Name: Espressione della proteina ricombinante di Biologia Strutturale in HEK 293F cellule in sospensione: un approccio nuovo e accessibile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Scopri un metodo semplice ed economico per esprimere proteine ricombinanti in cellule HEK 293F in sospensione. Questa tecnica scalabile produce complessi proteici di alta qualità per studi di biologia strutturale.

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Vorremmo ringraziare il Dr. Xiaowen Yang (servizio di clonazione PROTEX) per la preparazione dei costrutti di espressione utilizzati per questo lavoro e l&#39;Università di Leicester core Biotecnologia Servizi. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa di studio BBSRC, il Programma Fiducia Wellcome e sovvenzioni Senior Investigator WT085408 &amp; WT100237 e BBSRC concedono RM31G0224.

NOTA: Il protocollo è adatto a qualsiasi scala di espressione, quindi, i volumi e le quantità di reagenti devono essere scalati in modo proporzionale. Un adatto vettore di espressione di mammifero deve essere utilizzato per questo protocollo. Qui abbiamo utilizzato una versione modificata pcDNA 3.1 vettore di espressione che permette comodamente l&#39;inclusione o l&#39;esclusione di un tag di affinità in base alla scelta degli enzimi di restrizione utilizzati nella clonazione (Figura 1). Il seguente protocollo descrive un grande trasfezione scala. 1 Large Scale Cultura / trasfezione in 1 L Roller Bottiglie Crescere e mantenere le cellule sospensione adattato HEK293F secondo protocolli standard. Tipicamente colture starter comprese tra 30 e 100 ml sono coltivati ​​in 250 ml coniche fiasche di coltura cellulare. <ol><li> Cellule Seed a 0.5 x 10 6 cellule / ml in un volume finale di 300 ml in ogni bottiglia rullo 1 L. NOTA: bottiglie rulli ospitare un minimo di 150 ml ad un massimo di300 ml di coltura in sospensione. Per i più grandi transfezioni scala utilizzare più bottiglie. </li><li> Incubare per 24 ore in un agitatore orbitale incubatore a 37 ° C, 120 rpm, e 5% di CO 2 fino cellule raggiungono una densità di 1,0 x 10 6 cellule / ml (cellule devono dividere approssimativamente ogni 24 ore). </li><li> Pipettare un totale di 300 mg di DNA, sterilizzata per filtrazione (vedi metodo supplementare) in 30 ml di PBS e mescolare vigorosamente nel vortex per 3 secondi. NOTA: Utilizzare un totale di 1 mg di DNA per milione di cellule trasfettate. Se due o più plasmidi devono essere co-trasfettate ridurre la quantità di ciascun modo che il rapporto di DNA di cellule rimane costante. </li><li> Aggiungere 1,2 ml di 0,5 mg / ml, sterilizzata per filtrazione PEI alla soluzione PBS / DNA e vortex vigorosamente per 3 sec. </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Aggiungere il DNA / PEI miscela alle cellule - che dovrebbe essere ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml (passo 1.3). </li><li> A seguito di co-trasfezione, incubare le cellulein un incubatore agitatore orbitale per un ulteriore 48 ore a 37 ° C, 120 rpm, e 5% di CO 2. </li><li> Harvest proteine ​​intracellulari mediante centrifugazione cellule a 3.000 xg per 5 min e immagazzinare il pellet a -80 ° C. NOTA: In alternativa, usare uno standard (non-CO 2) che agita incubatrice, se l&#39;atmosfera sopra la coltura viene sostituito con il 5% di CO 2 e il coperchio della bottiglia è sigillata. L&#39;atmosfera dovrà essere sostituita ad ogni passaggio (normalmente ogni 2 giorni). </li></ol> 2.