Name: Da un 2DE-Gel Spot Proteine Funzione: Lesson Learned From HS1 nella leucemia linfocitica cronica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Scopri l'approccio proteomico combinato 2DE e spettrometria di massa per identificare marcatori prognostici nella leucemia linfocitica cronica. Questo metodo aiuta a rivelare bersagli terapeutici validati.

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Ringraziamo il Neoplasie Unità linfoide, Elisa dieci Hacken, Lydia Scarfò, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, e Angela Cattaneo. Questo progetto è stato sostenuto da: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant e Programma Speciale di Oncologia Molecolare Clinica - 5 per mille 9965 #) CS e BA progettato lo studio, eseguito gli esperimenti, hanno analizzato i dati e scritto il manoscritto. MTSB, UR, FBPR assistito nella scrittura del manoscritto. PG e FCC progettati campioni Lo studio ha fornito dei pazienti e dati clinici.

NOTA: Tutti i campioni di tessuto sono stati ottenuti con l'approvazione del Comitato Etico dell'Ospedale San Raffaele (Milano, Italia). 1 campioni di tessuti umani e purificazione delle cellule (Figura 1) NOTA: i linfociti leucemiche sono stati ottenuti da sangue periferico (PB) di pazienti affetti da LLC, diagnosticati secondo Mulligan et al 9. 1.1) La separazione delle cellule leucemiche da PB <ol><li> Raccogliere PB in provette di raccolta del sangue con vacutainer sodio eparina. </li><li> Trasferire il sangue in una provetta da 15 ml e aggiungere B-cellula umana arricchimento cocktail a 50 ml / ml di sangue intero. Mescolare bene e incubare 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Diluire il campione con un uguale volume di PBS + 2% FBS, mescolare il sangue con delicatezza e con attenzione overlay sul Ficoll, facendo attenzione a non rompere l'interfaccia. Utilizzare almeno 1 parte di Ficoll a 2 parti di campione diluito (cioè 4 ml Ficoll + 10 ml di sangue in 15 ml tube). </li><li> Centrifugare a 400 xg, a temperatura ambiente (20 ° C) per 20 minuti senza freno. Le cellule mononucleari saranno all'interfaccia. </li><li> Aspirare accuratamente l'interfaccia per recuperare le cellule e inserire in un nuovo tubo. Lavare le cellule una volta con PBS e centrifugare a 300 xg, a 4 ° C al buio per 5 min. Il pellet sarà in basso. </li><li> Eliminare il surnatante. Risospendere il pellet nel surnatante rimanente muovendo il tubo avanti e indietro con le dita. Diluire il pellet con 10 ml di mezzo completo RPMI (RPMI 1640 supplementato con 10% di siero fetale di vitello e 15 mg / ml di gentamicina) e contare le cellule con il metodo di esclusione Trypan Blue. </li></ol> 1.2) Valutazione Purezza NOTA: La purezza di tutti i preparati deve essere sempre superiore al 99%. <ol><li> Incubare 100 ml di sospensione cellulare purificata con i seguenti anticorpi (disponibili in commercio, vedi Tabella dei Materiali): CD3 FITC (5 microlitri / TESt), CD14 PE (5 ml / test), CD19 ECD (6 ml / test), CD16-CD56 PC5 (2 ml / test), CD5 PC7 (4 ml / test), per 20 minuti a 4 ° C in un tubo FACS. </li><li> Lavare il campione con 4 ml di PBS (centrifugare per 5 min a 300 xg) e controllare la purezza del flusso cytometry.Check nella trama la% di cellule CLL (&gt; 99%), che co-esprimono CD19 e CD5 sulla loro superficie come mostrato nella Figura 1 (6). Assicurarsi che i preparativi sono praticamente privi di NK, linfociti T e monociti controllando la% di CD3, CD14 e CD16-56 nella trama, che dovrebbe essere vicino allo zero. </li></ol> 1.3) I campioni di archiviazione <ol><li> Per gli studi di proteomica, raccogliere 25 x 10 6 cellule in una provetta da 1,5 ml, cellule centrifugare a 300 xg per 10 min, scartare il surnatante e lyophilize pellet per 4 ore. Conservare a -80 ° C fino all'utilizzo. </li><li> Per i test di validazione, risospendere le cellule in RPMI completo (quantità dipende l'ulteriore analisi che èscelta) e procedere con il punto 4. </li></ol> 2. elettroforesi bidimensionale (2-DE) (Figura 2) 2.1) Isoelettrofocalizzazione (IEF) <ol><li> Solubilizzare cellule CLL pellet con