezione, orientato in modo tale che la parete verticale della vasca agarosio è a sinistra. Inserire l&#39;ago nel supporto di iniezione e abbassare la punta dell&#39;ago nel mezzo Hydra nel piatto. </li><li> Ruotare lentamente la manopola della siringa in senso orario fino olio minerale riempie la parte superiore dell&#39;ago e un flusso continuo di soluzione iniettabile si osserva uscire l&#39;ago nel Hydrun mezzo. Se il flusso è troppo forte, abbassare la pressione ruotando la manopola in senso antiorario. Pratica questo passo per ottenere ordinariamente una pressione adeguata, che dipende dalle dimensioni dell&#39;apertura dell&#39;ago (cioè, come l&#39;ago è stato fermato nella fase 1.5). Nota: Se il flusso è troppo forte, l&#39;embrione non sopravviverà l&#39;iniezione. </li><li> Durante la visualizzazione attraverso il microscopio da dissezione, spostare il piatto iniezione, in modo che il primo embrione è al centro del campo. Spostare l&#39;ago in modo che sia a contatto con quella dell&#39;embrione. Utilizzare il micromanipolatore per perforare l&#39;embrione con l&#39;ago. Nota: La parete verticale della vasca agarosio manterrà l&#39;embrione di essere messo da parte dal ago. </li><li> Lasciare che la soluzione iniettabile di fluire in embrione 1 o 2 secondi e poi rimuovere l&#39;ago rapidamente. Se l&#39;embrione ha più di una cella, iniettare ogni cella singolarmente. Usare pinze per riorientare l&#39;embrione per allineare la cella successiva con la punta dell&#39;ago. </li><li> Dopo il primo Embryo viene iniettato, spostare il piatto in modo che la prossima embrione è nella posizione di iniezione e ripetere la procedura; continuare fino a quando sono state iniettate tutti gli embrioni. </li></ol> 4. coltura e cova di embrioni <ol><li> Spostare tutti gli embrioni iniettati in un piatto con un paio di Hydra che hanno testicoli (questo è quello di garantire che tutti gli embrioni sono fecondati). Incubare gli embrioni in un 18 ° C incubatore mentre continuano embriogenesi. </li><li> Una volta raggiunta la fase della cuticola, spostare ogni embrione iniettato ad un pozzo individuale di una piastra da 24 pozzetti riempiti con Hydra medie. </li><li> Incubare gli embrioni iniettati per 2 settimane al buio a 18 ° C. </li><li> Dopo il periodo di incubazione 2 settimane, controllare ogni embrione iniettato sotto il microscopio da dissezione. Nota casi in cui l&#39;embrione cuticola stadio ha staccati dal piccolo pezzo di tessuto parentale e il tessuto dei genitori ha rigenerati. Rimuovere questo polipo rigenerato immediatamente in modo che non è mistaken per un nuovo cucciolo. </li><li> Spostare il piatto di embrioni iniettati sotto una luce acquario a temperatura ambiente. Controllare le piastre ogni giorno e raccogliere larve. Le nuove larve saranno bianco perché il tipico colore rosa di polipi Hydra nasce dalla Artemia di cui si nutrono. </li><li> Osservare i piccoli sotto un microscopio a fluorescenza per rilevare l&#39;espressione del transgene. </li></ol>

