Name: In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in Apc Min / + Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Scopri la dinamica delle cellule mieloidi nei tumori intestinali utilizzando la microscopia confocale a disco rotante nel modello Apc Min/+. Questo metodo permette di osservare in tempo reale le interazioni tra cellule immunitarie e tumore.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vorremmo ringraziare Ying Yu per Apc Min / + topi genotipizzazione. Questo studio è stato sostenuto da fondi provenienti da INSERM e sovvenzioni (CA057621 e AI053194) dal National Institutes of Health.

NOTA: Tutti gli esperimenti su animali sono stati condotti in conformità con le procedure approvate dalla cura e uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC), UCSF. Tutti gli esperimenti di imaging sono procedure non-sopravvivenza e gli animali sono stati sacrificati immediatamente successivo alla fine della acquisizione delle immagini. 1 Generazione di topi NOTA: Apc Min / + topi, che trasportano una mutazione sul gene Apc, sviluppano spontaneamente 50-100 adenomi nel piccolo intestino. <ol><li> Croce Apc Min / + topi con la linea ACTB-ECFP, che esprime ECFP sotto il promotore actina, e in seguito con la linea c-fms-EGFP, che esprime EGFP sotto il c-fms promotore per rilevare le cellule mieloidi. Animali eterozigoti per ACTB-ECFP e c-fms-EGFP sono utilizzati per rilevare la fluorescenza. </li><li> Utilizzare i topi a 3-4 mesi di età per immagine adenomi chiaramente rilevabili. </li></ol> 2 Preparazione di Materiali prima dell&#39;intervento chirurgico NOTA: I dettagli del microscopio set-up sono stati precedentemente descritto 6,7. <ol><li> Microscopio <ol><li> Accendere la coperta di riscaldamento. Accendere il laser ad argon per 488 nm di eccitazione e lo stato solido 405 nm, 561 nm e 640 nm laser. Accendere il microscopio, la centralina disco rotante, la AOTF, l&#39;unità di controllo laser, e il controller della telecamera. </li><li> Aprire l&#39;otturatore microscopio, che trasforma il LED rosso. Accendere il software per computer e la macchina fotografica. </li></ol></li><li> Imaging Platform <ol><li> Assicurarsi che l&#39;inserto fase è pulito. In caso contrario, pulire con acqua e sapone e poi asciugare. </li><li> Prendete due coprioggetto e utilizzare il nastro di laboratorio per garantire la loro sull&#39;inserto. Collocare l&#39;inserto sul palco e pulirlo con cotone imbevuto di alcol. </li><li> Con del nastro di laboratorio, fissare la coperta di riscaldamento sul lato destro del palco. </li><li> Verificare l&#39;integrità della membrana in gomma sul cono naso e cambiarlo se necessary. Posizionare e fissare il cono per la consegna anestesia isoflurano per l&#39;animale utilizzando una garza e nastro di laboratorio. </li></ol></li><li> Isoflurano Anestesia sistema <ol><li> Riempire il serbatoio isoflurano. </li><li> Accendere il vuoto e regolare a 1,2 L / min. </li><li> Aggiungere acqua distillata per il nebulizzatore e collegare il nebulizzatore al sistema di isoflurano. </li><li> Accendere l&#39;analizzatore di ossigeno e collegarlo al sistema di isoflurano. Accendere la bombola di ossigeno e assicurarsi che l&#39;analizzatore di ossigeno mostra 100%. Regolare il flusso di O 2 a 0,2 L / min. </li><li> Accendere il serbatoio di azoto e regolare il flusso a 0,8 L / min. Accertarsi che l&#39;analizzatore di ossigeno mostra 21%. </li></ol></li><li> Preparazione di strumenti di chirurgia e Platform <ol><li> Pulire le 2 coppie di pinze e forbici dissezione con acqua e sapone. </li><li> Accendere il tallone sterilizzatore caldo e lasciarlo raggiungere i 250 ° C. Sterilizzare gli strumenti di chirurgia per 30 sec. Lasciateli raffreddare. </li><li> Posizionare un soaker laboratorio in panchina chirurgia. </li><li> Utilizzare un coperchio di polistirolo come piattaforma chirurgica. Coprire con un pezzo di laboratorio soaker. Preparare un secondo pezzo di laboratorio soaker a cambiare dopo la rasatura con il mouse. </li><li> Posizionare il cono con la linea di anestesia sul coperchio di polistirolo coperto, e collegarlo al coperchio di polistirolo (non sul soaker laboratorio) con del nastro e usare due aghi su entrambi i lati del cono per tenerlo in posizione. </li><li> Assemblare betadine, cotone imbevuto di alcol, garze sterili, colla super, vetrini da microscopio, rasoio elettrico, e 4 pezzi di nastro di laboratorio. </li></ol></li></ol> 3 Preparazione di iniezioni <ol><li> Sotto il cofano, preparare una siringa da insulina (28 G x ½ in) con 7 ml di brodo AF647-coniugato Ly-6G (Gr1) anticorpo (1 mg / ml) in 100 ml di 2.000 kDa rodamina-destrano (4 mg / ml ) per iniezione retro-orbitale. Iniezione retro-orbitale è raccomandato in Apc Min / + topi in quanto l&#39;anemia che si sviluppa in questi animali rende la vene coda difficult per rilevare attraverso la pelle. </li><li> Preparare una seconda siringa da insulina con 1 mg / kg di atropina diluito in 150 microlitri di PBS per via sottocutanea (sc) iniezione prima di imaging per smorzare i movimenti peristaltici dell&#39;intestino. </li></ol> 4 Preparazione della Intestino for Imaging <ol><li> Verificare che la linea di anestesia per la camera di induzione è aperta, e le linee al tavolo operatorio e il microscopio sono chiusi. </li><li> Trasferire l&#39;animale alla camera di anestesia. Chiudere la camera di anestesia e accendere il isoflurano al 4% (con il 21% O 2). </li><li> Quando il mouse respira profondamente e lentamente (dopo 5-6 min), trasferirlo alla fase chirurgica sul suo fianco e iniettare la soluzione di anticorpi Gr1 e / o soluzione di destrano retro-orbitale. </li><li> Aprire la linea anestesia collegati alla piattaforma chirurgica. Chiudere la linea alla camera di anestesia e mettere il mouse sulla