un volume finale di 380 microlitri di buffer 2-DE (344 ml di una soluzione di RBthio (9 M Urea, Tris 10 mM, 4% CHAPS), 30 ml di 65mm DTT, 6 ml di 2% IPG buffer di ampholine pH 4-7). </li><li> Applicare campioni di proteine ​​(1 mg) per 18 strisce IPG (pH 4-7) e di eseguire IEF seguente protocollo standard come descritto da Conti et al. 10 </li><li> Equilibrare le strisce in 2 ml di tampone per l'equilibrazione (EB: 50 mM tampone pH 8.8 Tris-HCl contenente 6 M urea, 30% glicerolo, 2% SDS), integrato con il 2% di fresco DTT, per 15 minuti a RT. Eliminare EB + DTT e aggiungere 2 ml di EB integrato con 2,5% Iodoacetamide. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante. </li></ol> 2.2) SDS-PAGE <ol><li> Asciugare le strisce su carta senza toccare il gel per rimuoverel'eccesso di EB. Caricare ogni striscia sulla cima di un gradiente di gel SDS-PAGE 9-16%. Aggiungere una piccola quantità di SDS-elettroforesi Buffer (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS 0,1% w / v) sulla parte superiore del gel per facilitare il caricamento del nastro. </li><li> Sigillare il gel con l'aggiunta di ~ 5 ml di soluzione di agar (0,8%) per evitare di galleggiamento della striscia, quindi montare l'unità elettroforetica e riempire con tampone SDS-elettroforesi. Eseguire la corsa a 60 mA / gel per 4 ore a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il gel dall'unità elettroforetico e inserirlo nella casella colorazione corretta. </li></ol> 2.3) Macchia d'argento per la preparativa Gel <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> FIXER </td><td> 50% Metanolo 12% di acido acetico 0,05% formalina </td><td> 2 ore (o tutta la notte) * </td></tr><tr><td> TAMPONE DI LAVAGGIO </td><td> 35% Ehanol </td><td> 20 min (ripetere l'operazione per tre volte) </td></tr><tr><td> SENSIBILIZZAZIONE </td><td> 0,02% di sodio tiosolfato </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> WASH </td><td> H 2 O </td><td> 5 min (ripetere il passo tre volte) </td></tr><tr><td> ARGENTO NITRATO </td><td> 0,2% di nitrato d'argento 0,076% formalina </td><td> 20 min </td></tr><tr><td> WASH </td><td> H 2 O </td><td> 1 min (ripetere il passaggio due volte) </td></tr><tr><td> SVILUPPATORE </td><td> 6% di sodio carbonato 0,0004% di sodio tiosolfato 0,05% di formalina </td><td> Fino a quando la colorazione è sufficiente </td></tr><tr><td> Stop </td><td> 50% Metanolo </td><td> 30 min </td></tr><tr><td></td><td> * 2 ore è il tempo minimo richiesto per la fissazione delle proteine </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. NOTA: spot proteici possono essere visualizzati mediante colorazione gel con MS macchia d'argento compatibile 11. Tutte le soluzioni necessarieper la colorazione argento sono elencati nella Tabella 1. <ol><li> Preparare circa 200 ml di ciascuna soluzione / gel e procedere come indicato nella tabella 1. Aggiungere con cautela ogni soluzione alla casella di colorazione contenente il gel. Eseguire tutte le incubazioni su una piattaforma oscillante. </li><li> Dopo la colorazione, rimuovere la soluzione di arresto e lasciare il gel in una soluzione di 1% di acido acetico fino acquisizione. </li></ol> 2.4) Gel Acquisizione e Analisi <ol><li> Acquisire immagini ad alta risoluzione utilizzando un densitometro entro 3 giorni dalla colorazione. </li><li> Analizzare 2-D modelli di proteine ​​utilizzando il software per i gel 2-DE. NOTA: Il software permette una comparazione di immagini veloce e affidabile. <ol><li> Creare un progetto scegliendo "creare un nuovo progetto" dal menu contestuale. Creare una cartella e importare i gel scegliendo "immagini gel di importazione" con tif, png. o .gel estensione. </li><li> Una volta che i gel sono importati e aggiunti al workspasso, eseguire un rilevamento automatico posto selezionando il gel per la rilevazione spot e scegliendo "Modifica&gt; punto&gt; individuare" nel menu. </li><li> Successivamente, eseguire uno sfondo sottrazione selezionando dal menu "sfondo sottrarre". Nota: Dopo di che è possibile confrontare più gel e per rilevare differenze o somiglianze di analisi quantitativa