-Protein complesso Purificazione da estratto cellulare totale Questo protocollo è ottimizzato per la purificazione dei complessi nucleari che utilizzano proteine ​​bandiera-tag. <ol><li> Scongelare pellet di cellule in ~ 40 ml di tampone di lisi pre-raffreddata (100 mM acetato di potassio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolo, 0,3% Triton X-100, inibitori della proteasi) per l di cultura. </li><li> Risospendere il pellet pipettando su e giù parecchie volte (per evitare la formazione di schiuma, non fare vortex). </li&gt; <li> Accuratamente risospendere le cellule utilizzando un omogeneizzatore di vetro. Sonicare per 3 cicli (15 sec a 15 sec, off). Centrifugare a 30.000 xg per 25 min a 4 ° C e conservare il surnatante. </li><li> Equilibrare 1,25 ml di anti-bandiera ricco di resina di agarosio per litro di coltura da lavare tre volte con tampone di equilibrazione resina (acetato di potassio 100 mM, 50 mM Tris pH 7.5). </li><li> Incubare l&#39;estratto cellulare tutto dal punto 2.3 con la resina di affinità in uno o più di 50 ml provette e ruotare delicatamente il campione per 30-120 minuti a 4 ° C. </li><li> Centrifugare a 3000 xg per 1 min a 4 ° C, il surnatante scarti. </li><li> Lavare la resina con 45 ml di tampone di pre-refrigerati 1 (100 mM acetato di potassio, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolo, 0,3% Triton X-100). Centrifugare a 3000 xg per 1 minuto e scartare il surnatante. </li><li> Ripetere il punto 2.7 utilizzando tampone di sale (acetato di potassio 300 mM, 50 mM Tris pH 7,5, 5% glicerolo), seguito da buffer di basso contenuto di sale (acetato di potassio 50 mM, 50 mM Tris pH 7.5, 5% glicerolo) e TEV Decolleté Buffer (50 mM acetato di potassio, 50 mM Tris pH 7.5, TCEP 0,5 mM). NOTA: Assicurarsi che ogni lavaggio è breve cioè, sufficiente a pieno risospendere la resina e non più. </li><li> Raccogliere un campione di 10 ml di resina e diluire in 1 volume di 2x tampone di proteine ​​di carico per l&#39;analisi (controllo legato alle proteine). Non utilizzare agenti riducenti al fine di evitare di rilasciare l&#39;anticorpo dalla resina. </li><li> Risospendere la resina in 8-10 ml di pre-raffreddata buffer di TEV scissione e trasferimento in una provetta da centrifuga 15 ml. </li><li> Aggiungere ~ 40 mcg di TEV proteasi (da magazzino a 1 mg / ml) per L di cultura originale e mescolare bene pipettando su e giù parecchie volte. </li><li> Sostituire atmosfera tubo con il 100% di N 2 gas per prevenire l&#39;ossidazione delle proteine. </li><li> Ruotare delicatamente O / N a 4 ° C. </li><li> Centrifugare a 3000 xg per 10 min. Trasferire il surnatante in un filtro ultra centrifugo con un adeguato peso molecolare di cut-off e concentrarsifino a 500 microlitri. </li><li> Raccogliere un campione di 10 microlitri della proteina concentrato e diluire a 1 volume di tampone 2x proteina caricamento per analisi. (TEV controllo eluato). </li><li> Raccogliere un campione di 10 ml di resina e diluire a 1 volume di tampone 2x proteina caricamento per analisi. Non utilizzare agenti riducenti per evitare rilasciando grandi quantità di anticorpi dalla resina. (Controllo di resina post-TEV). </li><li> Equilibrare la colonna cromatografia ad esclusione dimensioni, con buffer di gel filtrazione (acetato di potassio 50 mM, 50 mM Tris pH 7.5, TCEP 0,5 mM). </li><li> Filtrare la proteina attraverso un filtro da 0,22 micron </li><li> Caricare il campione nella colonna e raccogliere le frazioni. </li><li> Campioni Eseguire passi da 2.9, 2.15 e 2.16 e le frazioni di filtrazione gel dal punto 2.19 su un SDS-PAGE e colorazione Coomassie per l&#39;analisi. NOTA: Si consiglia di eseguire un SDS-PAGE di campioni da gradini 2.9, 2.15 e 2.16 prima di gel filtrazione per confermare espressione della proteina bersaglio.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Abbiamo sviluppato un metodo efficace semplice ed economico (costa PEI molto meno disponibili in commercio reagenti di trasfezione lipofile) per esprimere e purificare grandi quantità di proteine ​​ricombinanti e complessi multi-subunità da cellule di mammifero. Trasfezione ottimale e l&#39;efficienza di espressione possono essere raggiunti se il DNA plasmidico altamente puro (260/280 tra 1,8 e 2,0) viene utilizzato in combinazione con PEI come descritto nella sezione del protocollo. Le cellule devono essere coltivate in mezzi sierica- e senza