<ol><li>Wittlieb, J., Khalturin, K., Lohmann, J. U., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+Hydra+allow+in+vivo+tracking+of+individual+stem+cells+during+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transgenic Hydra allow in vivo tracking of individual stem cells during morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 6208-6211 (2006).</li>
<li>Glauber, K. M., Dana, C. E., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydra.</a> Curr Biol. 20, 964-965 (2010).</li>
<li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., David, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+epithelial+cell+cycling+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern of epithelial cell cycling in hydra.</a> Dev Biol. 148, 602-611 (1991).</li>
<li>Dubel, S., Hoffmeister, S. A., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+pathways+of+ectodermal+epithelial+cells+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Differentiation pathways of ectodermal epithelial cells in hydra.</a> Differentiation. 35, 181-189 (1987).</li>
<li>Khalturin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+stem+cells+in+Hydra+reveal+an+early+evolutionary+origin+for+key+elements+controlling+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenic stem cells in Hydra reveal an early evolutionary origin for key elements controlling self-renewal and differentiation.</a> Dev Biol. 309, 32-44 (2007).</li>
<li>Bosch, T., David, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+of+Hydra+magnipapillata+can+differentiate+into+somatic+cells+and+germ+line+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cells of Hydra magnipapillata can differentiate into somatic cells and germ line cells.</a> Dev Biol. 121, 182-191 (1987).</li>
<li>David, C. N., Murphy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+interstitial+stem+cells+in+hydra+by+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of interstitial stem cells in hydra by cloning.</a> Dev Biol. 58, 372-383 (1977).</li>
<li>Chapman, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+genome+of+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The dynamic genome of Hydra.</a> Nature. 464, 592-596 (2010).</li>
<li>Boehm, A. M., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+multipotent+interstitial+stem+cells+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology+%28Jena%29%22%5BJournal%5D)">Migration of multipotent interstitial stem cells in Hydra.</a> Zoology (Jena). 115, 275-282 (2012).</li>
<li>Glauber, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+molecule+screen+identifies+a+novel+compound+that+induces+a+homeotic+transformation+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A small molecule screen identifies a novel compound that induces a homeotic transformation in Hydra.</a> Development. 140, 4788-4796 (2013).</li>
<li>Siebert, S., Anton-Erxleben, F., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type+complexity+in+the+basal+metazoan+Hydra+is+maintained+by+both+stem+cell+based+mechanisms+and+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell type complexity in the basal metazoan Hydra is maintained by both stem cell based mechanisms and transdifferentiation.</a> Dev Biol. 313, 13-24 (2008).</li>
<li>Anton-Erxleben, F., Thomas, A., Wittlieb, J., Fraune, S., Bosch, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+epithelial+cell+shape+in+response+to+upstream+signals%3A+a+whole-organism+study+using+transgenic+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Zoology+%28Jena%29%22%5BJournal%5D)">Plasticity of epithelial cell shape in response to upstream signals: a whole-organism study using transgenic Hydra.</a> Zoology (Jena). 112, 185-194 (2009).</li>
<li>Hemmrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+the+three+stem+cell+lineages+in+Hydra+and+the+emergence+of+stem+cell+function+at+the+base+of+multicellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of the three stem cell lineages in Hydra and the emergence of stem cell function at the base of multicellularity.</a> Mol Biol Evol. , (2012).</li>
<li>Juliano, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIWI+proteins+and+PIWI-interacting+RNAs+function+in+Hydra+somatic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PIWI proteins and PIWI-interacting RNAs function in Hydra somatic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 337-342 (2014).</li>
<li>Nishimiya-Fujisawa, C., Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+and+sex+determination+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells and sex determination in Hydra.</a> Int J Dev Biol. 56, 499-508 (2012).</li>
<li>Milde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+taxonomically+restricted+genes+in+a+phylum-restricted+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of taxonomically restricted genes in a phylum-restricted cell type.</a> Genome Biol. 10, 8(2009).</li>
<li>Nakamura, Y., Tsiairis, C. D., Ozbek, S., Holstein, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulatory+and+repressive+inputs+localize+Hydra+Wnt3+to+the+head+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autoregulatory and repressive inputs localize Hydra Wnt3 to the head organizer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9137-9142 (2011).</li>
<li>Gee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-catenin+plays+a+central+role+in+setting+up+the+head+organizer+in+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">beta-catenin plays a central role in setting up the head organizer in hydra.</a> Dev Biol. 340, 116-124 (2010).</li>
<li>Fraune, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+an+early+branching+metazoan%2C+bacterial+colonization+of+the+embryo+is+controlled+by+maternal+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In an early branching metazoan, bacterial colonization of the embryo is controlled by maternal antimicrobial peptides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 18067-18072 (2010).</li>
<li>Bridge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+and+stress+responses+in+the+cnidarian+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FoxO and stress responses in the cnidarian Hydra vulgaris.</a> PLoS One. 5, e11686(2010).</li>
<li>Boehm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+is+a+critical+regulator+of+stem+cell+maintenance+in+immortal+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FoxO is a critical regulator of stem cell maintenance in immortal Hydra.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19697-19702 (2012).</li>
<li>Franzenburg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyD88-deficient+Hydra+reveal+an+ancient+function+of+TLR+signaling+in+sensing+bacterial+colonizers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyD88-deficient Hydra reveal an ancient function of TLR signaling in sensing bacterial colonizers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 19374-19379 (2012).</li>
<li>Dana, C. E., Glauber, K. M., Chan, T. A., Bridge, D. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+a+horizontally+transferred+gene+into+an+operon+during+cnidarian+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Incorporation of a horizontally transferred gene into an operon during cnidarian evolution.</a> PLoS One. 7, e31643(2012).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 4 29-34 (1983).</li>
<li>Miller, M. A., Technau, U., Smith, K. M., Steele, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+development+in+Hydra+involves+selection+from+competent+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Oocyte development in Hydra involves selection from competent precursor cells.</a> Dev Biol. 224, 326-338 (2000).</li>
<li>Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Hydra%3A+Research+Methods%22">Hydra: Research Methods</a>. Lenhoff, H. M. , Plenum Press. Ch. 8 53-62 (1983).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