e / o qualitativa. </li></ol></li></ol> 3. Proteina Identificazione mediante MALDI-TOF MS analisi (Figura 3) 3.1) digestione delle proteine <ol><li> Sciacquare il gel con acqua e accise luoghi di interesse da gel sia dal manuale (tagliando con un bisturi pulito) o escissione automatico. </li><li> Lavare particelle di gel con acqua (100-150 ml), spin down (30 sec a 400 xg) e rimuovere il liquido. </li><li> Aggiungere un volume uguale (a seconda del volume di gel) di CH 3 CN ai pezzi di gel e attendere 10-15 minuti fino a quando i pezzi di gel ridursi. Asciugare le particelle di gel ina centrifuga a vuoto. </li><li> Aggiungi 75-100 ml di Dithioerythritol 10 mM diluito in 50 mM NH 4 HCO 3 e incubare per 30 minuti a 56 ° C (riduzione Step). Shrink nuovamente i pezzi di gel con CH 3 CN come descritto al punto 3.1.3. </li><li> Procedere con alchilazione con l'aggiunta di 75-100 ml di una soluzione 55 mM Iodoacetamide diluito in 50 mM NH 4 HCO 3 e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Shrink i pezzi di gel ancora una volta con CH 3 CN con un volume sufficiente a coprire i pezzi di gel come descritto al punto 3.1.3. Secco in una centrifuga a vuoto. </li><li> Reidratare le particelle in un tampone contenente 25 mM di NH 4 HCO 3, 5 mM CaCl 2, e 12,5 ng / ml di tripsina a 4 ° C per 20 min. Utilizzare un volume sufficiente di tampone per coprire i pezzi di gel. Rimuovere il surnatante non-assorbita dai pezzi di gel e aggiungere 25 mM NH 4 HCO 3, 5 mM CaCl 2 senza tripsina di COVer il gel. </li><li> Lasciare campioni a 37 ° C per almeno 3 ore (il tempo minimo richiesto per la digestione peptide) per una notte. </li></ol> 3.2) Spettrometria di Massa Analisi (tecnica di goccia secchi) <ol><li> Spot 1 ml aliquota di ogni campione su una piastra MALDI acciaio inox e mescolare con 1 ml di α-ciano-4-idrossicinnamico acido come matrice, preparati nel 50% CH 3 CN e 0,1% TFA. </li><li> Ottenere spettri di massa su uno spettrometro di massa MALDI-TOF. Accumulare circa 200 spettri al posto, regolando intensità del laser per evitare la saturazione del segnale o per aumentare il segnale. Spettri Process via software Data Explorer come descritto di seguito: <ol><li> Importare il file dat ed eseguire la correzione al basale scegliendo "processo&gt; Correzione della linea di base". Calibrare masse utilizzando i prodotti tripsina autolisi e picchi di matrice scegliendo "processo&gt; Calibrazione di massa&gt; calibrazione manuale; selezionare picchi vicino a m / z 855,1 e 2163,1 by lasciato trascinare e selezionare le corrispondenti masse di riferimento, quindi fare clic su "complotto" e "si applicano calibrazione" nella finestra di calibrazione manuale. </li><li> Regolare la soglia di rilevamento di picco ("peak&gt; rilevamento di picco"), duplicare la traccia attiva ("visualizzazione&gt; duplicare traccia attiva"), selezionare la nuova traccia ed eseguire il deisotoping ("picco&gt; deisotoping"). Utilizzando la macro "getpeaklist", generare un elenco di masse da utilizzare per l'identificazione. Se necessario, rimuovere manualmente i segnali di rumore raccolte da picchi per pulire la lista e ottenere una migliore identificazione. </li></ol></li><li> Identificare le proteine ​​ricercando un database completo di proteine ​​non ridondante con profonda e mascotte come i motori di ricerca 12. <ol><li> Utilizzare i seguenti parametri in tutte le ricerche: un mancato clivaggio per ogni peptide, metionina ossidazione come modifica variabile, cisteina carbamidomethylation come modifica fisso e un initiAl tolleranza massa di 50 ppm. </li></ol></li></ol> 4. citoscheletro Attività saggi (Figura 4) NOTA: Risospendere le cellule purificate nel passo 1 a completo RPMI (10 6 cellule / 200 ml). 