Raccolta, isolamento e analisi citofluorimetrica di campioni endocervicali umano

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare le cellule mononucleate cervicali da un raschiamento endocervicale utilizzando un pennello citogenico. Una volta isolate, queste cellule possono essere utilizzate in più saggi, tra cui la citometria a flusso, in cui è possibile determinare il fenotipo e la funzione delle cellule immunitarie nel tratto genitale femminile. La raccolta di campioni di spazzolino citogenico e lavaggio cervicale è una procedura non invasiva che deve essere eseguita da un ginecologo o da un medico qualificato.

La lavanda vaginale cervicale viene eseguita per prima dove l'endocervice viene lavata con due mulini di PBS, che viene poi raccolto dal fornice posteriore dopo il lavaggio. L'estremità concava di un raschietto cervicale viene posizionata contro la cervice e ruotata per campionare l'apertura cervicale o l'osso cervicale. Successivamente, lo spazzolino cyto-to-to-spazzolino viene inserito nell'OS endocervicale e ruotato di 360 gradi.

L'uso di una leggera pressione aiuterà a garantire l'assenza di contaminazione ematica del campione. La spazzola cyto nel raschietto viene raccolta in un tubo contenente cinque mil di PBS. Dopo essere stato trasportato su ghiaccio, il campione viene rapidamente vorticoso per dissociare le cellule dal pennello cito.

Una volta lavati i campioni con i terreni, questi vengono filtrati attraverso un filtro di nylon da cento micron. Ciò consente la raccolta di linfociti, monociti e cellule epiteliali dal campione. Le cellule sono ora pronte per essere colorate con anticorpi contro le proteine di superficie e, una volta fissate, possono essere eseguite sul citometro a flusso.

Ti mostreremo come analizziamo i dati risultanti per valutare il fenotipo di entrambe le popolazioni di cellule T CD quattro e CD otto presenti alla cervice. Ciao, sono uno studente di dottorato nel laboratorio del Dr.Keith. La nostra ricerca si concentra sul legame tra l'attivazione immunitaria e la suscettibilità all'HIV, nonché la progressione della malattia.

Poiché la maggior parte delle infezioni da HIV si verifica attraverso rapporti eterosessuali, siamo anche interessati a determinare i correlati della protezione alla trasmissione dell'HIV al tratto genitale femminile. Sfortunatamente, la raccolta di campioni dal tratto genitale può essere molto impegnativa e abbastanza invasiva per i partecipanti allo studio. L'uso di spazzole citogeniche per raccogliere CMC o cellule mononucleate cervicali è un metodo più rapido e semplice rispetto ad altri protocolli come le biopsie.

In questo video, vi mostreremo come isolare e preparare le CMC per l'uso nella citometria a flusso o in altre applicazioni a valle. Dopo la raccolta, la spazzola cyto e il raschietto vengono trasportati in cinque mil di PBS freddo. È importante trasportare i campioni su ghiaccio fino al momento della lavorazione, che non deve essere superiore a due ore dopo la raccolta del campione.

Tutti i campioni contaminati da tracce di sangue in questo momento devono essere esclusi da ulteriori analisi per dissociare le cellule dal pennello cyto. Agitare il tubo alla massima potenza per 45 secondi perché le cellule rimarranno ancora sulla spazzola cyto e sul raschietto. Devono essere rimossi manualmente.

Indossa un paio di guanti nuovi e usa la spazzola cyto per raschiare il materiale rimanente dal raschietto. Dopo averlo gettato in una soluzione di candeggina, usa il pollice e l'indice per rimuovere tutte le cellule rimanenti dallo spazzolino cyto, premendo su e giù sul tubo del falco. Dopo aver gettato lo spazzolino cyto, cambiare i guanti prima di preparare un altro campione, utilizzare una pipetta di trasferimento per lavare i lati della provetta con PBS assicurandosi che tutto il campione sia raccolto.

Adatto a un nylon da cento micron. Filtrare su una provetta Falcon fresca e utilizzare la pipetta per filtrare l'intero volume della soluzione di PBS. Aggiungi cinque mil di supporti RPMI privi di FBS al tubo originale.

Utilizzare la pipetta per lavare accuratamente i lati della provetta al fine di rimuovere il muco aderente o i detriti. Quindi trasferire il supporto attraverso il filtro. Utilizzare un po' del materiale filtrato per lavare il fondo del filtro prima di gettarlo nella candeggina.

