Espressione della proteina ricombinante di Biologia Strutturale in HEK 293F cellule in sospensione: un approccio nuovo e accessibile

L'obiettivo generale del seguente video è quello di dimostrare una tecnica semplice ed economica per produrre una buona resa di proteine o complessi proteici utilizzando un sistema di espressione dei mammiferi. Ciò si ottiene coltivando cellule HEC 2 93 F in sospensione in un incubatore a scuotimento umidificato con un'atmosfera mantenuta al 5% di anidride carbonica. In una seconda fase, le cellule vengono trasfettate transitoriamente con uno o più plasmidi ad alto numero di copie.

Utilizzando l'agente di trasfezione polietilene EIN o PEI, le cellule sono state lasciate crescere per 48 ore prima della raccolta. Successivamente viene eseguita la purificazione delle proteine utilizzando la resina di affinità, seguita dalla filtrazione su gel per purificare il complesso proteico di interesse al fine di effettuare studi strutturali e funzionali. In definitiva, questo sistema di espressione dei mammiferi semplice ed economico consente l'espressione e la purificazione di proteine e complessi proteici difficili da esprimere nelle cellule batteriche.

Il vantaggio principale di questo approccio è la sua praticità e versatilità per l'espressione di complessi proteici. È facile quasi quanto produrre proteine nei batteri, soprattutto perché è possibile mescolare e abbinare i vettori di espressione proteica. Il metodo può essere inizialmente utilizzato su piccola scala per testare l'espressione di compresse proteiche, ma è facilmente scalabile in modo da produrre una buona resa di compresse proteiche Per studi strutturali e funzionali, la chiave del successo è mantenere le cellule in uno stato sano, libere da batteri o infezioni da lieviti.

Poiché gli antibiotici nei terreni riducono notevolmente la resa proteica. Per iniziare, rimuovere dall'azoto liquido una fiala criogenica contenente un millilitro di cellule HEC 2 9 3 F a una densità di 20 milioni di cellule per millilitro e scongelarla rapidamente in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Rompere eventuali grumi pipettando su e giù alcune volte e pipettare l'intero contenuto in un pallone di coltura cellulare conico da 250 millilitri contenente 34 millilitri di terreno di preriscaldamento.

Posizionare la coltura in un incubatore orbitale umidificato a 37 gradi Celsius, 120 giri/min e 5% di anidride carbonica dopo 48 ore. Controlla la vitalità cellulare tramite trian blue. La normale vitalità cellulare in questa fase è di circa il 70% quando le cellule avranno raggiunto un conteggio di circa 1 milione di cellule per millilitro.

Massaggiarle fino a ottenere un conteggio finale di 0,35 milioni di cellule per millilitro in un pallone di coltura cellulare conico da 250 millilitri contenente 60 millilitri di terreno di preriscaldamento, continuare a massaggiare le cellule ogni 48 ore o quando raggiungono un totale di circa 2 milioni di cellule per millilitro. Qui è mostrato un campione di Trian blue stain: le cellule HEC 2, 9, 3 F a 2,3 milioni di cellule per millilitro da uno stock pronto per essere seminato per la trasfezione, le cellule dovrebbero essere presenti solo come cellule singole o in divisione. Se le cellule sono troppo cresciute, formeranno grandi grumi e avranno una vitalità molto bassa, come mostrato in questa immagine.

Se le cellule stanno formando grappoli, questi possono essere rotti da un vortice vigoroso per 25 secondi. Per iniziare le colture su larga scala, le cellule seminano a mezzo milione di cellule per millilitro in un volume finale di 300 millilitri in ogni bottiglia a rullo da un litro. Incubare per 24 ore in un agitatore orbitale umidificato a 37 gradi Celsius, 135 giri/min e 5% di anidride carbonica fino a quando le cellule raggiungono una densità di 1 milione di cellule per millilitro.

Successivamente, pipettare un totale di 300 microgrammi di DNA sterilizzato con filtro in 30 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS e agitare energicamente per tre secondi. Quindi aggiungere 1,2 millilitri di 0,5 milligrammi per millilitro. Filtrare il PEI sterilizzato nella soluzione PB SDNA e agitare energicamente per altri tre secondi.

Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 minuti prima di aggiungere la miscela alle celle dopo la culla. Incubare le cellule in un incubatore con agitazione orbitale umidificato per ulteriori 48 ore a 37 gradi Celsius, 135 giri/min e 5% di anidride carbonica dopo 48 ore. Raccogli le proteine intracellulari centrifugando le cellule a 3000 volte G per cinque minuti.