4.1) Migrazione Assay. Questo test consente la quantificazione della capacità migratoria delle cellule analizzate (linfociti). Utilizzare una camera transwell di 6,5 mm di diametro e 5,0 micron dimensione dei pori ed eseguire il test in triplice copia. Ottimizza le dimensioni dei pori e tempo di migrazione (Step 4.1.3) nel caso di diversi tipi di cellule. <ol><li> Preparare la camera inferiore con l'aggiunta di 600 ml di RPMI completo con o senza gli stimoli specifici (cioè SDF-1) per misurare la e la migrazione spontanea indotta rispettivamente. </li><li> Mettere la camera superiore su di esso e lasciare che il sistema equilibrare per 30 minuti a 37 ° C in incubatore. </li><li> Seed 10 6 cellule / 200 microlitri nella camera superiore (numero totale delle cellule) e incubarela piastra per 4 ore a 37 ° C in incubatore. </li><li> Rimuovere la camera superiore, raccogliere i media nella camera inferiore e lavare la camera inferiore una volta con 1 ml di PBS. Raccogliere il PBS nel tubo. </li><li> Centrifugare 5 minuti a 300 xg, scartare il surnatante e risospendere in 500 microlitri di PBS. </li><li> Mediante citometria di flusso, contare il numero di cellule migrate dopo 1 min di acquisizione. Nel caso di una popolazione cellulare isolata non è necessario aggiungere alcun anticorpo superficie. Controllare il numero di cellule in un diagramma a punti bidimensionale considerando le disperde laterali delle cellule e il numero di eventi visualizzati in 1 min, che è il numero da utilizzare per il calcolo. </li><li> Calcolare l'Indice di migrazione (MI) come: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq1.jpg"></li></ol> 4.2) saggi di adesione. Questo test consente di misurare la capacità di adesione delle cellule. Eseguire il test in triplice copia. <ol><li> Pre-coat 96-wells piastra (a fondo piatto) con 50 ml / pozzetto di una delle 2% BSA-PBS (come sfondo) o 1 mg ICAM-1 diluito in PBS, una notte a 4 ° C. </li><li> Lavare la piastra due volte con PBS e bloccare i siti non specifici con l'aggiunta di 2% BSA-PBS (100 l / pozzetto) per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Nelle cellule frattempo risospendere a 5 x 10 6 / ml in RPMI completo, etichettarli con inseguitore cellulare 1 mM CMFDA-verde e incubare 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 1 x 10 6 cellule / pozzetto ai pozzetti pre-rivestite dopo aver scartato la soluzione di saturazione (punto 4.2.2) e incubare 1 ora a 37 ° C. </li><li> Quantificare l'adesione utilizzando un lettore ELISA (eccitazione del filtro: 485 nm, filtro di emissione: 535 nm). Eseguire una prima misura sul totale in ingresso (INPUT). </li><li> Lavare la piastra delicatamente con 2% BSA-PBS (200 ml / pozzetto) 4 volte (x). Eseguire una lettura della piastra dopo ogni lavaggio (Adesione x). </li><li> Dopo la sottrazione del fondo per ogni misurazione, calcolare ADHES specificiion (adesione): <img alt="Equazione 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq2.jpg"></li></ol> 4.3) test di polimerizzazione. Questo è un saggio colorimetrico che quantifica F-actina polimerizzazione. Eseguire il test in triplice copia. <ol><li> Risospendere 1x10 ^ 6 cellule in 100 ml di pre-riscaldato completo RPMI e aggiungere lo stimolo specifico (ad esempio α-IgM 20 mg / ml) per 10 min. </li><li> Arrestare la reazione con 400 ml di paraformaldeide al 4% e fissare le cellule per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare 3 volte con PBS (centrifugare a 300 xg per 5 min, 4 ° C). </li><li> Eliminare le cellule surnatante e permeabilize con PBS-saponina 0,2% (200 ml) in ghiaccio per 2 min. </li><li> Lavare 3 volte con PBS-saponina 0,1% (centrifugare a 100 xg per 5 min, 4 ° C), scartare il surnatante e risospendere in 100 microlitri di PBS-saponina 0,1%. </li><li> Colorare con falloidina-AlexaFluor 488 (3 mg / ml) per 30 minuti a T ambienteemperatura nel buio. </li><li> Lavare 3 volte con PBS-0.1% saponine. Eliminare il supernatante e risospendere in 300 microlitri di PBS. </li><li> Quantificare la quantità di F-actina mediante citometria a flusso, calcolare l'intensità media Florescence (MFI) del falloidina. Analizzare i dati generati in un singolo appezzamento dimensione per produrre un istogramma basato sull'intensità fluorescente, il valore di MFI viene mostrato nel report grafico. </li><li> Misurare polimerizzazione F-actina (Δ F-actina) come: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51942/51942eq3.jpg"></li></ol>