sua schiena con il naso nel cono anestesia. </li><li> Ridurre l&#39;isofluranoconcentrazione dal 4% al 2,5%. </li><li> Verificare che il mouse è ben anestetizzato pizzicando la sua zampa e test del riflesso corneale. </li><li> Aggiungi oftalmico lubrificante unguento sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Fissare le membra del mouse per la fase chirurgica con l&#39;aggiunta di nastro laboratorio. </li><li> Rimuovere il pelo dalla superficie ventrale utilizzando un rasoio elettrico. Rimuovere anche i capelli dalla arto posteriore sinistro per posizionare il saturimetro prima dell&#39;acquisizione. Rimuovere il soaker laboratorio dalla fase chirurgica e sostituirlo con uno pulito per evitare la contaminazione dei capelli. </li><li> Disinfettare la superficie ventrale con cotone imbevuto di alcol e betadine. </li><li> Iniettare la soluzione di atropina (da 3.2) SC in un fianco del mouse. </li><li> Fai da 1 cm ventrale incisione mediana attraverso la pelle e il peritoneo da utilizzando forbici e un paio di pinze. Estrarre delicatamente 3-4 cm di intestino e di individuare uno o più tumori all&#39;immagine. </li><li> Prendete un bicchiere microscope scivolo e la posizione un&#39;ansa dell&#39;intestino su di esso con un tumore in alto. </li><li> Aggiungete un po &#39;di colla super per un paio di posizioni lungo l&#39;intestino per fissarlo alla diapositiva. Attendere un minuto per asciugare la colla. Usare un pennarello per disegnare una linea nella diapositiva che punta al tumore, al fine di agevolarne la localizzazione con il confocale. </li></ol> 5 Posizionamento del mouse sullo stage e preparazione per Image Acquisition <ol><li> Rimuovere il nastro di laboratorio dalle membra. </li><li> Aprire la linea di anestesia alla fase microscopio e chiudere quello alla piattaforma chirurgica. </li><li> Trasferire il mouse con attenzione alla fase microscopio con il lato ventrale verso il basso e il naso nel cono di naso. Fissare la linea di anestesia con del nastro di laboratorio. </li><li> Ri-posizionare il mouse e / o la slitta in modo da avere l&#39;intestino al centro di una delle finestre di copertura-scivolato. Nastro delicatamente il vetrino con nastro di laboratorio. </li><li> Fissare la sonda saturimetro per l&#39;arto sinistro del mouse perseguire il suo cuore e livelli di frequenza e di saturazione di ossigeno arterioso respiratorie. </li><li> Coprire il mouse con la coperta di riscaldamento per evitare l&#39;ipotermia. </li><li> Diminuire la concentrazione di isoflurano dal 2,5% al ​​1-1,5% per l&#39;imaging. </li></ol> 6 Acquisizione di immagini mediante μManager Software <ol><li> Aumentare la velocità CSUX a 2.500 giri per migliorare la qualità dell&#39;immagine nelle impostazioni di configurazione. </li><li> Utilizzare il menu a discesa Obiettivo per scegliere 10X 0.5 NA o 20X 0,75 NA Fluar lente dell&#39;obiettivo. </li><li> Scegli il laser 405 nm dal menu a tendina colore. </li><li> Fare clic su Live e regolare la messa a fuoco con il microscopio. </li><li> Fare clic su Automatico per regolare automaticamente le intensità massime e minime in pixel dell&#39;immagine del display in base ai valori dei pixel estremi dell&#39;immagine. Un istogramma di intensità dei pixel dell&#39;immagine display è presentato nel grafico nella parte inferiore della finestra principale. </li><li> Regolare l&#39;esposizione della fotocamera nella finestra Pannello di controllo Piper dacambiando il numero di orologi (Un orologio è 33,333 msec). </li><li> Se il segnale è troppo luminosa con l&#39;esposizione più bassa, diminuire l&#39;intensità del laser con l&#39;unità di controllo del microscopio. </li><li> Verificare l&#39;intensità del segnale di 488 nm, 561 nm e 640 nm linee laser. Regolare intensità del laser con propria unità del laser di controllo (488 nm e 561 nm) o l&#39;unità di controllo del microscopio. </li><li> Nella finestra Multi D Acquisizione, selezionare la casella punti di orario e digitare il numero di punti di tempo e l&#39;intervallo di tempo desiderato. </li><li> Selezionare la casella di Z-stack, scegliete &quot;Z relativo&quot; e definire Z-start e Z-end rispetto alla posizione attuale. NOTA: Per 10X o 20X obiettivo, iniziare con 3 piani Z, 8 micron o 4 micron a parte, rispettivamente. </li><li> Selezionare la casella posizioni multiple (XY) per l&#39;imaging diverse località, quindi fare clic su Modifica elenco posizione, segnare 4-6 posizioni diverse. </li><li> Selezionare la casella Canali e aggiungere canali da New e selezionare laser linee dal menu a discesa e tipe in esposizione per ogni canale (in multipli di 33.333 msec). </li><li> Controllare Salvare le immagini nella finestra &quot;acquisizione Multi D&quot;. </li><li> Selezionare una cartella e tutte le immagini acquisite vengono salvate automaticamente in questa cartella con il prefisso del nome dato. NOTA: Ogni continua acquisizione verrà salvato in una sottocartella separata come file TIFF individuali per ogni fetta Z in ogni colore in ogni punto. </li><li> Salvare tutte le impostazioni, fare clic su Salva impostazioni nella finestra Multi D acquisizione. </li><li> Fare clic su Acquisisci nella finestra Multi-dimensionale di acquisizione per avviare l&#39;acquisizione. </li><li> Se la sonda ossimetro non è utilizzato o smette di funzionare bene (quando l&#39;impulso non è stabile o difficile da individuare), controllare l&#39;efficienza di anestesia ogni 15 minuti durante la procedura di imaging pizzicando la zampa e il controllo del riflesso corneale. Regolare i anestesia se il mouse è sensibile a questi stimoli. </li><li> Dopo l&#39;acquisizione, eutanasia il mouse aumentando la concent isofluranorazione al 5%. Quando non movimenti respiratori sono rilevabili, togliere il mouse dal palco ed eseguire