Name: Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Scopri come isolare assoni reticulospinali dalla lampreda per registrare correnti di calcio dai terminali presinaptici funzionali. Questo metodo elettrofisiologico permette di studiare direttamente i meccanismi di rilascio dei neurotrasmettitori.

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Questo lavoro è stato supportato da NINDS, RO1NS52699 e MH84874 to SA. 
Vorremmo ringraziare il Dr. Dave Featherstone (Dipartimento di Scienze Biologiche, Università dell'Illinois a Chicago) per averci fornito la colla per sutura utilizzata nel lavoro di immunoistochimica. Ringraziamo Michael Alpert per i suoi commenti e la correzione di bozze del manoscritto.

1 Preparazione di Poly-D-lisina Hydrobromide <ol><li> Preparare 1 mg / ml di poli-D-lisina bromidrato in 0,1 M tampone borato (pH 8,5). </li><li> Aliquota e conservare a -20 ° C. </li></ol> Rivestimento 2 Poly-lisina di vetrini Nota: Eseguire tutte le operazioni di pulizia e di rivestimento in una camera di flusso laminare. <ol><li> Luogo coprioggetto in una capsula di Petri contenente 1 N acido cloridrico (HCl) per 2 ore. </li><li> Aspirare tutto HCl e risciacquare con il 70% di etanolo (EtOH) 2-3x. </li><li> Lasciare in 70% EtOH per 1 ora. </li><li> Aspirare tutto il 70% EtOH e risciacquare con il 100% EtOH 2-3x. </li><li> Lasciare in 100% EtOH per 2 ore. Aspirare tutto EtOH. </li><li> Asciugare con carta da filtro e asciugare all'aria per pochi secondi. </li><li> Luogo O / N in 1 mg / soluzione poli-lisina ml. </li><li> Sciacquare coprioggetto giorno dopo con acqua Millipore 4-5x. </li><li> Aria secca poli-lisina rivestite coprioggetto su rulli di vetro in un piatto pulito Petri. </li><li> Per immunohistochemistry, utilizzare 35 x 10 mm Petri coperchi piatto. Preparare sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) fiancheggiata piatti versando PDMS (elastomero e induritore 10: 1 in peso) nella capsula ad uno spessore di 0,3 cm, permettono di fissare a 30 ° CO / N. Una volta che questo è impostato, tagliare 2 cm di 1 cm incastonate nelle PDMS. Pulire e ricoprire il riquadro con poli-lisina seguendo la stessa procedura di cui sopra per coprioggetto. </li><li> Conservare coprioggetti e piatti rivestiti di poli-lisina coperti all'interno della camera a flusso laminare fino al momento dell'uso (fino a 2 settimane, ma ottenere i migliori risultati adesive preparando periodicamente ogni 3-4 giorni). </li><li> Preparare un blocco PDMS, al pin del midollo spinale nel affettatrice tessuto vibrante. Mix Elastomero Elastomero A e B 1: 1 in peso. Versare in una piastra di Petri di 100 x 15 mm e permettono di impostare O / N a 30 ° C. Tagliare un pezzo rettangolare di PMDS e la colla alla piastra di base per affettare con colla epossidica. Lasciare che la colla per impostare fissa i PDMS in atto e affettare più sezioni sottili sulla superficie per ottenere un appartamentosuperficie al pin del tessuto su. </li></ol> 3. acuta dissociazione della Lampreda Spinal Cord cedere isolati reticulospinal assoni <ol><li> Anestetizzare un ammoecoete o adulto lampreda (Petromyzon marinus) con tricaine metansulfonato (MS-222, 100 mg / L). Aggiungere anestetico in acqua, in una tazza di plastica coperto da un coperchio, contenente la lampreda di essere sacrificato. </li><li> Decapitare lampreda a freddo (4 ° C), soluzione di Ringer avente la seguente composizione (in mM): 130 NaCl, 2.1 KCl, 2,6 CaCl 2, 1.8 MgCl 2, 4 HEPES, 4 destrosio (pH 7.6, osmolarità 270 mOsm) e rimuovere il corpo muscoli della parete per esporre la superficie dorsale del midollo spinale. </li><li> Rimuovere meninge primitiva dalla superficie dorsale del midollo spinale con una pinza sottile. Non rimuovere ventrale meninge primitiva in questa fase. </li><li> Tagliare midollo spinale in 1 cm di lunghezza pezzi. </li><li> Pin un pezzo del midollo spinale utilizzando sottili perni di insetti, lato dorsale rivolta verso l'alto, su un PDMS affettare pla di base foderatote (vedi 2.12) in un tessuto vibrante camera di affettatrice contenente soluzione ghiacciata di Ringer. </li><li> Rimuovere una sezione centrale della colonna dorsale del midollo spinale mediante tranciatura lungo l'asse rostro-caudale con la lama, lasciando intatte le sezioni di colonna dorsale sul rostrale e caudale finisce per servire come maniglie durante il processo di dissociazione Figura 2a e la Figura 2b. Utilizzare l'impostazione più lenta della velocità che permette affettare e un ambiente profondità che rimuove solo la colonna dorsale lasciando sottostante colonna assone reticulospinal Figura 2b non danneggiato. </li><li> Incubare pezzi del midollo spinale a fette a temperatura ambiente per 45 minuti in un cocktail di 1 mg / proteasi ml (tipo XIV da Streptomyces griseus) e 1 mg / collagenasi ml di preparato (tipo IA da Clostridium histolyticum) in soluzione di Ringer (adattato