<ol><li>Caligaris-Cappio, F., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+in+chronic+lymphocytic+leukemia%3A+are+we+getting+closer+to+understanding+the+pathogenesis+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Novel insights in chronic lymphocytic leukemia: are we getting closer to understanding the pathogenesis of the disease.</a> J Clin Oncol. 26, 4497-4503 (2008).</li>
<li>Rawstron, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+B-cell+lymphocytosis+and+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Monoclonal B-cell lymphocytosis and chronic lymphocytic leukemia.</a> N Engl J Med. 359, 575-583 (2008).</li>
<li>Dagklis, A., Fazi, C., Scarfo, L., Apollonio, B., Ghia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+B+lymphocytosis+in+the+general+population%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Monoclonal B lymphocytosis in the general population.</a> Leuk Lymphoma. 50, 490-492 (2009).</li>
<li>Fazi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+population+low-count+CLL-like+MBL+persists+over+time+without+clinical+progression%2C+although+carrying+the+same+cytogenetic+abnormalities+of+CLL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">General population low-count CLL-like MBL persists over time without clinical progression, although carrying the same cytogenetic abnormalities of CLL.</a> Blood. 118, 6618-6625 (2011).</li>
<li>Caligaris-Cappio, F., Bertilaccio, M. T., Scielzo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+microenvironment+wires+the+natural+history+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">How the microenvironment wires the natural history of chronic lymphocytic leukemia.</a> Seminars in cancer biology. , (2013).</li>
<li>Damle, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ig+V+gene+mutation+status+and+CD38+expression+as+novel+prognostic+indicators+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ig V gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 94, 1840-1847 (1999).</li>
<li>Lanham, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+signaling+via+surface+IgM+is+associated+with+VH+gene+mutational+status+and+CD38+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential signaling via surface IgM is associated with VH gene mutational status and CD38 expression in chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 101, 1087-1093 (2003).</li>
<li>Wiestner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZAP-70+expression+identifies+a+chronic+lymphocytic+leukemia+subtype+with+unmutated+immunoglobulin+genes%2C+inferior+clinical+outcome%2C+and+distinct+gene+expression+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ZAP-70 expression identifies a chronic lymphocytic leukemia subtype with unmutated immunoglobulin genes, inferior clinical outcome, and distinct gene expression profile.</a> Blood. 101, 4944-4951 (2003).</li>
<li>Mulligan, C. S., Thomas, M. E., Mulligan, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes%2C+B+lymphocytes%2C+and+clonal+CLL+cells%3A+observations+on+the+impact+of+the+new+diagnostic+criteria+in+the+2008+Guidelines+for+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+%28CLL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes, B lymphocytes, and clonal CLL cells: observations on the impact of the new diagnostic criteria in the 2008 Guidelines for Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL).</a> Blood. 113, 6496-6497 (2009).</li>
<li>Conti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+study+of+human+cerebrospinal+fluid+following+traumatic+brain+injury+indicates+fibrin%28ogen%29+degradation+products+as+trauma-associated+markers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Proteome study of human cerebrospinal fluid following traumatic brain injury indicates fibrin(ogen) degradation products as trauma-associated markers.</a> J Neurotrauma. 21, 854-863 (2004).</li>
<li>Mortz, E., Krogh, T. N., Vorum, H., Gorg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+silver+staining+protocols+for+high+sensitivity+protein+identification+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization-time+of+flight+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis.</a> Proteomics. 1, 1359-1363 (2001).</li>
<li>Zhang, W., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProFound%3A+an+expert+system+for+protein+identification+using+mass+spectrometric+peptide+mapping+information%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">ProFound: an expert system for protein identification using mass spectrometric peptide mapping information.</a> Anal Chem. 72, 2482-2489 (2000).</li>
<li>Scielzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+protein+is+differentially+expressed+in+chronic+lymphocytic+leukemia+patient+subsets+with+good+or+poor+prognoses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">HS1 protein is differentially expressed in chronic lymphocytic leukemia patient subsets with good or poor prognoses.</a> J Clin Invest. 115, 1644-1650 (2005).</li>
<li>Muzio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+complexes+with+cytoskeleton+adapters+in+normal+and+malignant+chronic+lymphocytic+leukemia+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">HS1 complexes with cytoskeleton adapters in normal and malignant chronic lymphocytic leukemia B cells.</a> Leukemia. 21 (9), 2067-2070 (2007).</li>
<li>Scielzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+has+a+central+role+in+the+trafficking+and+homing+of+leukemic+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">HS1 has a central role in the trafficking and homing of leukemic B cells.</a> Blood. 116, 3537-3546 (2010).</li>
<li>Kashuba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+B-cell+receptor+signaling+in+chronic+lymphocytic+leukaemia+reveals+a+possible+role+for+kininogen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukaemia reveals a possible role for kininogen.</a> J Proteomics. 91, 478-485 (2013).</li>
<li>Dhamoon, A. S., Kohn, E. C., Azad, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ongoing+evolution+of+proteomics+in+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">The ongoing evolution of proteomics in malignancy.</a> Drug Discov Today. 12, 700-708 (2007).</li>
<li>Ummanni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clinically+relevant+protein+targets+in+prostate+cancer+with+2D-DIGE+coupled+mass+spectrometry+and+systems+biology+network+platform%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of clinically relevant protein targets in prostate cancer with 2D-DIGE coupled mass spectrometry and systems biology network platform.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> Lo scopo di questo manoscritto è di descrivere un protocollo ottimizzato per l&#39;identificazione di molecole coinvolte nella patogenesi della LLC, anche se questo approccio può essere esteso ad altre malattie e / o altri tipi di campioni 16-18. Confrontando i profili proteomici di 2 sottogruppi di pazienti con LLC, buoni vs cattivi prognosi 19, abbiamo dimostrato che differiscono per lo stato di fosforilazione di HS1 e che la sua attivazione colpisce la migrazione e l&#39;adesione ...