antibiotici, quindi, una tecnica sterile è strettamente necessario per passaging e le cellule trasfezione per evitare infezioni costose e che richiede tempo. La vitalità cellulare dovrebbe essere del 90% o superiore e culture non dovrebbe essere cresciuto fino a densità superiori a 2,5 x 10 6 cellule / ml immediatamente prima di un transfezione, in quanto così facendo si riduce la resa di proteine. Per la trasfezione di successo, le colture devono contenere solo le celle singole o divisione. I cluster possono essere interrotte da vigorevortex ous 20 a 30 secondi (Figura 5). Il rapporto di ciascun plasmide usato nella co-trasfezione può essere variata dall&#39;utente secondo la stechiometria dell&#39;essere complesso studiato. Espressione efficienza può essere ottimizzato per la proteina di interesse, in modo che una volta espressione adatto può essere stabilita. Purificazione deve essere eseguita mantenendo il freddo campione proteico in ogni momento a ridurre il rischio di indesiderati degradazione proteolitica. La scelta delle variabili e buffer di purificazione è critica, in quanto possono interferire con elementi strutturali o siti attivi di alcune proteine, spesso con conseguente ridotta solubilità e / o perdita di attività enzimatica. Trasfezioni piccole dimensioni sono particolarmente utili per testare diversi costrutti per la purificazione di grandi complessi proteici. Oggi, una grande varietà di metodologie alternative sono disponibili per l&#39;espressione di proteine ​​ricombinanti eucariotiche (Tabella 2). Ad esempio, Baculovirus espressione in cellule di insetto è ampiamente utilizzato per la sua elevata efficienza di trasduzione e la sua mancanza di citotossicità in confronto ad altre specie virali 6. Tuttavia, il processo di rendere il virus è in termini di tempo e la sua instabilità non consente al virus di essere immagazzinato per lunghi periodi. D&#39;altro canto, sistemi di espressione di lievito offrono la possibilità di coltivare cellule di densità molto elevate nelle culture fermentatori, con conseguente alte rese di proteine ​​7. Ma non hanno ancora la piena varietà di modificazioni post-traduzionali necessarie per le proteine ​​eucariotiche piegare correttamente e interagire con i loro partner proteici. HDAC3, per esempio, è espresso ma non si piega in E. coli. Tuttavia, quando espresso in cellule 293F, siamo stati in grado di purificare un enzima attivo nel complesso con la sua co-repressore (SMRT) e una molecola di inositolo tetrafosfato (IP4) 8, che non si trova nelle cellule procariote. Questo metodo ci ha anche permesso di purificare e risolvere il cristallo structure di HDAC1 interagire con MTA1 nel complesso nurd, che allo stesso modo viene attivato da IP4 9. Idealmente, vorremmo sempre esprimere proteine ​​eucariotiche nel loro ambiente naturale, fisiologico. Sistemi di espressione di mammifero che impiegano cellule HEK 293-EBNA1 in bioreattori 10-12 sono stati descritti e produrre livelli molto alti di proteine, ma questi possono essere complessi da utilizzare. Il nostro metodo è una semplice e accessibile alternativa ai sistemi di espressione in batteri, lieviti e bioreattori. Il metodo di espressione è veloce e non richiede l&#39;impiego di attrezzature costose, soprattutto se l&#39;atmosfera bottiglia rullo o pallone viene sostituito con il 5% di CO 2 e vengono utilizzati incubatori stringono standard. Abbiamo usato questi protocolli di co-trasfezione più plasmidi e purificare complessi con un massimo di cinque proteine ​​con rese di&gt; 1 mg / L di cultura. È interessante notare che, il sistema aiuta l&#39;individuazione di stabili complessi ben educati. Per esempio, expressione del complesso binario di HDAC1 e Sin3A ha rese limitate di proteine, ma l&#39;aggiunta di SDS3 portato a 5 volte maggiori quantità e quindi guida il biologo strutturale nella scelta dei costrutti adatti e complessi stabili per la cristallizzazione.