Hydra riproduce asessualmente di routine, ma richiede stimoli ambientali per iniziare la produzione di gameti. Questi stimoli non sono ben definiti, per la maggior parte delle specie Hydra e possono differire da ceppo a ceppo. Un ostacolo significativo alla produzione di transgenico Hydra è l&#39;ottenimento di embrioni su base regolare, perché può essere difficile in un ambiente di laboratorio per indurre Hydra per diventare sessuale. Il ceppo AEP 25, tuttavia, produce gam...

Hydra è stato utilizzato per studiare la rigenerazione, formazione di pattern, e cellule staminali per circa 250 anni 2 Hydra ha un piano corpo semplice che consiste di tre linee cellulari:. Epiteliale ectodermica, endodermico epiteliale, e interstiziale. Il corpo tubolare è formato dalla ectodermica e linee dell&#39;epitelio endodermico, ciascuno dei quali è un singolo strato di cellule. Tutte le cellule epiteliali della colonna corpo sono mitotico. Quando le cellule epiteliali vengono spostati nelle estremità 3, la testa (bocca e tentacoli) alla fine della bocca o il piede (disco basale) alla fine aborale, arrestano nella fase G2 del ciclo cellulare e cambiate destino cellulare 4. Le cellule della linea interstiziale risiedono negli interstizi tra le cellule epiteliali. Questa linea è sostenuta da cellule staminali multipotenti che si trovano nello strato epiteliale ectodermica della colonna corpo 5. Le cellule staminali interstiziali danno origine a tre cel somaticaTipi L (nervi, cellule della ghiandola, e nematocytes) e le cellule germinali 6,7. Come membro del phylum Cnidari, il gruppo sorella a tutti bilaterians, Hydra può far luce sui processi biologici fondamentali condivisi tra gli animali multicellulari. Fino a poco tempo, questi sforzi sono stati ostacolati dalla mancanza di metodi affidabili per la perturbazione della funzione del gene. Tuttavia, con lo sviluppo della metodologia transgenica 1, siamo ora in grado di sfruttare appieno Hydra per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi di base comuni ad animali pluricellulari, come ad esempio la funzione delle cellule staminali, la rigenerazione, e patterning. Linee transgeniche Hydra sono stabiliti mediante iniezione di DNA plasmidico in embrioni, che si traduce in integrazione casuale ed espressione chimerico in frequenza sostanziale di larve. Una linea con l&#39;espressione uniforme in un particolare lignaggio può essere stabilita per propagazione asessuata. La capacità di propagare clonale transgENIC Hydra righe è un vantaggio rispetto alla maggior parte dei modelli animali, che possono essere propagate solo da riproduzione sessuale. Inoltre, cellule transgeniche possono essere seguiti facilmente in vivo a causa della trasparenza dell&#39;animale e l&#39;assenza di proteine ​​fluorescenti endogene 8. Nei sette anni dalla prima linea Hydra transgeniche sono state effettuate 1, tali linee sono stati utilizzati per una varietà di applicazioni. Espressione di proteine ​​fluorescenti in diversi tipi di cellule ha permesso di monitorare il movimento delle cellule, osservare cambiamenti di forma delle cellule, e tenere traccia destini cellulari sia in condizioni di tipo selvatico e dopo perturbazione chimica 1,5,9-12. Inoltre, l&#39;espressione di proteine ​​fluorescenti differenti nelle diverse linee consente FACS isolamento di specifiche popolazioni cellulari. Questa tecnica è stata utilizzata per la sequenza