Per pellettare le celle isolate. Centrifugare i campioni per 10 minuti a 1500 minuti per evitare che il pellet si stacchi. Ricordarsi di chiudere il freno della centrifuga se le cellule verranno utilizzate per la citometria a flusso.

Preparare la soluzione bloccante necessaria per prevenire il legame di anticorpi non specifici. Durante la fase di centrifugazione, utilizzare 100 microlitri di soluzione bloccante per campione. La soluzione bloccante contiene 93,2 microlitri di fax, lavaggio o PBS più il 2% di FBS, cinque microlitri di FBS e 1,8 microlitri di IgG di topo.

Dopo la centrifuga, la maggior parte dei campioni con cellule vitali avrà un pellet visibile. In alcuni casi, il pellet sarà piuttosto grande. Mentre in altri campioni può essere appena visibile.

La dimensione del pellet non è sempre correlata alla resa delle celle. Prestare attenzione a non disturbare il surnatante, assicurandosi di non disturbare le cellule, risospendere il pellet agitando delicatamente. Lavare le celle con cinque mil di PBS e ripetere la centrifugazione per 10 minuti a 1500.

RRP M con la rottura, ancora una volta, decantare il surnatante e risospendere il pellet come prima. A questo punto, le cellule sono pronte per essere crioconservate o colorate in superficie prima della colorazione Con gli anticorpi fluorescenti, è utile bloccare il legame non specifico incubando le cellule con una soluzione bloccante preparata durante una centrifugazione precedente. Dopo che il pellet della cella è stato risospeso, aggiungere un centinaio di microlitri di soluzione bloccante al campione e mescolare accuratamente.

Le restanti fasi del protocollo possono essere eseguite in una piastra a 96 pozzetti o in una provetta per fax. A seconda delle dimensioni del pellet CMC. Trasferire la soluzione bloccante e la miscela di cellule in un tubo fax.

Incubare il campione per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Durante l'incubazione di 10 minuti, preparare il colorante vitale che verrà utilizzato per discriminare le cellule vive e morte. Durante l'analisi dei dati, preparare il colorante di vitalità secondo il produttore e pretitolarlo secondo necessità.

Assicurati di tenere la miscela di colorante coperta dalla luce fino a quando non è pronta per essere utilizzata. Dopo l'incubazione di 10 minuti, lavare le cellule con 500 microlitri di fax, lavare o PBS con il 2% di FBS, quindi centrifugare per 10 minuti a 1600 RPM. Dopo la centrifuga, decantare il surnatante dal tubo del fax.

Risospendere le cellule mediante agitazione. Ora aggiungi il volume appropriato del colorante vitale che è stato precedentemente preparato. Incubare le celle per 30 minuti a quattro gradi Celsius per assicurarsi che i campioni rimangano coperti dalla luce avvolgendoli in carta stagnola.

Durante questa incubazione, è possibile preparare la miscela master di anticorpi fluorescenti che verranno utilizzati per marcare le cellule. Assicurarsi di pretitolare e convalidare gli anticorpi su campioni di controllo del sangue periferico prima di utilizzarli su CMC. Mescolare gli anticorpi titolati e portare a un volume finale di un centinaio di microlitri per campione.

Con fax, lavare, proteggere tutti gli anticorpi dalla luce durante questi passaggi. Dopo l'incubazione di 30 minuti, lavare nuovamente il campione con 500 microlitri di fax, lavare, centrifugare, decantare e risospendere le cellule come prima. È ora il momento di incubare le cellule con 100 microlitri del cocktail di anticorpi preparato durante l'incubazione precedente.

Ancora una volta, incubare i campioni per 30 minuti a quattro gradi Celsius, assicurandosi che siano protetti dalla luce. Le CMC in incubazione sono ora pronte per essere lavate con 500 microlitri di PBS per l'ultima volta. Centrifugare il campione a 1600 giri/min per 10 minuti.

Dopo la decantazione e la sospensione del pellet, diluire le cellule in un volume finale di 750 microlitri in una soluzione di paraldeide all'1%. Per risolverli, è importante risospendere le cellule in questo grande volume per evitare l'intasamento del citometro a flusso. Anche a questo volume, la provetta del campione può apparire piuttosto torbida.

Mantenere le cellule al buio a quattro gradi Celsius fino a quando non vengono acquisite sul citometro a flusso. Oltre al campione di pennello cyto, raccogliamo regolarmente due mil di lavaggio PBS dalla cervice e dalla vagina. Questo campione viene centrifugato a 1400 giri/min per sette minuti per rimuovere i detriti cellulari dal lavaggio.