da El Manira &amp; Bussières 1997 17). </li><li> Pezzi del midollo spinale Pin enzimi trattati con perni sottili in un PDMS allineati Petri dish Contavorazio freddo (4 ° C), soluzione di Ringer. </li><li> Rimuovere ventrale meninge primitiva con una pinza sottile. </li><li> Tagliare tratti laterali del midollo spinale con una lama di bisturi a metà della sezione dorsale fette lasciando la colonna centrale di assoni reticulospinal intatti nel midollo spinale Figura 2d. </li><li> Mettere una goccia di olio di immersione sulla lente. </li><li> Posizionare il coprioggetto poli-lisina rivestito (figura 3a, pezzo superiore, rettangolo rosso) nella fessura della figura camera di registrazione 3 e applicare grasso per vuoto a tutti i bordi (spazio tra rettangoli rossi e blu in figura 3a, per facilitare un sigillo. Vite la parte superiore in posizione. Inserite la camera nel riquadro sulla piattaforma di registrazione. </li><li> Aggiungere la soluzione di Ringer nella camera di registrazione con una pipetta Pasteur. </li><li> Collegare il tubo di efflusso della bombola a pressione contenente soluzione antigelo per il tubo di ingresso del dispositivo di raffreddamento termoelettrico. Collegare il output tubo del dispositivo di raffreddamento termoelettrico al fine di ingresso della camicia di raffreddamento esterno e l'estremità di uscita al serbatoio Figura 3b. </li><li> Mettete un pezzo di midollo spinale in un momento in camera di registrazione e separare delicatamente il midollo spinale mantenendo lungo il vetrino in ogni momento utilizzando pinze rivestite in teflon fino assoni sono isolati Figura 2e e 2f Figura. </li><li> Portare la temperatura della soluzione di registrazione a 10 ° C facendo passare l'(azoto gassoso viene spinto nella bottiglia) pressurizzato soluzione antigelo (per spostamento), tramite il dispositivo di raffreddamento termoelettrico, attraverso la camicia di raffreddamento esterno della camera di Figura 3b registrazione. </li><li> Consenti assoni di recuperare per 1 ora posto dissociazione a 10 ° C. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400"> (A) la rimozione della colonna dorsale. La freccia indica la direzione di taglio del tessuto. Le corna dorsali sono contrassegnati da l'alfabeto D (font color rosso), mentre le corna ventrali per l'alfabeto V (font color rosso). (B) colonna Dorsale rimosso nella porzione centrale del midollo spinale esponendo gli assoni reticulospinal (linee verdi ). Le corna ventrali, che rimangono intatti dopo il processo di taglio, sono contrassegnati da l'alfabeto V (font color rosso). (C) 45 min trattamento con proteasi e collagenasi enzimi cocktail (1 mg / ml). (D) Taglio delle vie laterali del midollo spinale; che indica la posizione, la direzione e la portata del taglio laterale. (e) dissociazione meccanica del midollo spinale. Le frecce indicano la posizione delle pinze e la direzione della forza di separazione durante la dissociazione. (F) representative esempio di dissociato preparazione assone reticulospinal. Le frecce verdi indicano le regioni di assoni reticulospinal acutamente dissociate, senza alcun processo post-sinaptici. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500"> Figura 3 Schema di registrazione da camera per esperimenti di elettrofisiologia. Dimensioni previste sono in pollici. Rettangolo rosso mostrato nel diagramma basepiece (a) indica il posizionamento del coprioggetto nella scanalatura coprioggetto in basepiece. La regione tra il rettangolo rosso e blu, illustrato nel diagramma basepiece (a) è dove viene applicato il grasso alto vuoto. (B) mostra la camera di registrazione assemblato. 4. etichettatura e identificazione di terminali presinaptici con FM 1-43 <ol><li> Etichetta terminali presinaptici, incorporando FM 1-43 in vesicles durante synaptic eso-endocitosi durante l'alta K + depolarizzazione. Profumato preparato con 5 mM FM 1-43 (in soluzione 5 ml di Ringer contenente KCl 30 mM). </li><li> Profumato preparato con 1 mg / ml Advasep-7 (in 5 ml di soluzione di Ringer) per rimuovere l'eccesso di colorante FM) 18. </li><li> Profumato preparazione con la soluzione di Ringer per 15 min a dilavamenti qualsiasi colorante Remant e la Advasep. </li><li> Immagine con 100 X obiettivo a immersione in olio (NA 1,25) su un microscopio a fluorescenza invertito, in combinazione con una fotocamera digitale CCD e acquisizione delle immagini software micromanager, utilizzando protocolli di imaging di fluorescenza standard. </li><li> Identificare i terminali presinaptici fluorescente a bersaglio per la registrazione Figura 4c e 4d Figura. </li></ol> 5. immunoistochimica di isolati reticulospinal assoni <ol><li> Riempire piatto inserto (sezione Protocol 2.10.) Con bivalente-ione (Ca 2 + e Mg 2 +) gratisSoluzione di Ringer. </li><li> Realizzare pipette di patch in una micropipetta estrattore P-87. Mettere una piccola quantità di colla