Leucemia linfocitica cronica (CLL), la leucemia dell&#39;adulto più comune nei paesi occidentali, deriva dall&#39;accumulo di monoclonali CD5 + linfociti B neoplastici ed è clinicamente molto eterogenea. Può essere presente come una forma di pre-leucemiche, definito come linfocitosi monoclonale delle cellule B (MBL) 1,2,3. In altri casi la malattia può apparire sia con un decorso clinico indolente, che può rimanere stabile per anni prima di avere bisogno del trattamento, o come una malattia chemorefractory progressiva con prognosi infausta nonostante la terapia. Infine, si può progredire in un linfoma di alto grado spesso letali (sindrome di Richter-RS) 2,3,4. I pazienti sono di solito classificati in due sottogruppi principali: il bene e il male prognosi, sulla base di un insieme di fattori prognostici che fornisce informazioni complementari sui predittori di outcome malattia e la sopravvivenza. Eterogeneità clinica probabilmente riflette l&#39;eterogeneità biologica. Un certo numero di genetica, microambientali e cefattori llular hanno dimostrato di concorrere alla patogenesi della malattia anche se sono stati trovati 5 meccanismi unificanti. In particolare, diversi studi hanno dimostrato che le differenze nel decorso clinico della malattia può essere in parte spiegato con la presenza (o l&#39;assenza) di alcuni marcatori biologici che hanno un valore prognostico 6,7,8. Questi dati hanno dimostrato che una migliore comprensione della biologia della malattia potrebbe fornire spunti ulteriori per la gestione clinica della patologia, tramite l&#39;identificazione di entrambi i marcatori prognostici e bersagli terapeutici. L&#39;obiettivo del presente lavoro è quello di mostrare come una combinazione di diverse tecniche di proteomica può essere utilizzato per l&#39;identificazione di proteine ​​coinvolte nella LLC insorgenza e la progressione. Il nostro approccio dimostra che è possibile unire insieme proteomica di base e dati clinici 5. Nella presente flusso di lavoro, primarie cellule leucemiche di pazienti selezionati(Buono vs cattivo prognosi) sono isolati e lisati cellulari vengono poi utilizzati per ottenere mappe proteomiche. 2DE permette la caratterizzazione del profilo proteomico di una popolazione di cellule, comprese le modificazioni post-traduzionali, dando così informazioni indirette sull&#39;attività biologica di ciascuna proteina. Lisati cellulari totali vengono risolti da una prima pista di dimensione in base al punto isoelettrico, seguita da una seconda dimensione eseguito su un gel di poliacrilammide che risolve le proteine ​​in base al loro peso molecolare. Analisi comparativa delle mappe proteomiche permette l&#39;identificazione delle proteine ​​differenzialmente espresse (sia in termini di abbondanza e modificazioni post-traduzionali) come macchie sul gel che possono essere tagliati e analizzati da spettrometria di massa. Il ruolo di ciascun candidato può essere poi sfruttata da diversi saggi. Tale approccio, limitato alla CLL nel manoscritto corrente, può essere facilmente esteso ad altre malattie / campioni, fornendo così informazioni sulla proteomic / differenze biologiche tra i due gruppi (cioè patologiche vs normale, stimolati vs non stimolato, wild-type vs knockdown).