una dislocazione cervicale. </li></ol> 7 Analisi di immagini mediante Imaris Software <ol><li> Conversione in .ims file (supplementari Figura 1A) <ol><li> Aprire il software della fotocamera, fare clic su File quindi Batch Converter. </li><li> Fare clic su Aggiungi file e selezionare il primo file della prima posizione. Ripetere l&#39;operazione per ciascuna posizione. </li><li> Per ogni file caricato, fare clic su Impostazioni e verificare che le impostazioni &quot;T&quot; per il tempo, &quot;c&quot; per i canali e &quot;z&quot; per Z-stack appaiono in questo ordine. </li><li> Salva nella cartella desiderata. Sfoglia e creare un nuovo file convertito. </li><li> Fare clic su Imposta per tutti e Start. </li></ol></li><li> Regolazioni (complementare Figura 1B) <ol><li> Andate nella cartella convertito specifica e aprire il primo file. </li><li> Nella finestra di regolazione del display, regolare il fondosegnale cutoff modificando il numero minimo per ciascun canale, se necessario. </li><li> Se necessario, regolare l&#39;intensità del segnale modificando il numero massimo (minore è il numero massimo, maggiore è l&#39;intensità del segnale). NOTA: Le regolazioni del segnale intensità / contrasto consentono il punto culminante di un comportamento cellulare o di un vano in modo da avere una visualizzazione più piacevole. Questo non cambia il risultato stesso. </li><li> Fare clic su Modifica e proprietà immagine. </li><li> Modificare le x, y, z e valori (per un obiettivo 10X, x e y = 0,712, z = 8 micron, per un obiettivo 20X: x e y = 0.36, z = 4 micron). </li><li> Clicca su tutti equidistanti per regolare punti di tempo. Aggiungere la data di inizio e l&#39;ora di acquisizione iniziare. Aggiungere la data di fine e la fine di acquisizione (complementare Figura 1C). </li><li> Fare clic sul pulsante Play per guardare il film. </li><li> Fare clic su Modifica e Elimina punti di tempo per cancellare le immagini sfocate. </li><li> Per unire due acquisizioni separate Together in un film, andare all&#39;ultimo punto di volta del primo film e fare clic su Modifica&gt; Aggiungi punti di tempo per aggiungere il secondo file. </li></ol></li><li> Salvataggio di un filmato (complementare Figura 1D) <ol><li> Fare clic su Masterizza, selezionare l&#39;estensione mov e un fattore di compressione di 0. </li><li> Fare clic su Salva. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instruction+of+myeloid+cells+by+the+tumor+microenvironment%3A+Open+questions+on+the+dynamics+and+plasticity+of+different+tumor-associated+myeloid+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations.</a> Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).</li>
<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+as+organs%3A+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).</li>
<li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).</li>
<li>Egeblad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1 (2-3), discussion 165 155-167 (2008).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb top97 (2011).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5562 (2011).</li>
<li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. (73), e50088(2013).</li>
<li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li>
<li>Walther, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+prognostic+and+predictive+markers+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer.</a> Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).</li>
<li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annu Rev Pathol. 6, 479-507 (2011).</li>
<li>Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dominant+mutation+that+predisposes+to+multiple+intestinal+neoplasia+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse.</a> Science. 247 (4940), 322-324 (1990).</li>
<li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+intestinal+neoplasia+caused+by+a+mutation+in+the+murine+homolog+of+the+APC+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene.</a> Science. 256 (5057), 668-670 (1992).</li>
<li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li>
<li>McDole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103%2B+dendritic+cells+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li>
<li>Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mucosal+homeostasis+via+single-+and+multiphoton+intravital+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy.</a> J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).</li>
<li>Haigis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+oncogenic+K-Ras+and+N-Ras+on+proliferation%2C+differentiation+and+tumor+progression+in+the+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon.</a> Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).</li>
<li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li>
<li>Janssen, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+and+oncogenic+KRAS+are+synergistic+in+enhancing+Wnt+signaling+in+intestinal+tumor+formation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).</li>
<li>Takaku, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tumorigenesis+in+compound+mutant+mice+of+both+Dpc4+%28Smad4%29+and+Apc+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes.</a> Cell. 92 (5), 645-656 (1998).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo lavoro, un protocollo dettagliato è descritto per la filatura del disco confocale delle dinamiche di cellule mieloidi in tumori intestinali per diverse ore in un animale vivo, ripresa dal lato sierosa dell&#39;intestino. Per evitare l&#39;infiammazione e di avere condizioni fisiologiche ottimali, imaging dell&#39;intestino deve essere fatto sull&#39;organo intatta. Tuttavia, l&#39;imaging dal lato sierosa dell&#39;intestino è impegnativo, poiché la luce deve passare attraverso dive...