sutura ad una estremità del kit di poli-lisina utilizzando una pipetta di patch (1,5 millimetri di vetro di diametro esterno) e di aspirazione (utilizzando un tubo in silicone 0,89 millimetri di diametro interno con una punta micropipetta fissato all'estremità di aspirazione). </li><li> Effettuare dissociazioni utilizzando la stessa procedura di cui alla sezione Protocollo 3 Figura 2. Posizionare un'estremità del midollo spinale sulla colla sutura e premere delicatamente con una pinza ad aderire con forza alla superficie. Mettere una goccia di colla sutura all'altra estremità del riquadro e allungare delicatamente il midollo spinale fino assoni sono dissociate e aderire l'estremità del midollo spinale libero trascinandola delicatamente sopra la colla sutura. Fissare in posizione da pressatura soffice verso il basso con le pinze. </li><li> Bivalente Libero scambio soluzione di Ringer con la soluzione regolare di Ringer da perfusione. </li><li> Consenti assoni di recuperare per 20 min dopo dissociation a 10 ° C. </li><li> Fissare assoni dissociate in 4% paraformaldeide (PFA) {preparato in tampone fosfato salino (PBS, (mm) 137 NaCl, KCl 2.7, Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1.8, pH 7,4)} per 20 min. Filtrare la soluzione PFA prima dell'uso passando attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron. </li><li> Lavare il PFA mediante perfusione 0,1 M glicina (in PBS) per 10 min. </li><li> Incubare in 0,1% Triton-X (in PBS) per 10 min. </li><li> Lavare mediante perfusione PBS per 20 min. </li><li> Bloccare con latte non grasso 5% (in PBS) per 6 ore a 4 ° C. </li><li> Aggiungi in anticorpo primario per VGCC di interesse (1: 200 diluizione in PBS) e incubare per 20 ore a 4 ° C. </li><li> Lavare mediante perfusione PBS per 20 min. </li><li> Bloccare con latte non grasso 5% (in PBS) per 10 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungi a anticorpo secondario (1: 400 diluizione in PBS) e incubare al buio per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Lavare mediante perfusione con PBS per 20 min. </li><li> Blocco con 1% di siero bovino Albumin (in PBS) per 20 min. </li><li> Aggiungi a Alexa Fluor 488 falloidina (5 unità / ml concentrazione di lavoro; magazzino preparato in metanolo 200 Unità / ml). </li><li> Lavare mediante perfusione con PBS per 20 min. </li><li> Immagine con obiettivo a immersione 100X acqua sul microscopio confocale. </li></ol> 6. elettrofisiologiche di registrazione <ol><li> Realizzare pipette di patch di vetro alluminosilicato (resistenza pipetta 2-5 MW) in una micropipetta estrattore P-87. Progettazione di patch pipetta in modo che la punta della pipetta abbraccia tutto il diametro del terminale presinaptico. </li><li> PDMS pipette di patch cappotto immergendo la pipetta di patch sotto pressione 50-60 psi in PDMS 23 (allegare un tubo di silicone, 0,89 millimetri di diametro interno, collegato ad una bombola di gas di azoto, al back-end della pipetta di patch) e asciugare con un calore pistola. In alternativa, cappotto manualmente la pipetta con PDMS, applicando il rivestimento più vicino alla punta più possibile, sotto un microscopio composto. </li><li> Fuoco pipette di patch smalto utilizzando un microforge (un filamento di platino su misura montata sul palco di un microscopio composto). </li><li> Identificare assoni isolate dimostrano terminali presinaptici etichettati da microscopia a fluorescenza. </li><li> Riempire soluzione di registrazione (progettata per isolare Ca 2 + correnti; 10 mM CaCl 2 o 90 mm ​​BaCl 2 come portatori di carica, tamponata con HEPES pH 7,6, osmolarità 270 mOsm) nella pipetta di patch con una siringa. </li><li> Inserire la pipetta di patch nel supporto pipetta e la posizione sopra il bagno utilizzando un manipolatore MP225 motorizzato. Abbassare delicatamente la pipetta di patch nel bagno e la posizione contro la faccia di un terminale presinaptico fluorescente identificato. </li><li> Anticipo la pipetta di patch lentamente fino di contatto con la membrana. A questo punto, ottenere una tenuta gigaohm da aspirazione delicata bocca attraverso un tubo collegato al titolare pipetta. </li><li> Per ottenere i bassissimi livelli di rumore di fondo necessarie per la registrazione di singolo canale Ca 2 + correnti, utilizzare un Axopatch 200B con un headstage raffreddata per le registrazioni. Dati campione a 20-50 kHz e filtro con un filtro di Bessel 5 kHz. Eseguire l'acquisizione di dati tramite un Axograph X. </li><li> Utilizzare un protocollo standard di passo, in incrementi di 10 mV come stimolo. Incorporare un pre-impulso nel protocollo, che precede il protocollo passo, al fine di garantire l'attivazione massima di canali del Ca 2 +. Incorporare un 10 mV perdita passo verso il protocollo step per la post-analisi sottrazione delle correnti di fuga. </li></ol>

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse da divulgare.