Il rapido progresso della biologia cellulare molecolare e la costante necessità di farmaci migliorati in medicina ha creato la necessità per i biologi strutturali a guardare strutture proteiche sempre più complesse. Questi spesso possono richiedere particolari modificazioni post-traduzionali, chaperon molecolari e co-fattori per sostenere il loro ripiegamento elaborato e l&#39;attività enzimatica. Mentre la stragrande maggioranza delle strutture presenti nel Protein Data Bank sono stati ottenuti utilizzando sistemi di espressione batterici, procarioti sono in grado di eseguire un gran numero di queste modifiche e mancano molti cofattori essenziali eucariotiche. Questo può essere un problema per lo studio di grandi complessi multi-subunità che vengono attivati ​​da piccole molecole di segnalazione, nonché per nucleare, superficie cellulare e proteine ​​secrete che richiedono elaborati macchinari pieghevoli. Un certo numero di E. coli sono stati progettati per superare alcune di queste limitazioni 1. Negli ultimi anni, tuttavia, l&#39;uso di msistemi di espressione ammalian è in aumento perché affidabile producono proteine ​​eucariotiche che sono altrimenti problematici per esprimere in altri sistemi 2. Oggi è possibile ottenere linee cellulari di espressione di mammifero stabili e transienti attraverso una varietà di tecniche che vanno dalla trasduzione virale di transfezione mediata chimica, fisica trasferimento genico come elettroporazione e iniezione diretta 3. Mentre tutti questi metodi hanno la loro propria serie di vantaggi e svantaggi, solo pochi di loro sono adatti per studi strutturali che sono troppo costosi e / o di tempo. Qui si descrive un metodo molto semplice, veloce, poco costoso ma molto efficace per esprimere complessi proteici per la biologia strutturale in sospensione coltivato cellule di mammifero. L&#39;approccio utilizza transitorio co-trasfezione di un embrionali umane di rene (HEK) linea cellulare (ad esempio, le cellule HEK Freestyle 293F). Queste cellule sono state derivate dalla HEK 293 cell linea, sono adattate a crescere in colture in sospensione, raggiungendo elevate densità utilizzando mezzi privi di siero (come FreeStyle 293 Expression Media). Le cellule sono poi trasfettate utilizzando una versione derivata di polietilenimmina (PEI), un reagente polimerico economico che è stato segnalato per funzionare per una vasta gamma di cellule di mammifero 4 formando complessi DNA / PEI che entrano nella cellula ospite per endocitosi 5. Questo metodo è adatto sia su piccola scala (30 ml) e su larga scala (fino a 300 ml) esperimenti e in grado di produrre alti livelli di complessi proteici purificati. È particolarmente utile per studiare le proteine ​​che richiedono macchinari complessi pieghevoli, cofattori o particolari modificazioni post-traduzionali che non possono essere eseguite da batteri, lieviti e cellule di insetto. In questo protocollo presentiamo l&#39;espressione e purificazione della tre-proteina scaffold centrale dal complesso di repressione trascrizionale Sin3A. Si tratta di HistoneDeacetilasi 1 (HDAC1), soppressore di difettoso Silencing 3 (SDS3) e Switch-indipendente 3 (Sin3A). Il complesso purificato viene utilizzato per prove di cristallizzazione high-throughput.