Prove schiaccianti ora dimostra che il microambiente tumorale, costituito da popolazioni cellulari eterogenee, inclusi i fibroblasti, cellule endoteliali, cellule immunitarie e infiammatorie, matrice extracellulare e fattori solubili, svolge un ruolo cruciale nella iniziazione e progressione dei tumori solidi contribuendo a quasi tutti caratteristiche di cancro 1. Infatti, durante la progressione del tumore, ci sono costanti interazioni dinamiche tra cellule tumorali trasformate e le cellule stromali che si evolvono per generare un microambiente favorevole alla malignità 2. Tra le cellule immunitarie che infiltrano il microambiente tumorale, le cellule mieloidi sono i più abbondanti 3. Composto da macrofagi associati al tumore (TAM), derivati ​​da cellule mieloidi soppressore (MDSCs), cellule dendritiche (DC) e neutrofili (PMN), le cellule mieloidi sono reclutati dal midollo osseo e progressivamente si infiltrano i tumori, rilasciando citochine, fattori di crescita e proteasi che può promuoverela crescita del tumore e la diffusione 4. Il crosstalk tra le cellule tumorali e le cellule mieloidi è complessa ma dinamica. Così la comprensione della natura delle loro interazioni è fondamentale per determinare il motivo per cui queste cellule favoriscono la progressione del cancro, invece di partecipare a una risposta immunitaria anti-tumorale, e può aiutare a trovare nuovi obiettivi per controllarlo. L&#39;osservazione diretta al microscopio intravitale fornisce informazioni sulle dinamiche delle cellule all&#39;interno dei tessuti di topi vivi 5. A quattro colori, multi-regione, disco rotante micro-lensed sistema confocale è stato progettato per studiare le cellule stromali all&#39;interno di tumori mammari 6. Questo approccio consente di imaging continuo a lungo termine e comprende diversi vantaggi, come (a) acquisizione immagini rapide per ridurre al minimo gli artefatti da movimento, (b) l&#39;anestesia-lungo termine, (c) l&#39;acquisizione di quattro colori di seguire diversi tipi di cellule, (d) l&#39;etichettatura fluorescente delle diverse componenti tumorali, e (e) l&#39;osservazione di diversi microambienti tumorali within lo stesso mouse per evitare il mouse per variabilità del mouse 7-9. Con questa tecnologia, i comportamenti cellulari diversi sono stati riportati nel virus del tumore mammario (MMTV) promotore-driven polioma middle T oncogene (PyMT) modello che mostra le fasi progressive della tumorigenesi. Regolamentazione linfociti T (Tregs, visualizzati dal transgene Foxp3 EGFP) migrare preferenzialmente in prossimità di vasi sanguigni che il DCS (CD11c-DTR-EGFP), fibroblasti carcinoma-associata (Fsp1 + / + -EGFP) e cellule mieloidi (c-fms -EGFP) presentano elevata motilità alla periferia del tumore rispetto all&#39;interno della massa tumorale. Nella condizione di ipossia sistemica acuta, le cellule migrate in modo diverso: Tregs fermare la migrazione al contrario di cellule mieloidi che continuano a muoversi 6. Inoltre, nello stesso modello di topo, è stato dimostrato che le variazioni di sensibilità doxorubicina con stadio tumorale, distribuzione del farmaco è legato alla risposta ai farmaci, e doxorubicinatrattamento porta al reclutamento CCR2-dipendente delle cellule mieloidi ai tumori. Così, l&#39;imaging dal vivo può essere utilizzato anche per acquisire conoscenze in risposta ai farmaci in situ e la biologia di chemioresistenza 10,11. Poliposi adenomatosi coli (APC) mutazioni del gene comunemente si verificano in adenomi colorettali umani e carcinomi 12 e mutazione di una singola copia dei risultati gene APC nella poliposi adenomatosa familiare (FAP), che conferisce un altissimo rischio di cancro al colon 13. Il ceppo di topi Apc Min / + porta una mutazione troncamento al codone 850 del gene Apc e si sviluppa spontaneamente più adenomi intestinali tutto il piccolo intestino da 14 a 16. A lungo termine intravitale imaging dell&#39;intestino è impegnativo a causa della invasività della procedura, poiché l&#39;apertura della cavità peritoneale è necessaria per l&#39;accesso a livello intestinale. A breve termine l&#39;imaging dal vivo studies sono stati precedentemente pubblicati sulla salute dell&#39;intestino 17,18, ma l&#39;osservazione diretta a lungo termine dei tumori intestinali non è stato riportato. Una procedura chirurgica è stato progettato e perfezionato per visualizzare i tumori attraverso la superficie sierosa dell&#39;intestino, utilizzando il sistema di microscopia a disco rotante intravitale precedentemente utilizzato per i tumori della mammella immagine 6,10. In questo lavoro, un protocollo è descritto che permette di seguire il comportamento delle cellule mieloidi all&#39;interno dei tumori del piccolo intestino utilizzando Apc Min / + topi.