Il nostro protocollo dissociazione è significativa cedendo isolati assoni reticulospinal privi di postsinaptico proiezioni figura 2f, ma che tuttavia mantengono funzionale presinaptica terminali Figura 4c e 4d Figura. L&#39;assenza di processi di post-sinaptici che si oppongono al terminale presinaptico registrazione consente l&#39;accesso diretto alla membrana di rilascio presinaptico faccia a terminali presinaptici singoli, in precedenza non possibile in sinapsi centr...

Trasmissione sinaptica è un processo estremamente rapido e preciso. Azione potenziale invasione del terminale presinaptico porta all'apertura dei VGCCs situati nella membrana di rilascio viso, il conseguente aumento della presinaptico Ca 2 + che funge da innesco per la fusione della vescicola e neurotrasmettitore rilascio 1. Tutti questi passaggi si verificano all'interno di centinaia di microsecondi 2, e quindi richiedono accoppiamento spaziale stretto VGCCs alle macchine di fusione delle vescicole 3. Presinaptici Ca 2 + flussi sono stati caratterizzati principalmente attraverso approcci di imaging utilizzando Ca 2 + coloranti sensibili 4. Integrare Ca 2 + buffer che modulano Ca 2 + nei neuroni presinaptici è stato utilizzato per caratterizzare indirettamente il rapporto tra calcio presinaptico e neurotrasmissione 3. Inoltre, modulando la presinaptico libera Ca 2 + concentrazione da uncaging Ca 2 + 5 o registrazione macroscopic Ca 2 + correnti sono stati utilizzati in combinazione con misure di fusione della vescicola e / o rilascio; quali misure di capacità di 6 o postsinaptici 2 risposte per affrontare la stessa domanda. Tuttavia, caratterizzando Ca 2 + correnti direttamente in faccia rilascio, la sezione specializzata della membrana presinaptica dove depolarizzazione della membrana viene tradotto in Ca 2 + correnti di attivazione sinaptica fusione delle vescicole e il rilascio dei neurotrasmettitori, è parte integrante di ottenere una misura precisa del Ca 2 + requisito per la fusione delle vescicole sinaptiche. Inoltre, la capacità di caratterizzare direttamente Ca 2 + correnti a singoli terminali presinaptici, accoppiato con misure simultanee accurate di fusione della vescicola e rilascio permette una spiegazione precisa della relazione temporale tra l'andamento temporale del potenziale d'azione, presinaptico Ca 2 + corrente, fusione della vescicola e rilascio. L'accesso alla membrana di rilascio visonon è disponibile nella maggior parte dei terminali presinaptici dovuti a chiudere apposizione da parte dei dendriti postsinaptici. Questa inaccessibilità è stato un grande ostacolo nella caratterizzazione di VGCCs quanto impedisce misure dirette di corrente a singoli terminali presinaptici. Caratterizzazione diretta di presinaptici Ca 2 + correnti a singoli terminali presinaptici non è finora stato possibile in sinapsi centrali ed è stato raggiunto solo in due terminali presinaptici di tipo caliceale; calice-tipo sinapsi delle pulcino ganglio ciliare 7-10 e ratto calici 11,12. In tutti gli altri terminali presinaptici tra cui la sinapsi reticulospinal gigante nella lampreda midollo spinale 13, la mancanza di accesso alla membrana di rilascio volto presinaptica ha reso necessario l'utilizzo di approcci indiretti come Ca 2 + di imaging per studiare presinaptici Ca 2 + flussi. <img alt="Figura 1" fo: content-width="src" files ftp_upload width='"500"' src="/files/ftp_upload/51925/51925fig1highres.jpg"> Figura 1 Lampreda gigante sinapsi reticulospinal. (A) Sezione di lampreda midollo spinale che indica l'orientamento dorso-ventrale. Assoni reticulospinal sono contrassegnati dall'asterisco verde. (B) 3-D ricostruzione della sinapsi reticulospinal nella lampreda midollo spinale che mostra presinaptico assone reticulospinal facendo numerosi en passant contatti (contrassegnato da frecce verdi) sul neurone postsinaptico 13. Terminali presinaptici sono stati etichettati con Alexa Fluor 488 hydrazide falloidina coniugato (verde), mentre il neurone postsinaptico è stato riempito con Alexa Fluor 568 hydrazide (rosso). Lampreda assoni giganti reticulospinal, situato nella regione ventrale del midollo spinale parallelo al rostrale-caudale asse Figura 1a, forma multipla en passant contatti sinaptici sui neuroni delspinale corno ventrale 14 Figura 1b 13. Whole-cell macroscopica Ca 2 + correnti sono state registrate da assoni reticulospinal nel midollo spinale intatto 13,15. Tuttavia, precedenti tentativi ciechi a misura diretta di Ca 2 + correnti in assoni reticulospinal nel intatta lampreda midollo spinale utilizzando cellule-attached tecnica del patch clamp hanno provato senza successo 13 a causa della mancanza di accesso alla membrana presinaptica rilascio volto a causa dei processi di postsinaptici opposte Figura 1b. La membrana di rilascio volto è