Il surnatante rimanente può quindi essere assegnato e congelato a meno 80 gradi Celsius per la futura analisi della concentrazione di proteine solubili. Questi dati possono essere particolarmente utili in combinazione con i dati del fenotipo cellulare ottenuti mediante citometria a flusso. Prima di eseguire l'esempio CMC.

È utile preparare i controlli PBMC per assistere con i tubi di compensazione della corsa di gating, utilizzando perline o singole celle di colorazione per regolare la sovrapposizione spettrale. Acquisisci l'intera provetta CMC per raccogliere tutti gli eventi rispetto ai campioni PBMC. Le CMC mostreranno più doppietti su un grafico di area FSC rispetto all'altezza e potrebbero non mostrare una popolazione di linfociti distintiva come le pbmc.

Dopo aver acquisito i campioni, esportate i file per l'analisi in un programma come FlowJo. Qui mostreremo i componenti principali di una tipica strategia di gating per le cellule T CD quattro positive e CD otto positive derivate dalla CMC. Utilizzare un grafico FSC dell'area rispetto all'altezza su G sui singoletti del campione.

In questo confronto abbinato, si può vedere chiaramente l'aumento del numero di doppiette in un campione di CMC rispetto alle p BMC. Successivamente, il tracciamento di un marcatore fluorescente o FSC in funzione del tempo funge da fase di controllo della qualità. Se eventuali modifiche alla velocità di flusso introducono artefatti nei dati, possono essere rimosse in questo passaggio.

Nella parte superiore, è possibile notare un profilo di fluorescenza costante nel tempo, indicativo di un campione di alta qualità. Di seguito è possibile vedere un campione con più interruzioni e portata, che può essere escluso da ulteriori analisi. L'identificazione della popolazione linfocitaria nei campioni di CMC può essere impegnativa.

L'uso del controllo A-P-B-M-C aiuterà con il posizionamento dell'andatura. Come puoi vedere, alcuni campioni mostrano grandi popolazioni chiare mentre altri campioni mancano di popolazioni di linfociti. Nel complesso, questi campioni dovrebbero essere esclusi.

Anche se ci concentreremo sulle popolazioni di linfociti. È anche possibile eseguire il g sui monociti mediante gating su cellule che mancano dell'espressione di marcatori di lignaggio. È possibile identificare cellule che esprimono combinazioni di cellule dendritiche e marcatori monocitari come CD 16 e CD 11 C.L'inclusione di un marcatore di vitalità o di un colorante è fondamentale per l'analisi della CMC anche su cellule fresche.

Come puoi vedere, la maggior parte dei linfociti CMC sono vitali, ma alcuni campioni contengono alte frequenze di cellule morte che devono essere escluse dall'analisi. Le cellule morte possono assorbire in modo non specifico gli anticorpi e confondere l'analisi dei dati all'interno dell'andatura linfocitaria. La colorazione CD tre dovrebbe essere robusta.

La proporzione di cellule T positive è inferiore e più variabile rispetto ai campioni di PBMC, motivo per cui è fondamentale acquisire l'intero campione di CMC e massimizzare il numero di eventi raccolti. Le popolazioni di cellule T CD quattro positive e CD otto positive possono essere identificate proprio come nei campioni di TBMC. In alcuni campioni di CMC.

Il rapporto CD 4/CD 8 è inferiore a quello osservato nel sangue periferico e alcuni individui presentano un'ampia popolazione di cellule T doppie negative. Dopo aver identificato le popolazioni di cellule T CD quattro positive e CD otto positive, è possibile quantificare l'espressione di numerosi marcatori fenotipici. Sebbene l'espressione di CD 1 61 possa essere rilevata nelle CMC, la popolazione luminosa di CD 1 61 che è evidente nel sangue è assente nel tratto genitale.

Allo stesso modo, l'espressione di marcatori di attivazione come CD 69 e H-L-A-D-R, così come di marcatori come CCR 5 e PD 1 può essere misurata in modo affidabile tra i campioni di CMC e quantificata. L'uso di campioni di pennello citogenico ci permette di caratterizzare sia il fenotipo che la funzione delle cellule immunitarie della mucosa, soprattutto nel contesto delle malattie infettive. Questo non solo ci fornisce una maggiore comprensione dei meccanismi che regolano l'immunologia della mucosa e della riproduzione, ma fornisce anche le basi per lo sviluppo di nuove misure dell'efficacia del vaccino contro la mucosa.