Da un 2DE-Gel Spot Proteine ​​Funzione: Lesson Learned From HS1 nella leucemia linfocitica cronica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare un approccio proteomico combinato per identificare potenziali marcatori prognostici e/o bersagli terapeutici nelle malattie umane. Ciò si ottiene isolando le cellule leucemiche primarie dal sangue periferico del paziente, con prognosi buona o cattiva, ed esprimendo sia i marcatori di superficie CD 19 che CD cinque da utilizzare per l'analisi proteomica come seconda fase. I lisati delle cellule leucemiche vengono risolti mediante elettroforesi bidimensionale o due de, e il confronto delle mappe proteomiche consente l'identificazione di spot espressi in modo differenziale tra pazienti con prognosi buona e cattiva, che possono essere successivamente identificati mediante spettrometria di massa o MS.

Successivamente, è possibile utilizzare diversi saggi per convalidare e analizzare il ruolo delle proteine identificate nella storia naturale della malattia. I risultati mostrano che il diverso stato di fosforilazione dell'HS, rilevato da due degel, è correlato con l'esito clinico dei pazienti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia della leucemia linfatica cronica perché può aiutare ad identificare le proteine coinvolte nella progressione della malattia che possono essere sfruttate come marcatore prognostico e/o bersagli terapeutici dimostrando che questa procedura sarà insieme a me.

Pamela è corsa dal tecnico del laboratorio e da un postdoc di un laboratorio esterno Prima di iniziare questa procedura, raccogliere il sangue periferico in provette per la raccolta del sangue vacutainer con eparina di sodio. Trasferire il sangue in una provetta da 15 millilitri e aggiungere un cocktail di arricchimento di cellule B umane a 50 microlitri per millilitro di sangue intero. Quindi mescolare bene e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, diluire il campione con un volume uguale di PBS più una miscela di FBS al 2% e sovrapporre delicatamente il sangue sul richiamo della mosca facendo attenzione a non rompere l'interfaccia. Centrifugare il campione a 400 volte G a temperatura ambiente per 20 minuti senza interruzioni. Al termine, aspirare con cura l'interfaccia per recuperare le cellule e inserirle in una nuova provetta.

Lavare le cellule una volta con PBS dopo la centrifugazione e la rimozione del surnatante. Resus. Sospendere il pellet nel surnatante rimanente muovendo manualmente il tubo avanti e indietro dopo la diluizione. Con il mezzo RPMI completo, contare le celle utilizzando il metodo di esclusione del blu Trian.

Quindi, aggiungere i seguenti anticorpi a 100 microlitri di sospensione cellulare purificata in un tubo fax. Incubare il campione per 20 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Dopo aver lavato il campione con quattro millilitri di PBS, verificare la purezza mediante citometria a flusso.

Controlla la percentuale di leucemia linfatica cronica o cellule LLC, che Coex esprimono CD 19 e CD 5 sulla loro superficie. Assicurarsi che i preparati siano praticamente privi di linfociti t NK e monociti controllando la percentuale di CD tre, CD 14 e CD 1656 nel grafico, che dovrebbe essere vicina allo zero a questo punto. Solubilizzare i pellet cellulari di CLL con un volume finale di 380 microlitri di tampone per elettroforesi bidimensionale.

Applicare un milligrammo di campioni di proteine su 18 strisce IPG per eseguire l'elettrofocalizzazione iso. Dopo la corsa, equilibrare le strisce in due millilitri di tampone di equilibratura, integrato con il 2% di DTT fresco per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver scartato la soluzione, aggiungere due millilitri di tampone di equilibrio, integrato con 2,5% di oto acetammide.

Quindi incubare il campione per 15 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo. Successivamente, asciugare le strisce su carta senza toccare il gel per rimuovere la soluzione in eccesso. Una volta asciutta, caricare ogni striscia sopra un gel per pagine SDS sfumato dal 9 al 16%.

Aggiungere un piccolo volume di tampone per elettroforesi SDS sopra il gel per facilitare il caricamento della striscia. Successivamente, sigillare il gel aggiungendo circa cinque millilitri di soluzione di agar allo 0,8% per evitare che la striscia galleggi. Una volta assemblata l'unità di elettroforesi, riempirla con SDS Electrophoresis Buffer.

Quindi eseguire la corsa a 60 milliampere per gel per quattro ore, quattro gradi Celsius o utilizzando un sistema di raffreddamento. Dopo aver rimosso il gel dall'unità elettroforetica, riporlo nell'apposita scatola di colorazione. Preparare circa 200 millilitri di ciascuna soluzione.

Aggiungere con cura ogni soluzione nella scatola di colorazione contenente il gel. Esegui tutte le incubazioni su una piattaforma a dondolo. Dopo la colorazione, rimuovere la soluzione di arresto e lasciare il gel in una soluzione di acido acetico all'1% fino all'acquisizione.

Per il test di migrazione, sospendere le cellule precedentemente purificate. Nell'RPMI completo preparare la camera del transwell inferiore aggiungendo 600 microlitri di RPMI completo con o senza gli stimoli specifici. Per misurare rispettivamente la migrazione indotta e quella spontanea, posizionare la camera superiore sopra e lasciare che il sistema si equilibri per 30 minuti a 37 gradi Celsius nell'incubatrice.

Al termine, seminare da 10 a sei cellule per 200 microlitri nella camera superiore e incubare la piastra per quattro ore a 37 gradi Celsius nell'incubatore. Dopo l'incubazione, rimuovere la camera superiore e raccogliere il terreno nella camera inferiore. Quindi lavare una volta la camera inferiore con un millilitro di PBS.

Dopo aver raccolto il PBS in una provetta, centrifugare il campione per cinque minuti a 300 volte G dopo la rimozione del surnatante. Risospendere il campione in 500 microlitri di PBS mediante citometria a flusso. Contare il numero di cellule migrate dopo un minuto dall'acquisizione.

Controlla il numero di celle in un grafico a punti bidimensionale considerando le dispersioni laterali delle celle e il numero di eventi visualizzati in un minuto, che è il numero da utilizzare per il calcolo. I campioni di cellule leucemiche primarie isolate da pazienti con LLC sono stati raggruppati in due sottogruppi principali in base alle caratteristiche cliniche di ciascun paziente e analizzati da due masse DE e SM entro una certa tolleranza di massa. Sono stati assegnati a sequenze peptidiche nel database e poi assemblati in una proteina che si considera identificata se supera un certo punteggio di probabilità.

Con questa analisi, sono state identificate tra queste proteine le proteine principalmente coinvolte nell'attività citoscheletrica e nei processi metabolici. Lignaggio ematopoietico, proteina specifica cellulare o hs. Uno la cui fosforilazione differenziale fortemente associata al decorso clinico della malattia era espressa in modo differenziale.

In particolare, i pazienti portatori di un singolo spot sperimentano un esito clinico negativo, mentre i pazienti con due spot hanno una buona prognosi. È stato riscontrato che le cellule CLL che trasportano HS una come una sola macchia, hanno un'attività citoscheletrica compromessa in termini di migrazione, adesione e polimerizzazione dell'actina rispetto all'HS ipofosforilata. Uno, due campioni spot. Spiegando così un diverso comportamento clinico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la proteomica per identificare i candidati biologici coinvolti nella progressione della malattia che possono essere utilizzati come marcatori prognostici e/o bersagli terapeutici.