<table><tbody><tr><td>ApcMin/+ topi</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>topi ACTB-ECFP Jackson</td><td>Laboratory</td><td>3773</td><td></td></tr><tr><td>cfms-EGFP topi</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>2.000 kDa Dextran, coniugato con rodamina</td><td>Invitrogen</td><td>D7139</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>29450</td><td></td></tr><tr><td>Azoto</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ossigeno</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>UCSF impianto</td><td></td><td></td>di coltura cellulare</tr><tr><td>Soluzione tampone Soluzione</td> cellulare <td>UCSF impianto</td><td></td><td></td>di coltura cellulare</tr><tr><td>Anti-topo Ly-6G (GR1) AF647</td><td>UCSF Nucleo di</td><td></td> anticorpo monoclonale <td>Stock 1 mg/ml. Utilizzare a 7 &mu; g/topo</td></tr><tr><td>Atropina</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td>Uso a 1 mg/kg di topo</td></tr><tr><td>Salviette imbevute di alcol</td><td>Becton Dickinson</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>28 G x 1/2 pollice siringa da insulina</td><td>Becton Dickinson</td><td>329465</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura Remium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td>24x50-1</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coperta termica</td><td>Gaymar Industrie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore a perline calde</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>18000-45</td><td>Accendere 30 minuti prima dell'uso</td></tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone Microscopia elettronica da 6 pollici</td><td>Scienze</td><td>72310-10</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di anestesia</td><td>Supporto per anestesia</td><td></td><td></td>Summit</tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Zeiss Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Inserto da palco</td><td>Strumentazione</td><td></td><td></td>Sientific applicata</tr><tr><td>Ossimetro Ox del topo, software e sensori</td><td>Starr Life Sciences</td><td>Nebulizzatore MouseOx</td><td></td></tr><tr><td></td> Supporto <td></td><td></td>per <td>anestesia</td></tr><tr><td>Summit Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&mu; Manager</td><td>Vale lab, UCSF</td><td></td><td>Software open source</td></tr><tr><td>Telecamera ICCD</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR-Mega-10EX S-30</td><td></td></tr><tr><td>Disco rotante confocale sacan-head</td><td>Yokogawa Corporation</td><td>CSU-10b</td><td></td></tr></tbody></table>