di mRNA specifici di cellule staminali e le specifiche del lineage piccoli RNA 13,14. Mentre il promotore diuno dei due geni di actina Hydra è stato più utilizzato, a poche cellule di tipo promotori specifici sono stati identificati e utilizzati per guidare l&#39;espressione di GFP in transgenici Hydra 9,11,15,16. In futuro, i promotori specifici delle cellule di tipo permetteranno l&#39;osservazione e la raccolta di qualsiasi tipo di cellula specifico. Inoltre, un approccio transgenico è stato usato con successo per definire cis-agenti elementi regolatori del promotore Wnt3 17. Lo sviluppo di metodi transgenici in Hydra fornisce un valido approccio per testare la funzione dei geni dall&#39;espressione ectopica, sovraespressione, e atterramento. Gli animali transgenici sono stati fatti che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato, al fine di esaminare sia la funzione e la localizzazione cellulare 18-20. Inoltre, l&#39;espressione di forcine RNA nel 3&#39;UTR di un transgene GFP conduce atterramento di geni bersaglio 21,22. In questi approcci è necessaria GFP per identificaree monitorare il tessuto transgenico durante la creazione della linea transgenica. Tuttavia, è probabile che in alcuni casi la molecola GFP potrebbe interferire con la funzione della proteina tag. Uno studio recente dimostra che i geni Hydra possono essere organizzati in una configurazione operone, cioè, trascrizioni policistronici sono fatti, che vengono poi separati da trans-impiombato Inoltre leader e tradotto separatamente 23. Inserendo un gene codificante una proteina o una forcina RNA nella posizione a monte di un operone e un gene della proteina fluorescente nella posizione a valle, si può tracciare tessuto transgenico senza dover codificare il gene codificante la proteina o RNA hairpin. Questo metodo è stato utilizzato per esprimere un tornante RNA in una configurazione operone con DsRed2 al fine di raggiungere gene knockdown 14.

<table><tbody><tr><td>AEP Hydra Strain</td><td></td><td></td><td>E-mail: Celina Juliano a celina.juliano@yale.edu o Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp</td></tr><tr><td>Kit Maxi ad alta velocità</td><td>Qiagen</td><td>12662</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm Piastre di Petri</td><td>BD Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>75 x 50 mm Vetro Microscopio Stampo</td><td>Sigma</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Microiniezione</td><td>IBI Scientific</td><td>FM-600</td><td></td></tr><tr><td>Vetro borosilicato con filamento</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-50-10</td><td>O.D.: 1,0 mm, I.D.: 0,50 mm, lunghezza 10 cm</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette fiammato/marrone</td><td>Strumento Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Fenolo Rosso</td><td>Sigma</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per gioiellieri, Durmont #5</td><td>Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi #15</td><td>Fisher</td><td>50-822-421</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Microiniettore</td><td>Narishige</td><td>IM-9B</td><td></td></tr><tr><td>Supporto magnetico</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di ferro</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Joystick Micromanipolatore</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di transgenici hydra da embryo microiniezione