Se il pellet della cella non è destinato all'uso immediato, può essere conservato a meno 80 gradi Celsius. Questo protocollo è ottimizzato per la purificazione di complessi proteici dal nucleo in cui una delle proteine ha un contrassegno. Per iniziare la purificazione resus, sospendere la tavolozza cellulare in circa 40 millilitri di lisi pre-raffreddata, tampone per litro di coltura, utilizzando una combinazione di pipettaggio su e giù più volte, e un omogeneizzatore di vetro sonicato per tre cicli di 15 secondi su 15 secondi di spegnimento.

Quindi centrifugare le 108.000 volte G per 25 minuti a quattro gradi Celsius e conservare il natante supino. Successivamente, equilibrare 1,2 millilitri di resina aros confezionata Anti-Flag per litro di coltura lavando tre volte con il tampone di equilibrio della resina, incubare il supinato, che rappresenta l'intero estratto cellulare con la resina di affinità in una o più provette da centrifuga da 50 millilitri, ruotando delicatamente per 30-120 minuti a quattro gradi Celsius, dopo la centrifuga di incubazione a 3000 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il supinato, trasferire la resina in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e lavare con un totale di 45 millilitri di tampone pre-raffreddato, una centrifuga prima e quindi scartare il lavaggio ripetuto e la centrifugazione del supinato utilizzando un tampone ad alto contenuto di sale, seguito da un tampone a basso contenuto di sale e un tampone di scissione TEV.

Assicurati che ogni lavaggio sia sufficiente per risospendere completamente la resina, ma non oltre. Successivamente, raccogliere un campione di resina da 10 microlitri e diluirlo in un volume di tampone di carico proteico due volte superiore per l'analisi che rappresenti il campione proteico legato. Non utilizzare agenti riducenti poiché rilasceranno l'anticorpo dalla resina.

Quindi risospendere la resina in 10 millilitri di tampone di scissione TEV pre-raffreddato a circa 40 microgrammi di proteasi TEV per litro di coltura originale e miscelare capovolgendo più volte la provetta. I livelli di proteasi TEV possono essere ottimizzati in base alla quantità di proteina espressa. Sostituire l'atmosfera del tubo con azoto gassoso al 100% per prevenire l'ossidazione delle proteine prima di ruotare delicatamente durante la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo.

Centrifugare il campione a 3000 volte G per 10 minuti, quindi trasferire il supinato in un filtro ultra centrifugo con un adeguato taglio di peso molecolare e concentrare fino a 500 microlitri. Raccogliere un campione da 10 microlitri della proteina concentrata e diluirlo in un volume di tampone di caricamento proteico due volte superiore per l'analisi. Questo campione rappresenta il campione di eluato TEV.

Quindi raccogliere un campione di 10 microlitri di resina e diluirlo in un volume di tampone di carico proteico due volte. Questo campione rappresenta il campione di resina post TEV. Il passo successivo consiste nel far passare la proteina attraverso una colonna di esclusione dimensionale e deve essere utilizzata un'appropriata matrice di filtrazione su gel in base alle dimensioni del complesso di interesse.

In questo caso, abbiamo utilizzato una colonna cromatografica di esclusione dimensionale S 200 da 10 x 300 millimetri A per equiparare la colonna cromatografica ad esclusione dimensionale con il tampone di filtrazione su gel. Filtrare la proteina attraverso un filtro da 0,22 micron e caricare il campione nella colonna. Procedi a raccogliere le frazioni man mano che escono dalla colonna.

Come passaggio finale, eseguire l'elettroferesi su gel di poliacrilammide SDS SDS o la pagina SDS sui campioni raccolti, nonché le frazioni di filtrazione del gel, l'istone DS SLA uno o HD uno soppressore di silenziamento difettoso tre o SDS tre e syn tre, un dominio di interazione HDAC o syn tre, un HID forma un complesso tornito stabile. La purificazione per affinità del complesso tornito può essere osservata attraverso la pagina SDS. Qui è mostrato il complesso purificato prodotto dal cot, sezionando due litri di cellule.

La corsia delle proteine legate mostra il complesso legato alla resina di affinità. Dopo la digestione del TEV, l'etichetta presente sul sin tre A HID viene scissa e si allude al complesso. La resina mostrata qui è un cromatogramma del complesso proteico purificato utilizzando una colonna cromatografica ad esclusione di dimensioni S 200 di 10 x 300 millimetri.

Si noti che il complesso puro elude vicino al volume vuoto perché forma un dimero in soluzione. Infine, l'analisi della pagina SDS rivela la proteina purificata nelle frazioni di filtrazione su gel. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare, mantenere e far crescere le cellule HEC due e tre app, nonché di come affinità, purificare e concentrare le proteine.

Complesso Le cellule sane saranno essenziali per il successo degli esperimenti, quindi assicurati che vengano coltivate e mantenute nelle loro condizioni e passaggi regolarmente. Non lasciarti scoraggiare dalla coltura dei tessuti. È facile per i biologi strutturali esprimere e purificare grandi quantità di proteine e complessi proteici da cellule di mammifero.