in tempo reale imaging di cellule mieloidi dynamics in apc min / + intestinale tumori da spinning disk microscopia confocale

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Cellule mieloidi sono i più abbondanti cellule immunitarie all&#39;interno di tumori e hanno dimostrato di promuovere la progressione tumorale. Le moderne tecniche di imaging intravitale permettono l&#39;osservazione del comportamento cellulare dal vivo all&#39;interno dell&#39;organo, ma può essere difficile in alcuni tipi di cancro a causa di organo e tumore accessibilità, come l&#39;intestino. L&#39;osservazione diretta dei tumori intestinali non è stato segnalato in precedenza. Una procedura chirurgica qui descritta permette l&#39;osservazione diretta delle dinamiche di cellule mieloidi all&#39;interno dei tumori intestinali nei topi dal vivo utilizzando topi transgenici reporter fluorescente e traccianti iniettabili o anticorpi. A questo scopo, è stato utilizzato un quattro-colore, multi-regione, disco rotante microscopio confocale micro-lensed che consente a lungo termine di imaging continuo con l&#39;acquisizione rapida di immagini. Apc Min / + topi che sviluppano più adenomi nel piccolo intestino è attraversato con i topi c-fms-EGFP per visualizzare le cellule mieloidi e con i topi ACTB-ECFPper visualizzare le cellule epiteliali intestinali delle cripte. Sono inoltre descritte le procedure per etichettare diversi componenti tumorali, come i vasi sanguigni e neutrofili, e la procedura per il posizionamento del tumore per l&#39;imaging attraverso la superficie sierosa. Filmati time-lapse compilati da diverse ore dell&#39;imaging consentono l&#39;analisi del comportamento delle cellule mieloidi in situ nel microambiente intestinale.

Utilizzando filatura disco microscopia confocale, tessuti non tumorali e tumorali nel piccolo intestino di Apc Min / +; ACTB-ECFP; topi c-fms-ECFP possono essere visualizzati dalla superficie sierosa. Dopo l&#39;imaging, software della fotocamera viene utilizzato per analizzare e regolare l&#39;acquisizione (Figura supplementare 1). Dopo endovenosa (iv) l&#39;inserimento di fluorescenza 2.000 kDa destrano-rodamina e un anticorpo coniugato Ly-6G 647, vasi sanguigni e...

Utilizzando topi reporter transgenici ed etichette fluorescenti iniettabili, la microscopia confocale a disco rotante intravitale a lungo termine consente la visualizzazione diretta del comportamento delle cellule mieloidi nell'adenoma intestinale nel modello di cancro colorettale ApcMin/+.