<table><tbody><tr><td>Celle FreeStyle HEK 293F</td><td>LifeTechnologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium LifeTechnologies</td><td></td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>SIGMA</td><td>A220</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyer Flask con tappo ventilato</td><td>Corning</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi a rullo con tappi ventilati</td><td>Corning</td><td>01836-02</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina, 25 kDa, ramificato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>Produrre stock da 0,5 mg/ml in H2O, regolare il pH a 7,0 con HCl diluito e conservare a -20 - 4&ordm; C</td></tr><tr>Vettore <td></td><td></td><td></td><td>di espressione dei mammiferi</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &; micro; m Unità filtranti centrifughe</td><td>Amicon</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Filtri ultra centrifughi (cut-off 10 kDa)</td><td>Amicon</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex&nbsp; 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr></tbody></table>

espressione della proteina ricombinante di biologia strutturale in hek 293f cellule in sospensione: un approccio nuovo e accessibile

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

L'espressione e la purificazione di grandi quantità di complessi proteici ricombinanti è un requisito essenziale per gli studi di biologia strutturale. Per oltre due decenni, i sistemi di espressione procariotica come E. coli hanno dominato la letteratura scientifica su linee cellulari eucariotiche costose e meno efficienti. Nonostante l'evidente vantaggio in termini di resa e costi dell'espressione di proteine ricombinanti nei batteri, l'assenza di specifici cofattori, chaperoni e modificazioni post-traduzionali può causare perdita di funzione, misfolding e può interrompere le interazioni proteina-proteina di alcuni complessi multi-subunità eucariotici, recettori di superficie e proteine secrete. L'uso di sistemi di espressione cellulare di mammifero può risolvere questi inconvenienti poiché forniscono un ambiente di espressione eucariotica. Tuttavia, le basse rese proteiche e gli alti costi di tali metodi hanno limitato fino a poco tempo fa il loro uso per la biologia strutturale. Qui descriviamo un metodo semplice e accessibile per esprimere e purificare quantità di milligrammi di proteine eseguendo trasfezioni transitorie di cellule HEK (rene embrionale umano) 293F cresciute in sospensione.