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Come membro del phylum Cnidaria, il gruppo gemello di tutti i bilateriani, Hydra può far luce sui processi biologici fondamentali condivisi tra gli animali pluricellulari. Hydra è usato come modello per lo studio della rigenerazione, della formazione di modelli e delle cellule staminali. Tuttavia, gli sforzi della ricerca sono stati ostacolati dalla mancanza di un metodo affidabile per le perturbazioni geniche per studiare la funzione molecolare. Lo sviluppo di metodi transgenici ha rivitalizzato lo studio della biologia dell'idra 1. Le idre transgeniche consentono il tracciamento di cellule vive, lo smistamento per produrre popolazioni cellulari pure per l'analisi biochimica, la manipolazione della funzione genica mediante knockdown e sovraespressione e l'analisi della funzione del promotore. Il DNA plasmidico iniettato negli embrioni in fase iniziale si integra casualmente nel genoma all'inizio dello sviluppo. Ciò si traduce in piccoli che esprimono transgeni in chiazze di tessuto in uno o più dei tre lignaggi (epiteliale ectodermico, epiteliale endodermico o interstiziale). Il tasso di successo nell'ottenere un cucciolo con tessuto transgenico è compreso tra il 10% e il 20%. La propagazione asessuata del cucciolo transgenico viene utilizzata per stabilire una linea uniformemente transgenica in un particolare lignaggio. Generare Hydra transgenico è sorprendentemente semplice e robusto, e qui descriviamo un protocollo che può essere facilmente implementato a basso costo.

Stabilire linee transgeniche Hydra Alimentare larve transgeniche ogni 2-3 giorni con Artemia nauplii. I piccoli a volte non mangiano per un giorno o due dopo la schiusa. Alcuni nuovi nascituri saranno mai mangiare, e quindi non sopravviverà. Se il cucciolo è transgenico sia nel ectodermica (Figura 1A) o tessuto epiteliale endodermico, permettere all'animale di germoglio e raccogliere le gemme che hanno il tessuto più transgenico (Figura 1B, C).</strong...

Le Hydra transgeniche stabili sono prodotte mediante microiniezione di DNA plasmidico negli embrioni seguita da integrazione genomica casuale e propagazione asessuata per stabilire una linea uniforme. Le idre transgeniche vengono utilizzate per tracciare i movimenti cellulari, sovraesprimere i geni, studiare la funzione del promotore o abbattere l'espressione genica utilizzando l'RNAi.

Generazione di transgenici Hydra Da Embryo microiniezione

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di microiniettare DNA plasmatico in embrioni di idra per produrre linee transgeniche. Ciò si ottiene preparando prima una soluzione di DNA plasmatico e caricandola in un ago per iniezione. Successivamente, la soluzione di DNA plasmatico viene iniettata in embrioni di idra tra uno e otto stadi cellulari.Quindi gli embrioni di idra vengono lasciati sviluppare e schiudere e vengono selezionati i giovani con tessuto transgenico. Il passo finale è quello di produrre una linea transgenica uniforme per gemmazione asessuata dell'animale transgenico originale. In definitiva, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per visualizzare l'espressione transgenica nell'idra.Questo metodo è stato progettato per i ricercatori che desiderano realizzare linee idroelettriche transgeniche a basso costo, consentendo così una più ampia applicazione di questa utile tecnologia, sia per gli attuali ricercatori idroelettrici, ma anche per coloro che vogliono solo iniziare a utilizzare questo modello. Le idre transgeniche sono utilizzate per studiare la dinamica dei tessuti, la funzione genica di localizzazione delle proteine mediante knockdown e sovraesp

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In questo video, Nijole Jasinskiene dimostra la metodologia utilizzata per generare transgenici zanzare Aedes aegypti, che sono vettori per la febbre dengue. Le tecniche per la corretta preparazione di aghi microiniezione, disidratanti embrioni, e l'esecuzione di microiniezione sono dimostrati.