stato in precedenza reso accessibile dalla rimozione del neurone postsinaptico 11, perturbazione meccanica della sinapsi prima di registrare 12 o trattamento enzimatico accoppiato con dissociazione meccanica 16. Data la complessa organizzazione del midollo spinale, che si sarebbe rivelato estremamente difficile identificare il neurone postsinaptico e ritrarre meccanicamente o perturbare the sinapsi. Quindi, abbiamo deciso di utilizzare il trattamento enzimatico 17 seguita da dissociazione meccanica. Usando questo approccio, abbiamo sviluppato una preparazione acutamente dissociata della lampreda midollo spinale che produce vitali isolati assoni reticulospinal con terminali presinaptici funzionali privi di qualsiasi processo post-sinaptici, fornendo così un accesso illimitato ai singoli terminali presinaptici. In combinazione con un microscopio invertito e standard di imaging di fluorescenza, che ci permette di identificare e indirizzare i singoli terminali presinaptici fluorescenti-identificato, con una pipetta di patch contenente una soluzione di registrazione che isola Ca 2 + correnti figura 4c e 4d figura, per la registrazione utilizzando cellulo- allegato tecnica voltage-clamp. Ca 2 + correnti sono state registrate direttamente a livello della membrana presinaptica del rilascio volto dell'individuo terminali presinaptici figura 4f. Questo è un significant passo avanti nel campo della trasmissione sinaptica poiché è la prima di tali registrazioni da effettuare in sinapsi centrali.

<table><tbody><tr><td>0,2 &micro; m Filtro per siringa</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV004SL</td><td></td></tr><tr><td>22 x 60 mm Vetrini coprioggetti</td><td>Fisherbrand</td><td>12545J</td><td></td></tr><tr><td>Advasep-7</td><td>Cydex Pharmaceuticals</td><td>ADV7</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Falloidina</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-633 anticorpo secondario coniugato di capra anti-coniglio</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A21070</td><td></td></tr><tr><td>Antigelo</td><td>Prestone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa in campo chiaro</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Fiberlite 180</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo IA da Cloristridium Histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto</td><td>Fisher-Scientific</td><td>12-545-J</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9559</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera CCD digitale</td><td>Hamamatsu</td><td>C8484-03G01</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini per dissezione</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per dissezione</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione</td><td>Leica Biosystems Leica</td><td>MZ 12</td><td></td></tr><tr><td>Forbici di dissezione</td><td>Fine Science Tools</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Forbici di dissezione fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Forbici di dissezione ultra fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>FM 1-43</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>T3163</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>Grasso per alto vuoto</td><td>Dow-Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Fisherbrand</td><td>SA-56-500</td><td></td></tr><tr><td>Olio da immersione</td><td>Fisher-Scientific</td><td>M2000</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio di azoto per uso industriale</td><td>Praxair</td><td>UN1066</td><td></td></tr><tr><td>Perni per insetti</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Colla per sutura liquida</td><td>Braun Veterinary Cair Division</td><td>8V0305</td><td>La colla per sutura che abbiamo usato nei nostri esperimenti ci è stata fornita da un altro laboratorio. Non è più prodotto. Abbiamo acquistato una colla per sutura Histoacryl per uso futuro da Aesculap (Ts1050071FP)</td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154903</td><td></td></tr><tr><td>Latte secco scremato</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>9999S</td><td></td></tr><tr><td>P-87 Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pompa di perfusione</td><td>Cole-Palmer</td><td>Masterflex C/L</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 100 x 15 mm</td><td>Fisher-Scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 35 x 10 mm</td><td>Fisher-scientific</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>Idromidrato di poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>MW > 300.000</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi primari canale del calcio di tipo R</td><td>Alomone Labs</td><td>ACC-006</td><td></td></tr><tr><td>Proteasi di tipo XIV da Streptomyces Griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Lame per bisturi</td><td>World Precision Instruments&nbsp;</td><td>500240</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglia a pressione Schot Duran</td><td>Fisher-Scientific</td><td>09-841-006</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in silicone per applicazione di colla</td><td>Cole-Palmer</td><td>07625-26</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di base per affettare</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046327404</td><td></td></tr><tr><td>Camera di affettamento</td><td>Leica Biosystems</td><td>14046230132</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di</td><td></td> sodio <td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Tetraborato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3545</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 160 Kit di elastomeri siliconici</td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>SYLGARD&reg; 160</td><td>Per la preparazione, miscelare l'elastomero A e l'elastomero B 10:1 in peso</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit di elastomeri siliconici</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD&reg; 184&nbsp;</td><td>Per la preparazione, miscelare elastomero e agente indurente 10:1 in peso</td></tr><tr><td>Pinze rivestite in teflon</td><td>Fine Science Tools</td><td>11626-11</td><td></td></tr><tr><td>Tricaina metansolfonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Lame vibratomo</td><td>World Precision Instruments</td><td>LAME</td><td></td></tr><tr><td>Lampada allo xeno</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

acuta dissociazione di lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Trasmissione sinaptica è un processo estremamente rapido. Potenziale d&#39;azione guidato afflusso di Ca 2 + nel terminale presinaptico, attraverso i canali del calcio voltaggio-dipendenti (VGCCs) situati nella membrana faccia rilascio, è l&#39;innesco per fusione della vescicola e il rilascio dei neurotrasmettitori. Fondamentale per la rapidità di trasmissione sinaptica è la sincronia spaziale e temporale tra l&#39;arrivo del potenziale d&#39;azione, VGCCs e macchinari rilascio dei neurotrasmettitori. La possibilità di registrare direttamente Ca 2 + correnti dalla membrana di rilascio volto dei singoli terminali presinaptici è indispensabile per una precisa comprensione del rapporto tra presinaptica Ca 2 + e il rilascio dei neurotrasmettitori. L&#39;accesso alla membrana di rilascio presinaptico viso per la registrazione elettrofisiologica non è disponibile nella maggior parte dei preparati e Ca 2 + presinaptico voce è stata caratterizzata mediante tecniche di imaging e macroscopica MeasureMe attualenti - tecniche che non hanno risoluzione temporale sufficiente per visualizzare Ca 2 + voce. La caratterizzazione di VGCCs direttamente presso i terminali presinaptici singoli non è stato possibile in sinapsi centrali ed è stato finora realizzato con successo soltanto nel calice-tipo sinapsi del ganglio ciliare pulcino e in calici di ratto. Abbiamo affrontato con successo questo problema nella sinapsi reticulospinal gigante del lampreda midollo spinale attraverso lo sviluppo di una preparazione acutamente dissociata del midollo spinale che produce isolati assoni reticulospinal con terminali presinaptici funzionali prive di strutture di post-sinaptici. Possiamo fluorescente etichettare e identificare i singoli terminali presinaptici e loro destinazione per la registrazione. Utilizzando questa preparazione, abbiamo caratterizzato VGCCs direttamente in faccia rilascio dei singoli terminali presinaptici utilizzando approcci di immunoistochimica e di elettrofisiologia. Ca 2 + correnti sono stati registrati direttamente al rilascio viso membrana of singoli terminali presinaptici, il primo di tali registrazioni da effettuare a livello delle sinapsi centrali.

Questo produce protocollo dissociazione sani e funzionali isolate assoni reticulospinal privi di postsinaptico proiezioni figura 2f, ma che tuttavia conservano terminali presinaptici funzionali capaci di vescicole sinaptiche evocate eso-ed endocitosi Figura 4c e 4d Figura. Sezioni delle regioni isolate degli assoni reticulospinal possano essere chiaramente identificati al microscopio ottico per essere chiari di altri processi neuronali che consentono l'accesso illimitat...

La registrazione delle correnti di Ca2+ sulla membrana frontale di rilascio presinaptico è la chiave per una comprensione precisa dell'ingresso di Ca2+ e del rilascio di neurotrasmettitori. Presentiamo una dissociazione acuta del midollo spinale della lampreda che produce assoni reticolospinali isolati funzionali, permettendo la registrazione direttamente dalla membrana facciale di rilascio dei singoli terminali presinaptici.

Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere assoni reticolospinali isolati con terminali presinaptici funzionali per consentire la registrazione delle correnti di calcio direttamente dalla membrana frontale di rilascio. Ciò si ottiene estraendo prima il midollo spinale dalla cavità del corpo della lampada e rimuovendo la colonna dorsale del midollo spinale come secondo passo. Il tessuto della fetta viene trattato con una miscela di enzimi proteasi e collagenasi per allentare il tessuto connettivo e facilitare il processo di dissociazione.Successivamente, i tratti laterali del midollo spinale trattato con l'enzima vengono tagliati nel punto medio per localizzare la forza di dissociazione. Il midollo spinale viene dissociato in modo acuto separandolo delicatamente fino a quando gli assoni reticolari spinali reticolospinali sono isolati. Si ottengono risultati che dimostrano la vitalità degli assoni reticolospinali isolati e la registrazione delle correnti di calcio direttamente dalla membrana della faccia di rilascio dei singoli terminali presinaptici.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto all'imaging del transitorio di calcio presinaptico è che le correnti possono essere risolte direttamente sulla membrana frontale di rilascio presinaptico. Questo non può essere ottenuto utilizzando le tecniche di imaging convenzionali. L'accesso illimitato alla membrana frontale di rilascio nei singoli terminali presinaptici ci consente di applicare numerosi approcci per studiare gli aspetti del neurotrasmettitore in questi processi.L'imaging iCal singolo con punti quantici che misurano le variazioni di capacità della membrana e la misurazione simultanea delle correnti di calcio consente una misurazione precisa del ritardo sinaptico. Iniziare questa procedura anestetizzando un raggio di lampada amite o adulto con trica metano solfonato a 100 milligrammi per litro. Quindi, decapitare il raggio della lampada in una soluzione di suoneria a quattro gradi Celsius.Quindi rimuovere i muscoli della parete corporea per esporre la superficie dorsale del midollo spinale. Successivamente, rimuovere i significati prima tiva. Non rimuovere il significato ventrale priva in questa fase.Successivamente, taglia il midollo spinale in pezzi lunghi un centimetro. Successivamente, appuntare un pezzo di midollo spinale con il lato dorsale rivolto verso l'alto sulla piastra di base per affettare rivestita in A-P-D-M-S in una camera vibrante contenente una soluzione di suoneria ghiacciata. Quindi rimuovere una sezione centrale della colonna vertebrale del midollo spinale e lasciare dietro di sé la colonna dorsale intatta.Sezioni sul rostrale e sulle estremità delle coccole fungono da maniglie durante il processo di dissociazione. Utilizzare l'impostazione di velocità più bassa nell'affettatura e un'impostazione di profondità che rimuove solo la colonna dorsale, lasciando intatta la colonna vertebrale reticolare sottostante. Successivamente, incubare i pezzi di midollo spinale affettati a temperatura ambiente per 45 minuti in un cocktail di un milligrammo per millilitro di proteasi e un milligrammo per millilitro di collagenasi preparato nella soluzione di ringer.Quindi mettere i pezzi di midollo spinale trattati in una capsula di Petri rivestita di A-P-D-M-S contenente una soluzione di suoneria a quattro gradi Celsius. Quindi, rimuovere i significati ventrali priva con una pinza fine. Taglia le tracce laterali del midollo spinale nel punto medio della sezione dorsale affettata con una lama di bisturi.Successivamente, metti una goccia di olio da immersione sulla lente. Quindi posizionare il vetrino coprioggetto rivestito in polilisina nella fessura della camera di registrazione e sigillare i bordi con grasso per vuoto. Avvitare la parte superiore in posizione e posizionare la camera nell'inserto.Sul banco di registrazione, aggiungere la soluzione di suoneria alla camera di registrazione utilizzando una pipetta per pascoli. Quindi, collegare il tubo di deflusso della bombola a pressione contenente la soluzione antigelo al tubo di ingresso del dispositivo di raffreddamento termoelettrico. Quindi collegare il tubo di uscita del dispositivo di raffreddamento termoelettrico all'estremità di ingresso della camicia di raffreddamento esterna e l'estremità di uscita al serbatoio R.Posizionare i pezzi del midollo spinale nella camera di registrazione uno alla volta.Separarli delicatamente tenendoli sempre lungo il vetrino coprioggetti fino a quando gli assoni non sono isolati. Portare la temperatura della soluzione di registrazione a 10 gradi Celsius facendo passare la soluzione antigelo pressurizzata attraverso la camicia di raffreddamento esterna della camera di registrazione. Lasciare che gli assoni si riprendano a 10 gradi Celsius per un'ora dopo la dissociazione.In questa procedura, perfondere il campione con cinque micromolari FM 1 43 in soluzione ringer contenente 30 millimolari di cloruro di potassio. Successivamente, perfondere il campione con un milligrammo per millilitro ADV sette in soluzione di suoneria. Per rimuovere