Qui vi mostriamo un 2 L (8 x 250 ml culture) transitoria co-trasfezione e purificazione della HDAC1, SDS3, Sin3A complesso ternario. HDAC1 e SDS3 interagiscono con Sin3A attraverso il dominio HDAC-interazione (HID) di Sin3A. Un tipico rendimenti di depurazione fino a 1 mg di complesso per litro di coltura. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig1highres.jpg" width="500"> Figura 1 Schema del pcDNA 3.1 vettore di espressione modificato. Il plasmide è stato digerito con EcoRV e EcoRI per includere l'affinità-tag e il sito scissione TEV sul terminale amino di Sin3A. Per clonare le versioni senza tag di HDAC1 e SDS3, il vettore è stato digerito con EcoRI e KpnI. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig2highres.jpg" width="500"> Figura 2 SDS-PAGE mostra la prima fase della purificazione. La corsia "proteina legata" indica il complesso legato alla resina di affinità. Dopo TEV digestione, l'etichetta presente sul Sin3A-HID viene scissa spento e il complesso viene eluito dalla resina, come mostrato nella seconda e terza corsie del gel. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig3highres.jpg" width="500"> Figura 3 Cromatogramma della purificato mediante cromatografia di esclusione dimensione proteina-complesso. Notare che il complesso puro diluito in volume vuoto perché forma un dimero in soluzione. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51897/51897fig4highres.jpg" width="500"> Figura 4. SDS-PAGE mostra le frazioni del gel filtrazione mostrato in Figura 3. Figura 5 Trypan Blue-macchiato cellule HEK 293F a 2.3x10 6 cellule / ml pronto per essere transfettate. Cellule devono essere presenti come cellule singole o divisione solo, mentre il cluster di grandi dimensioni possono essere suddivisi nel vortex vigorosa per circa 25 sec. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Possibili cause </td><td> Azione </td></tr><tr><td rowspan="4"> Bassa resa di proteine. </td><td> Basso numero di cellule transfettate. </td><td> Assicurarsi densità cellulare è di circa 1.0 x 10 6 prima di aggiungere la miscela di reazione trasfezione alla cultura. </td></tr><tr><td> Le cellule possono essere stati reinoculate troppe volte. </td><td> Utilizzare le cellule ceppo dopo circa 90 passaggioetà. </td></tr><tr><td> DNA può essere rallentata o hanno una quantità elevata di impurità. </td><td> Assicurarsi che il DNA plasmidico utilizzato ha un rapporto di 260/280 tra 1,8 e 2,0. Esecuzione del DNA su un gel di agarosio è consigliabile valutare la qualità. </td></tr><tr><td> Protein (s) espressi non sono stabili o abbastanza solubile. </td><td> Prova diversi costrutti in piccola scala prima di up-scalare le trasfezioni. Assicurarsi che i tag non interferiscono con la struttura della proteina (s) di interesse. </td></tr><tr><td> Cellule guardare nuvoloso e hanno un colore e / o odore insolito. </td><td> Le cellule sono infette da batteri o lieviti. </td><td> Buona tecnica sterile deve essere utilizzato in ogni momento. Fumigazione le cappe a flusso laminare e UV-disinfezione della camera di coltura cellulare in caso di infezione aiuta contenente il problema. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Le cellule hanno una bassa redditività. </td><td> PH errato nei media. </td><td> Assicurarsi che le culture sono coltivate al 5-8% di CO 2in ogni momento. </td></tr><tr><td> Le cellule sono state coltivate fino ad una densità sopra 3.0x10 6 cellule / ml. </td><td> Le cellule non devono essere coltivate fino a densità superiore a 2,5 x 10 6 cellule / ml subito prima di un trasfezione e mai superiori a 3,0 x 10 6 cellule / ml. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Purificazione per affinità non ha funzionato </td><td> Protein (s) non viene espresso. </td><td> Vedi sopra. </td></tr><tr><td> Condizioni di depurazione potrebbe essere sbagliato. </td><td> Regolare le condizioni di buffer (ad esempio, sale alto, basso contenuto di sale, il pH.) </td></tr></tbody></table> Tabella 1 Risoluzione dei problemi. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sistema </td><td> Vantaggi </td><td> Svantaggi </td></tr><tr><td> E. coli </td><td><ul><li> Velocesistema di espressione </li><li> Rendimenti elevati di proteine </li><li> Poco costoso </li><li> Adatto per la produzione conveniente di proteine ​​marcati con isotopi </li></ul></td><td><ul><li> La mancanza di accompagnatori importanti che può essere richiesto per il ripiegamento delle proteine </li><li> La mancanza di molte modificazioni post traduzionali </li><li> Può mancare di co-fattori che sono importanti per la funzione delle proteine ​​e / o montaggio complesso. </li></ul></td></tr><tr><td> P. pastoris </td><td><ul><li> Impossibile eseguire la maggior parte dei post-traduzionali </li><li> Poco costoso </li></ul></td><td><ul><li> Mancano alcune modificazioni post-traduzionali </li><li> Può mancare di co-fattori che sono importanti per la funzione delle proteine ​​e / o montaggio complesso. </li></ul></td></tr><tr><td> Espressione di Baculovirus in cellule di insetto </td><td><ul><li> Può eseguire tutte le modificazioni post traduzionali &lt;/ Li&gt; </li><li> Baculovirus è meno citotossico di altri ceppi virali </li></ul></td><td><ul><li> Preparazione del virus per la trasduzione è tempo </li><li> Il virus non è stabile e non può essere immagazzinata per lunghi periodi di tempo </li><li> Cellule di insetto possono mancare co-fattori che sono importanti per la funzione delle proteine ​​e / o montaggio complesso. </li></ul></td></tr><tr><td> Bioreattori con sistemi di mammiferi </td><td><ul><li> Può eseguire tutte le modificazioni post traduzionali </li><li> Può fornire tutti i co-fattori necessari per la funzione delle proteine ​​e assemblaggio complesso </li><li> Can cellule di coltura a densità molto elevate </li><li> Può esprimere tutte le proteine ​​di mammiferi che richiedono macchinari complessi pieghevoli </li><li> Rendimenti molto elevati di proteine </li></ul></td><td><ul><li> Richiede personale specializzato per utilizzare il bioreattore. </li><li> È necessario costose attrezzature. </li><li> Ottimizzazione condizione di espressiones può richiedere molto tempo. </li></ul></td></tr><tr><td> Cellule in sospensione HEK 293F </td><td><ul><li> Può eseguire tutte le modificazioni post traduzionali </li><li> Può fornire tutti i co-fattori necessari per la funzione delle proteine ​​e assemblaggio complesso </li><li> Può esprimere tutte le proteine ​​di mammiferi che necessitano di macchine di piegatura complesso </li><li> Protocollo veloce e intuitivo trasfezione </li><li> Relativamente poco costoso rispetto ai bioreattori e / o altri reagenti di trasfezione disponibili in commercio. </li></ul></td><td><ul><li> Anche se a prezzi accessibili, non economico come espressione nei batteri </li></ul></td></tr></tbody></table> Tabella 2. Vantaggi e svantaggi dei principali sistemi di espressione.