Microiniezione di A. aegypti embrioni per ottenere zanzare transgeniche

Espressione ectopica è una tecnica per chiarire il ruolo microRNA nello sviluppo del cervello. Tuttavia, il targeting aree specifiche utilizzando in elettroporazione ovo è impegnativo. Qui vi mostriamo un modo efficiente alle regioni mesencefalo ventrale e dorsale in modo selettivo l'elettroporazione.

In Expression Ovo di MicroRNA in Ventrale Chick Mesencefalo

Studiando i primi eventi di progressione delle cellule preneoplastiche e interazione innata cellule immunitarie è fondamentale per comprendere e curare il cancro. Qui si descrive un metodo per indurre condizionale trasformazioni cellule epiteliali e la successiva di immagini dal vivo di interazione innata cellule immunitarie con HRAS G12V esprimono le cellule della pelle in larve di zebrafish.

Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Live tracking dei singoli progenitori retinici WT in background genetici distinti consente la valutazione del contributo delle cellule di segnalazione non autonomo durante la neurogenesi. Qui, una combinazione di knockdown gene, generazione chimera tramite trasferimento di embrioni in time-lapse imaging confocale vivo è stata utilizzata per questo scopo.

Imaging in vivo del transgenico espressione genica nei singoli retinica Progenitori in embrioni di zebrafish Chimerico da Cell studio Influenze non autonomo

Microiniezione di embrioni Nasonia vitripennis è un metodo essenziale per la generazione di modifiche del genoma ereditabile. Una procedura dettagliata per microiniezione e il trapianto di embrioni Nasonia vitripennis , che agevolerà notevolmente la manipolazione del genoma futuri in questo organismo è descritto qui.

Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

Utilizzando un Cas9 preassemblati complesso ribonucleoproteico (RNP) è un metodo potente per l'editing genomico precisa, efficiente. Qui, si evidenzia sua utilità in una vasta gamma delle cellule e degli organismi, tra cui cellule umane primarie e classico ed emergenti organismi modello.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Qui presentiamo protocolli per la raccolta e microinjecting mais precellular embrioni di Diabrotica allo scopo di eseguire dosaggi funzionali-genomica come trasformazione di germline ed editing CRISPR/Cas9-genomico.

Microiniezione di Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embrioni per la trasformazione di Germline o CRISPR/Cas9 Editing genomico

Questo protocollo descrive le procedure di microiniezione per gli embrioni di Culex quinquefasciatus ottimizzate per funzionare con gli strumenti di editing genetico CRISPR/Cas9. Questa tecnica può generare in modo efficiente mutazioni germinali site-specific, ereditabili, che possono essere utilizzate per costruire tecnologie genetiche in questo vettore di malattia poco studiato.

Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus

Molte caratteristiche dell'eusocialità degli insetti si basano sulla comunicazione all'interno della colonia e sulla divisione del lavoro. La manipolazione genetica dei geni regolatori chiave negli embrioni di formiche tramite microiniezione e mutagenesi mediata da CRISPR fornisce informazioni sulla natura del comportamento altruistico negli insetti eusociali.

Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos

In questo protocollo, descriviamo come iniettare lentivirus nella cavità amniotica del topo a E7.5, portando a una trasduzione uniforme dell'intera piastra neurale, con effetti dannosi minimi sulla sopravvivenza o sullo sviluppo embrionale.

Targeting della placca neurale murina mediante nano-iniezione in utero (NEPTUNE) al giorno embrionale 7.5

Questo articolo prende come esempio la transgenesi mediata dall'integrasi phiC31 in Drosophila e presenta un protocollo ottimizzato per la microiniezione di embrioni, un passaggio cruciale per la creazione di mosche transgeniche.

Microiniezione di embrioni per la transgenesi in Drosophila

Impara a generare linee transgeniche stabili di Hydra mediante microiniezione di DNA plasmidico in embrioni. Questo metodo consente di studiare funzioni geniche e dinamiche cellulari in un organismo modello rigenerativo.

Generazione di transgenici Hydra Da Embryo microiniezione

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