<table><tbody><tr><td>Acetonitril</td><td>MERCK</td><td>61830025001730&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>SIGMA</td><td>A6141-500G</td><td></td></tr><tr><td>1,4-ditioeritritolo</td><td>SIGMA</td><td>D9680-5G</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>SIGMA</td><td>I6125-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>SIGMA</td><td>223506-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, grado di sequenziamento</td><td>ROCHE</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;- acido ciano-4-idrossicinnamico</td><td>SIGMA</td><td>C2020-10G</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico</td><td>SIGMA</td><td>T6580</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip&micro;-C18</td><td>MILLIPORE</td><td>ZTC18M096</td><td></td></tr><tr><td>RosettaSep Cocktail di arricchimento di cellule B umane</td><td>STEMCELL</td><td>15064</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>EUROCLONE</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>DOMINIQUE DUTSCHER</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>SENTINEL DIAGNOSTICS</td><td>1114547</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>SIGMA</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07770</td><td>ECD</td></tr><tr><td>CD5</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07754</td><td>PC5</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07746</td><td>FITC</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD</td><td>345785</td><td>PE</td></tr><tr><td>CD16</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07767</td><td>PC5</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>082A07789</td><td>PC5</td></tr><tr><td>Ettan IPGphor 3 Unità di messa a fuoco isoelettrica</td><td>GE-Healthcare</td><td>11-0033-64&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>SIGMA</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL Tampone</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>SIGMA</td><td>C2020-10G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>SIGMA</td><td>D9163-5G</td><td></td></tr><tr><td>IPGstrips</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-1233-01&nbsp;</td><td>pH lineare 4-7 18cm</td></tr><tr><td>IPGbuffer</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-6000-86</td><td>pH 4-7</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>SIGMA</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>PROTEAN II XL Cell</td><td>BIO-RAD</td><td>165-3188</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>INVITROGEN</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>INVITROGEN</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>SIGMA</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>VWR</td><td>631000</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>BIO-OPTICAL</td><td>05-K01009</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR</td><td>9832500</td><td></td></tr><tr><td>Tiosolfato di sodio</td><td>FLUKA</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato d'argento</td><td>FLUKA</td><td>85228</td><td></td></tr><tr><td>Dinamica molecolare Densitometro laser SI personale</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageMaster 2D Platinum 5.0</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di sodio</td><td>MERCK</td><td>A0250292</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF Voyager-DE STR</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data Explorer software (versione 3.2)&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>camera transwell diametro 6,6 mm</td><td>CORNING</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>EUROCLONE</td><td>ECB2000L</td><td>CON L-GLUTAMMINA</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>SIGMA</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1</td><td>PREPROTECH</td><td>300-28A</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SANTA CRUZ</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>720-IC</td><td></td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>Life Thechnology</td><td>C7025</td><td>IgM verde</td></tr><tr><td></td><td>SOUTHERNBIOTECH</td><td>2020-02</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>SIGMA</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>SIGMA</td><td>S-7900</td><td></td></tr><tr><td>Falloidina&nbsp;</td><td>Vita Tecnologia</td><td>A12379</td><td>Alexa fluor 488</td></tr></tbody></table>

