High-throughput Titolazione della luciferasi che esprimono ricombinanti virus

L'obiettivo generale del seguente esperimento è stimare i titoli virali di un virus marcato con luciferasi utilizzando un metodo di quantificazione ad alto rendimento. Ciò si ottiene trasferendo il surnatante dei campioni da titolare, nonché una curva standard virale su una linea cellulare permissiva per consentire l'espressione della luciferasi. In una seconda fase, RESA zurin può essere aggiunto ai campioni originali, che verranno utilizzati per valutare la vitalità cellulare.

Successivamente, dopo un adeguato tempo di incubazione, il luciferino viene aggiunto alle cellule per quantificare mediante luminescenza. I risultati mostrano la quantità di virus nel campione in base all'espressione della luciferasi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il tittering della placca, è che un gran numero di campioni può essere elaborato rapidamente e simultaneamente.

Questo metodo può essere esteso anche ai virus che esprimono luciferasi non clack. Poiché non dipende dalla formazione della placca, una lettura della citotossicità cellulare può essere facilmente incorporata nel flusso di lavoro e può essere utile nel contesto di uno screening farmacologico. A dimostrare la procedura saranno Vanessa Ramia e Colin, tre studenti laureati del mio laboratorio, per prima cosa eseguono infezioni utilizzando VSP Delta 51, che esprime la luciferasi Firefly in 96.

Ebbene, i surnatanti delle piastre per coltura tissutale di queste piastre saranno titolati dopo un adeguato tempo di incubazione 24 ore prima della titolazione. Preparare una sospensione di cellule Vero a una concentrazione di 2,5 volte 10 al quinto di cellule per millilitro in DMEM contenente il 10% di FBS 30 millimolari e l'1% di penicillina streptomicina C, 2,5 volte 10 al quarto di cellule in 96. Piastre a fondo piatto ben bianche e solide utilizzando un erogatore di micropiastre per preparare la sospensione cellulare, pulire una cassetta dosatrice di micropiastre sciacquando il tubo con 50 millilitri di acqua sterile.

Quindi riempire le linee del dispenser per micropiastre con la sospensione cellulare, lasciando fluire cinque millilitri della sospensione cellulare. Selezionare un programma che eroghi 100 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con pareti bianche e ripetere se necessario per le piastre aggiuntive. Semina anche alcuni pozzetti in una piastra di fondo bianca trasparente a 96 pozzetti per verificare la salute e la densità delle cellule.

Al termine, sciacquare nuovamente le celle nel contenitore originale. Pulire la cassetta facendo scorrere 50 millilitri di etanolo al 70%, seguiti da 50 millilitri di acqua sterile calda attraverso il tubo. Successivamente, incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica.

Preparare una curva standard di VSV Delta 51 in DMEM libero dal siero in modo tale che la concentrazione finale di unità di platforming per millilitro dopo il trasferimento sulle cellule Vero sia la seguente. Preparare 50 microlitri di ogni concentrazione per piastra di celle Vero, più un ulteriore 10%La curva standard può essere trasferita in una piastra a 96 pozzetti. Quindi, controllare le cellule Vero piastrate nella piastra a 96 pozzetti a fondo chiaro al microscopio ottico per confermare che i monostrati siano almeno al 95% di trasferimento trans confluente.

25 microlitri di surnatante del campione sulle cellule Vero posizionate nelle piastre a parete bianca utilizzando un pipettatore multicanale a 12 canali a 25 microlitri di ogni diluizione della curva standard alle cellule Vero nelle due colonne designate. Centrifugare le piastre per cinque minuti a 430 g a temperatura ambiente. Quindi incubare le piastre per cinque ore a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica.

A questo punto, aggiungere zurin in una quantità pari al 10% del volume in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti di campioni contenenti virus e cellule. Dopo due-quattro ore, leggere e registrare il segnale con un lettore di piastre a fluorescenza utilizzando da 530 a 560 per l'eccitazione e 590 per il rapporto di emissione. Vitalità cellulare per il campione secondo la seguente formula.

30 minuti prima della fine delle cinque ore di incubazione, preparare il Lucifer per ottenere una soluzione di due milligrammi per millilitro in soluzione salina tamponata con fosfato sterile. Proteggere la soluzione dalla luce dopo il periodo di incubazione di cinque ore a 25 microlitri di Lucifer per ogni pozzetto di cellule Vero nelle piastre solide bianche con un dispenser automatico integrato nel luminometro. Leggere le piastre con i seguenti parametri.

Agitare per cinque secondi e attendere 30 secondi. Leggere la luminescenza a un valore di esposizione a barra di sensibilità fisso appropriato, quindi registrare e salvare l'intensità bioluminescente quantificata. Se è stato utilizzato un erogatore automatico per aggiungere luciferino, appollaiare il luciferino e innescare le linee con acqua sterile o risultati accurati, risolvere la regressione non lineare per generare un'equazione di collina dalle curve standard.

Applicare questa equazione ai campioni titolati per calcolare le unità di espressione virale. I risultati di una tipica curva standard di VSV Delta 51 sono mostrati qui, oppure l'analisi di regressione non lineare dei parametri ha generato un diagramma di grandine da cui è possibile interpolare le unità di formazione dell'input sconosciuto. I titoli virali ottenuti mediante test standard di placca su cellule Vero sono stati confrontati con titoli virali calcolati dagli stessi campioni.

I campioni del saggio della luciferasi ad alto rendimento provengono da un esperimento in cui sono state utilizzate varie sostanze chimiche per migliorare la replicazione e la diffusione delle cellule VSV Delta 51 e 7 8 6 0. La correlazione lineare tra titoli e unità di espressione virale con un R al quadrato di 0,8083 e un punteggio R di Pearsons di 0,899 è illustrata qui. I dati tipici di citotossicità cellulare ottenuti da un test metabolico sono mostrati qui per 7, 8, 6, 0 cellule trattate con sostanze chimiche prima dell'infezione.

Con VSV Delta 51, qui vengono mostrate le tipiche curve standard ottenute con il virus dell'herpes simplex, il virus del vaccino e il virus adeno-associato, tutti esprimenti luciferasi della lucciola. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per condurre screening ad alto rendimento di librerie di composti in combinazione con il virus di interesse per generare titoli e dati di citotossicità. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di diluire correttamente la curva standard in quanto è fondamentale per interpolare le unità di espressione virale.

Non dimenticare che lavorare con virus vivi può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni come lavorare in una cabina di sicurezza biologica e indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stimare i titoli virali utilizzando un metodo di quantificazione ad alto rendimento basato sull'espressione di una misurazione della bioluminescenza del transgene della luciferasi nell'interpolazione di unità di espressione virale sconosciute. Da un campione di curva standard, la citotossicità può essere determinata simultaneamente da un appropriato saggio di vitalità.