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in Apc Min / + Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare la dinamica delle cellule mieloidi all'interno dei tumori intestinali di un animale vivo. Ciò si ottiene iniettando prima molecole fluorescenti e atropina in un topo PC min. Nella seconda fase, l'intestino viene preparato per l'imaging e il topo viene posizionato sul tavolino del microscopio.Nella fase finale, vengono acquisite le immagini del tumore all'interno dell'animale vivo, alla fine il disco rotante confocale. La microscopia può essere utilizzata per visualizzare il comportamento delle cellule mieloidi all'interno dei tumori di topi vivi per diverse ore. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro, ad esempio qual è il ruolo delle cellule umane nel cancro del colon-retto?Iniziare utilizzando del nastro adesivo da laboratorio per fissare due vetrini coprioggetti sull'inserto del tavolino della piattaforma di imaging del microscopio. Quindi posizionare l'inserto sul tavolino e pulirlo con salviettine imbevute di alcol. Quindi, ruotare lo sterilizzatore a cordoni caldi a 250 gradi Celsius, quindi sterilizzare gli strumenti chirurgici per 30 secondi mentre gli strumenti si raffreddano.Posiziona questo coperchio in polistirolo tra due bagnanti da laboratorio sul banco operatorio. Quindi, quando il topo respira profondamente e lentamente, posizionare l'animale sul palco chirurgico sul fianco e retroorbitale. Iniettare il filamento DExT, l'asta Domine e la soluzione anticorpale GR one.Dopo l'iniezione, girare il topo sulla schiena con il naso nel cono di anestesia e utilizzare un rasoio elettrico per rimuovere i peli dalla superficie ventrale e dall'arto posteriore sinistro dell'animale. Quando il pelo è stato rimosso, posizionare un nuovo impregnante da laboratorio sul tavolino chirurgico per evitare la contaminazione del pelo, quindi disinfettare la superficie ventrale dell'animale con salviettine imbevute di alcol e Betadine. Successivamente, per via sottocutanea, iniettare la soluzione di atropina in un fianco del topo, quindi utilizzare le forbici e un paio di pinze per praticare un'incisione ventrale di un centimetro attraverso la pelle e il peritoneo.Estrarre con cautela tre o quattro centimetri di intestino e identificare uno o più tumori da visualizzare. Quindi posizionare l'ansa dell'intestino contenente il tumore di interesse sopra una fessura del microscopio in vetro. Posizionare alcune gocce di super colla lungo l'intestino per attaccarlo al vetrino dopo che la colla si è asciugata per un minuto, utilizzare un pennarello per tracciare una linea sul vetrino che punti al tumore per facilitarne la localizzazione durante l'imaging.Trasferire ora con cautela il topo sul tavolino del microscopio con il lato ventrale rivolto verso il basso e il naso nel cono del naso. Fissare la linea di anestesia con nastro adesivo da laboratorio, quindi riposizionare la configurazione in modo che l'intestino si trovi al centro di una delle finestre scivolate del coperchio. Fissare delicatamente il vetrino con del nastro adesivo e collegare la sonda dell'ossimetro all'arto sinistro del mouse per seguirne la frequenza cardiaca e respiratoria e i livelli di saturazione di ossigeno arterioso.Quindi coprire il mouse con la coperta riscaldante per evitare l'ipotermia e ridurre la concentrazione ISO di fluoro per l'imaging. Infine, nella finestra di acquisizione multidimensionale, fare clic su acquisisci per avviare l'acquisizione. Al termine dell'acquisizione, il filmato viene registrato e salvato utilizzando un software Mars.Utilizzando la microscopia confocale a disco rotante, tessuti non tumorali e tumorali. Nell'intestino tenue di un PC min i topi possono essere visualizzati dalla superficie sierosa dopo l'iniezione endovenosa di destrano fluorescente rodina e un antigene linfocitario a sei complessi locus G 6 47 coniugato anticorpo, vasi sanguigni e cellule polimorfonucleate possono essere rilevati rispettivamente. Si possono facilmente osservare anche patch di PI che sono aggregazioni di tessuto linfoide e piene di cellule mieloidi.I crips dell'intestino tenue sono circondati da vasi sanguigni e cellule mieloidi. Il tessuto tumorale è spesso più vascolarizzato e più infiltrato dalle cellule mieloidi, e la struttura dei Crips è meno ben organizzata a seconda delle dimensioni del tumore. L'espressione dell'actina ECFP da parte dello strato muscolare liscio può talvolta rendere difficile ottenere una messa a fuoco nitida dell'epitelio intestinale come si può osservare in questa immagine, la dinamica delle cellule mieloidi nei tumori può essere seguita in tempo reale per alcune ore come dimostrato in questo filmato, mentre i neutrofili positivi G one circolano nei vasi sanguigni e pattugliano i tessuti.Altre cellule mieloidi, per lo più macrofagi, circondano i Crips e sono meno modali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare le dinamiche delle cellule mieloidi all'interno dei tumori intestinali negli animali vivi.