il colorante FM in eccesso prima di perfonderlo con la soluzione di suoneria per 15 minuti.Quindi acquisire immagini del campione con una lente a immersione in olio 100x, una telecamera CCD digitale e il software di acquisizione immagini micromanager. Identificare i singoli terminali pre-sinaptici marcati in fluorescenza per la registrazione. In questa procedura, fabbricare le pipette patch in vetro silicato Illumina in un micro estrattore per pipette P 87.Progettare la pipetta per patch in modo tale che la punta della pipetta includa l'intero diametro del terminale presinaptico S, rivestire le pipette per patch immergendole nel PDMS a una pressione compresa tra 50 e 60 PSI e asciugarle utilizzando una pistola termica. Dopo l'accensione, lucidare le pipette di cerotti utilizzando una micro forgia al microscopio a fluorescenza. Identificare gli assoni isolati con terminali presinaptici marcati.Quindi riempire la pipetta per cerotti con la soluzione di registrazione. Utilizzando una siringa, inserire una pipetta patch nel portapipetta e posizionarla sopra la vasca. Utilizzando un manipolatore motorizzato, abbassare delicatamente la pipetta patch nella vasca e posizionarla contro la faccia di un terminale presinaptico identificato in modo fluorescente.Far avanzare lentamente la pipetta per cerotti fino a quando non entra in contatto con la membrana. A questo punto, formare una tenuta giga ohm con una bocca delicata, aspirando attraverso un tubo attaccato al porta pipetta. Per l'acquisizione dei dati, utilizzare un protocollo a gradini standard con incrementi di 10 millivolt come stimolo.La preparazione dell'assone reticolospinale acutamente dissociato può essere utilizzata per effettuare caratterizzazioni immunoistochimiche. Come primo passo, riempire l'inserto del piatto con una soluzione di ringer priva di ioni bivalenti. Fabbricare le pipette patch in un micro estrattore per pipette P 87.Aspirare una piccola quantità di colla da sutura da un tubo einor nella punta della pipetta per bocca. Aspirazione. Erogare la colla per sutura a un'estremità dell'inserto rivestito in polilisina soffiando delicatamente nel puntale della micropipetta. Quindi posizionare un'estremità del midollo spinale sulla colla da sutura.Premerlo delicatamente e farlo aderire alla superficie. Quindi, posiziona un'altra goccia di colla per sutura all'altra estremità dell'inserto. Eseguire le dissociazioni come dimostrato in precedenza.Allungare delicatamente il midollo spinale fino a dissociare gli assoni. Quindi trascinare delicatamente l'estremità libera del midollo spinale sulla colla per sutura e fissarla in posizione. Successivamente, sostituire la soluzione di ringer priva di bivalente con la normale soluzione di ringer per perfusione.Lasciare che gli assoni si riprendano a 10 gradi Celsius per 20 minuti dopo la dissociazione prima di procedere con il protocollo di immunoistochimica. Queste due immagini mostrano un assone reticolospinale isolato con marcatura puntata dei terminali pre-sinaptici con FM 1 43 e il targeting di un singolo terminale pre-sinaptico con pipetta patch per la registrazione di patch attaccate alle cellule. Questo è un esempio rappresentativo che mostra la registrazione delle correnti di calcio attaccate alla cellula dalla membrana frontale di rilascio presinaptico.La linea continua indica lo stato chiuso del canale, mentre le linee tratteggiate indicano l'apertura di uno, due e tre canali. Qui è mostrata la caratterizzazione immunoistochimica di un canale del calcio di tipo R ai singoli terminali presinaptici. Un anticorpo primario policlonale è stato utilizzato per marcare un epitopo nel ciclo intracellulare tra i domini due e tre del canale del calcio di tipo R e l'anticorpo secondario utilizzato era LOR 6 33 Hydrocyte conjugated goat anti rabbit, IGG.I terminali pre-sinaptici sono stati identificati mediante marcatura BYOR 4 88 Phin dell'actina presinaptica. Questa immagine mostra la colocalizzazione tra l'etichettatura degli anticorpi di tipo R e Alexa 4 88 phin. La pre-incubazione dell'anticorpo anti-canale del calcio di tipo R con antigene di controllo non ha prodotto alcuna marcatura specifica dei canali del calcio, ma Exor 4 88 falo nella marcatura dei terminali pre-sinaptici per lo stesso assone ha mostrato una discreta marcatura puntata dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada alla misurazione diretta delle correnti di calcio sulla membrana frontale di rilascio dei singoli terminali presinaptici, precedentemente non possibile nelle sinapsi centrali. Ha anche fornito un modo per determinare il numero di canali del calcio che contribuiscono al rilascio del gating del dominio del calcio. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione della registrazione direttamente dalla membrana della fase di rilascio dei singoli terminali presinaptici.

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Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici (Video) | JoVE Journal

Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici

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