L'espressione di proteine ricombinanti da parte dei sistemi dei mammiferi sta diventando un metodo attraente per la produzione di complessi proteici per la biologia strutturale. Qui presentiamo un sistema di espressione semplice ma altamente efficiente che utilizza cellule di mammifero cresciute in sospensione per purificare complessi proteici per studi strutturali.

Espressione della proteina ricombinante di Biologia Strutturale in HEK 293F cellule in sospensione: un approccio nuovo e accessibile

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

L'obiettivo generale del seguente video è quello di dimostrare una tecnica semplice ed economica per produrre una buona resa di proteine o complessi proteici utilizzando un sistema di espressione dei mammiferi. Ciò si ottiene coltivando cellule HEC 2 93 F in sospensione in un incubatore a scuotimento umidificato con un'atmosfera mantenuta al 5% di anidride carbonica. In una seconda fase, le cellule vengono trasfettate transitoriamente con uno o più plasmidi ad alto numero di copie.Utilizzando l'agente di trasfezione polietilene EIN o PEI, le cellule sono state lasciate crescere per 48 ore prima della raccolta. Successivamente viene eseguita la purificazione delle proteine utilizzando la resina di affinità, seguita dalla filtrazione su gel per purificare il complesso proteico di interesse al fine di effettuare studi strutturali e funzionali. In definitiva, questo sistema di espressione dei mammiferi semplice ed economico consente l'espressione e la purificazione di proteine e complessi proteici difficili da esprimere nelle cellule batteriche.Il vantaggio principale di questo approccio è la sua praticità e versatilità per l'espressione di complessi proteici. È facile quasi quanto produrre proteine nei batteri, soprattutto perché è possibile mescolare e abbinare i vettori di espressione proteica. Il metodo può essere inizialmente utilizzato su piccola scala per testare l'espressione di compresse proteiche, ma è facilmente scalabile in modo da produrre una buona resa di compresse proteiche Per studi strutturali e funzionali, la chiave del successo è mantenere le cellule in uno stato sano, libere da batteri o infezioni da lieviti.Poiché gli antibiotici nei terreni riducono notevolmente la resa proteica. Per iniziare, rimuovere dall'azoto liquido una fiala criogenica contenente un millilitro di cellule HEC 2 9 3 F a una densità di 20 milioni di cellule per millilitro e scongelarla rapidamente in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Rompere eventuali grumi pipettando su e giù alcune volte e pipettare l'intero contenuto in un pallone di coltura cellulare conico da 250 millilitri contenente 34 millilitri di terreno di preriscaldamento.Posizionare la coltura in un incubatore orbitale umidificato a 37 gradi Celsius, 120 giri/min e 5% di anidride carbonica dopo 48 ore. Controlla la vitalità cellulare tramite trian blue. La normale vitalità cellulare in questa fase è di circa il 70% quando le cellule avranno raggiunto un conteggio di circa 1 milione di cellule per millilitro.Massaggiarle fino a ottenere un conteggio finale di 0,35 milioni di cellule per millilitro in un pallone di coltura cellulare conico da 250 millilitri contenente 60 millilitri di terreno di preriscaldamento, continuare a massaggiare le cellule ogni 48 ore o quando raggiungono un totale di circa 2 milioni di cellule per millilitro. Qui è mostrato un campione di Trian blue stain: le cellule HEC 2, 9, 3 F a 2,3 milioni di cellule per millilitro da uno stock pronto per essere seminato per la trasfezione, le cellule dovrebbero essere presenti solo come cellule singole o in divisione. Se le cellule sono troppo cresciute, formeranno grandi grumi e avranno una vitalità molto bassa, come mostrato in questa immagine.Se le cellule stanno formando grappoli, questi possono essere rotti da un vortice vigoroso per 25 secondi. Per iniziare le colture su larga scala, le cellule seminano a mezzo milione di cellule per millilitro in un volume finale di 300 millilitri in ogni bottiglia a rullo da un litro. Incubare per 24 ore in un agitatore orbitale umidificato a 37 gradi Celsius, 135 giri/min e 5% di anidride carbonica fino a quando le cellule raggiungono una densità di 1 milione di cellule per millilitro.Successivamente, pipettare un totale di 300 microgrammi di DNA sterilizzato con filtro in 30 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato o PBS e agitare energicamente per tre secondi. Quindi aggiungere 1,2 millilitri di 0,5 milligrammi per millilitro. Filtrare il PEI sterilizzato nella soluzione PB SDNA e agitare energicamente per altri tre secondi.Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20 minuti prima di aggiungere la miscela alle celle dopo la culla. Incubare le cellule in un incubatore con agitazione orbitale umidificato per ulteriori 48 ore a 37 gradi Celsius, 135 giri/min e 5% di anidride carbonica dopo 48 ore. Raccogli le proteine intracellulari centrifugando le cellule a 3000 volte G per cinque minuti.Se il pellet della cella non è destinato all'uso immediato, può essere conservato a meno 80 gradi Celsius. Questo protocollo è ottimizzato per la purificazione di complessi proteici dal nucleo in cui una delle proteine ha un contrassegno. Per iniziare la purificazione resus, sospendere la tavolozza cellulare in circa 40 millilitri di lisi pre-raffreddata, tampone per litro di coltura, utilizzando una combinazione di pipettaggio su e giù più volte, e un omogeneizzatore di vetro sonicato per tre cicli di 15 secondi su 15 secondi di spegnimento.Quindi centrifugare le 108.000 volte G per 25 minuti a quattro gradi Celsius e conservare il natante supino. Successivamente, equilibrare 1,2 millilitri di resina aros confezionata Anti-Flag per litro di coltura lavando tre volte con il tampone di equilibrio della resina, incubare il supinato, che rappresenta l'intero estratto cellulare con la resina di affinità in una o più provette da centrifuga da 50 millilitri, ruotando delicatamente per 30-120 minuti a quattro gradi Celsius, dopo la centrifuga di incubazione a 3000 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il supinato, trasferire la resina in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e lavare con un totale di 45 millilitri di tampone pre-raffreddato, una centrifuga prima e quindi scartare il lavaggio ripetuto e la centrifugazione del supinato utilizzando un tampone ad alto contenuto di sale, seguito da un tampone a basso contenuto di sale e un tampone di scissione TEV.Assicurati che ogni lavaggio sia sufficiente per risospendere completamente la resina, ma non oltre. Successivamente, raccogliere un campione di resina da 10 microlitri e diluirlo in un volume di tampone di carico proteico due volte superiore per l'analisi che rappresenti il campione proteico legato. Non utilizzare agenti riducenti poiché rilasceranno l'anticorpo dalla resina.Quindi risospendere la resina in 10 millilitri di tampone di scissione TEV pre-raffreddato a circa 40 microgrammi di proteasi TEV per litro di coltura originale e miscelare capovolgendo più volte la provetta. I livelli di proteasi TEV possono essere ottimizzati in base alla quantità di proteina espressa. Sostituire l'atmosfera del tubo con azoto gassoso al 100% per prevenire l'ossidazione delle proteine prima di ruotare delicatamente durante la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo.Centrifugare il campione a 3000 volte G per 10 minuti, quindi trasferire il supinato in un filtro ultra centrifugo con un adeguato taglio di peso molecolare e concentrare fino a 500 microlitri. Raccogliere un campione da 10 microlitri della proteina concentrata e diluirlo in un volume di tampone di caricamento proteico due volte superiore per l'analisi. Questo campione rappresenta il campione di eluato TEV.Quindi raccogliere un campione di 10 microlitri di resina e diluirlo in un volume di tampone di carico proteico due volte. Questo campione rappresenta il campione di resina post TEV. Il passo successivo consiste nel far passare la proteina attraverso una colonna di esclusione dimensionale e deve essere utilizzata un'appropriata matrice di filtrazione su gel in base alle dimensioni del complesso di interesse.In questo caso, abbiamo utilizzato una colonna cromatografica di esclusione dimensionale S 200 da 10 x 300 millimetri A per equiparare la colonna cromatografica ad esclusione dimensionale con il tampone di filtrazione su gel. Filtrare la proteina attraverso un filtro da 0,22 micron e caricare il campione nella colonna. Procedi a raccogliere le frazioni man mano che escono dalla colonna.Come passaggio finale, eseguire l'elettroferesi su gel di poliacrilammide SDS SDS o la pagina SDS sui campioni raccolti, nonché le frazioni di filtrazione del gel, l'istone DS SLA uno o HD uno soppressore di silenziamento difettoso tre o SDS tre e syn tre, un dominio di interazione HDAC o syn tre, un HID forma un complesso tornito stabile. La purificazione per affinità del complesso tornito può essere osservata attraverso la pagina SDS. Qui è mostrato il complesso purificato prodotto dal cot, sezionando due litri di cellule.La corsia delle proteine legate mostra il complesso legato alla resina di affinità. Dopo la digestione del TEV, l'etichetta presente sul sin tre A HID viene scissa e si allude al complesso. La resina mostrata qui è un cromatogramma del complesso proteico purificato utilizzando una colonna cromatografica ad esclusione di dimensioni S 200 di 10 x 300 millimetri.Si noti che il complesso puro elude vicino al volume vuoto perché forma un dimero in soluzione. Infine, l'analisi della pagina SDS rivela la proteina purificata nelle frazioni di filtrazione su gel. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare, mantenere e far crescere le cellule HEC due e tre app, nonché di come affinità, purificare e concentrare le proteine.Complesso Le cellule sane saranno essenziali per il successo degli esperimenti, quindi assicurati che vengano coltivate e mantenute nelle loro condizioni e passaggi regolarmente. Non lasciarti scoraggiare dalla coltura dei tessuti. È facile per i biologi strutturali esprimere e purificare grandi quantità di proteine e complessi proteici da cellule di mammifero.

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Espressione della proteina ricombinante di Biologia Strutturale in HEK 293F cellule in sospensione: un approccio nuovo e accessibile (Video) | JoVE Journal

Espressione della proteina ricombinante di Biologia Strutturale in HEK 293F cellule in sospensione: un approccio nuovo e accessibile

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