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Mostriamo il metodo per l'esecuzione di microscopia intravitale della milza con GFP parassiti della malaria transgenici e la quantificazione della mobilità parassita e del flusso sanguigno all'interno di questo organo.

Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

Questo video descrive l'imaging di cellule T CD8 infiltranti il tumore residenti marcate con anticorpi accoppiati in fluorescenza all'interno di fette di tumore polmonare umano. Questa tecnica consente di analizzare in tempo reale la migrazione delle cellule T CD8 utilizzando la microscopia confocale.

Analisi in tempo reale della migrazione delle cellule T residenti in diverse regioni tumorali mediante microscopia confocale

L'immunità adattativa è controllata da 'sinapsi immunologiche' dinamiche formate tra le cellule T e le cellule presentanti l'antigene. Questo protocollo descrive i metodi per studiare le cellule endoteliali sia come APC fisiologiche poco studiate sia come un nuovo tipo di "modello di APC cellulare planare".

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Descriviamo un protocollo per monitorare il comportamento dei neutrofili e dei monociti nelle vene mesenteriche in condizioni stazionarie e infiammatorie utilizzando la microscopia confocale intravitale su topi anestetizzati.

Imaging neutrofili e monociti in mesenterica Veins intravitale Microscopia su topi anestetizzati in tempo reale

I meccanismi che regolano la motilità interstiziale di cellule CD4 T effettrici in siti di infiammazione sono relativamente sconosciuti. Presentiamo un approccio non invasivo per visualizzare e manipolare cellule CD4 T vitro -primed nel derma dell'orecchio infiammate, permettendo studio del comportamento dinamico di queste cellule in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

Imaging di entrambi, l'isolato della membrana plasmatica e il volume intracellulare circostante, sarà presentato un microscopio avanzato che consentono veloce e ad alta risoluzione. L'integrazione di filatura disco e totale microscopia di fluorescenza di riflessione interna in un'unica configurazione permette esperimenti dal vivo imaging al prezzo di acquisizione alta fino a 3,5 s per serie di immagini.

Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco

Descriviamo un metodo per visualizzare gli IEL con etichettatura GFP utilizzando l'imaging intravitale dell'intestino piccolo murino mediante microscopia confocale del disco rotante invertita. Questa tecnica consente il monitoraggio delle cellule vive all'interno della mucosa fino a 4 h e può essere utilizzata per studiare una varietà di interazioni immuno-epiteliali intestinali.

Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

Qui presentiamo un metodo robusto e dettagliato di analisi delle dinamiche dei microtubuli nelle cellule sincronizzate nella prometafase utilizzando la microscopia confocale del disco di filatura a cellule vive e l'elaborazione delle immagini basata su MATLAB.

Misurazione della microtubule Dynamics mediante microscopia disco rotante in spindle mitotici monopolari

Presentiamo un protocollo per l'impianto chirurgico di una finestra ottica stabilizzata a permanenza per l'imaging a risoluzione subcellulare del pancreas murino, consentendo studi seriali e longitudinali del pancreas sano e malato.

Finestra stabilizzata per l'imaging intravitale del pancreas murino

Il protocollo presenta un nuovo strumento per semplificare l'imaging intravitale utilizzando la microscopia confocale invertita.

Approccio semplificato di imaging intravitale per il monitoraggio a lungo termine della dinamica del tessuto epiteliale su un microscopio confocale invertito

Questo articolo dimostra un metodo per visualizzare e quantificare la motilità della microglia e il contatto con i punti postsinaptici nella retina utilizzando la microscopia confocale a disco rotante.

Imaging dal vivo e caratterizzazione della dinamica della microglia e delle interazioni con le sinapsi nella retina murina malata

Scopri la dinamica delle cellule mieloidi nei tumori intestinali utilizzando la microscopia confocale a disco rotante nel modello Apc Min/+. Questo metodo permette di osservare in tempo reale le interazioni tra cellule immunitarie e tumore.

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in Apc^{Min / +} Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale

Esplora altri video