da un 2de-gel spot proteine ​​funzione: lesson learned from hs1 nella leucemia linfocitica cronica

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

L&#39;identificazione di molecole coinvolte nell&#39;iniziazione e progressione tumorale è fondamentale per la biologia comprensione della malattia e, di conseguenza, per la gestione clinica dei pazienti. Nel presente lavoro descriviamo un approccio proteomico ottimizzato per l&#39;identificazione di molecole coinvolte nella progressione della leucemia linfocitica cronica (CLL). Nel dettaglio, lisati di cellule leucemiche sono risolte da 2-dimensionale elettroforesi (2DE) e visualizzate come &quot;macchie&quot; sui gel 2DE. Analisi comparativa delle mappe proteomiche permette l&#39;identificazione delle proteine ​​differenzialmente espressi (in termini di abbondanza e modificazioni post-traduzionali) che vengono raccolti, isolato e identificato da spettrometria di massa (MS). La funzione biologica dei candidati individuati può essere controllata con diversi saggi (cioè la migrazione, adesione e polimerizzazione F-actina), che abbiamo ottimizzato per le cellule leucemiche primarie.

Abbiamo isolato le cellule B leucemiche primarie formano PB di pazienti affetti da LLC e abbiamo analizzato le mappe proteomiche. I campioni (n = 104) sono stati raggruppati in due sottoinsiemi principali in base alle caratteristiche cliniche di ciascun paziente (cattiva prognosi vs buona prognosi) ed è stata eseguita l'analisi comparativa dei gel 2DE. L'identificazione analisi ha permesso di spot differenzialmente espressi tra i due sottoinsiemi (in termini di presenza / assenza o ...

Qui si descrive un protocollo che le coppie due tecniche di proteomica, cioè 2-dimensionale elettroforesi (2DE) e spettrometria di massa (MS), per identificare differenzialmente espressi / proteine ​​modificate post-traduzionali tra due o più gruppi di campioni elementari. Questo approccio, insieme a esperimenti funzionali, permette l&#39;identificazione e la caratterizzazione di marcatori prognostici / bersagli terapeutici.

Da un 2DE-Gel Spot Proteine ​​Funzione: Lesson Learned From HS1 nella leucemia linfocitica cronica

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di utilizzare un approccio proteomico combinato per identificare potenziali marcatori prognostici e/o bersagli terapeutici nelle malattie umane. Ciò si ottiene isolando le cellule leucemiche primarie dal sangue periferico del paziente, con prognosi buona o cattiva, ed esprimendo sia i marcatori di superficie CD 19 che CD cinque da utilizzare per l'analisi proteomica come seconda fase. I lisati delle cellule leucemiche vengono risolti mediante elettroforesi bidimensionale o due de, e il confronto delle mappe proteomiche consente l'identificazione di spot espressi in modo differenziale tra pazienti con prognosi buona e cattiva, che possono essere successivamente identificati mediante spettrometria di massa o MS.Successivamente, è possibile utilizzare diversi saggi per convalidare e analizzare il ruolo delle proteine identificate nella storia naturale della malattia. I risultati mostrano che il diverso stato di fosforilazione dell'HS, rilevato da due degel, è correlato con l'esito clinico dei pazienti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia della leucemia linfatica cronica perché può aiutare ad identificar

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Questo protocollo descrive un approccio per interrogare le regioni VDJ della catena pesante delle immunoglobuline ricombinate dei linfomi mediante sequenziamento profondo e recuperare il riarrangiamento VDJ e lo stato di ipermutazione somatica per delineare l'architettura clonale del singolo tumore. Il confronto dell'architettura clonale tra la diagnosi accoppiata e i campioni di recidiva rivela le modalità di evoluzione clonale della recidiva del linfoma.

VDJ-Seq: sequenziamento analisi profonda di riorganizzate Immunoglobuline catena pesante gene per rivelare clonale Evoluzione Modelli di linfoma B cellulare

Il protocollo qui descritto rappresenta un metodo semplice e riproducibile che impiega la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa (RP-HPLC) per misurare il metabolismo delle purine su cellule di leucemia linfatica cronica (LLC) coltivate in diverse condizioni.

HPLC-based test per monitorare extracellulare Nucleotide / nucleosidici metabolismo in cronica cellule umane leucemia linfocitica

Qui descriviamo un sistema di classificazione delle celle citometriche a flusso combinato e un protocollo di costruzione della libreria di nuova generazione, progettato per produrre dati di alta qualità e di esito intero dalle cellule Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) del linfoma classico Hodgkin (CHL).

Selezione del flusso e sequenza di Exome delle cellule Reed-Sternberg del linfoma classico di Hodgkin

Algoritmi esistenti generano una soluzione per un set di dati di rilevamento biomarcatore. Questo protocollo dimostra l'esistenza di molteplici soluzioni similmente efficaci e presenta un software user-friendly per aiutare i ricercatori biomedici indagare il loro set di dati per la sfida proposta. Gli informatici possono anche fornire questa funzionalità nel loro biomarcatore algoritmi di rilevamento.

Selezionando più biomarcatore sottoinsiemi con similmente efficace classificazione binaria spettacoli

Qui, presentiamo un protocollo che dettagli gli aspetti tecnici e requisiti essenziali affinché robusta analisi di sequenza del gene di IG in pazienti con la leucemia linfocitaria cronica (CLL), basato sull'esperienza accumulata dell'iniziativa di ricerca europea su CLL (ERIC).

Analisi di sequenza di Gene dell'immunoglobulina nella leucemia linfocitaria cronica: Da materiale paziente all'interpretazione di sequenza

Leucemia linfocitaria cronica (CLL) è la leucemia più comune nel mondo occidentale. Fattori di trascrizione NFAT sono importanti regolatori dello sviluppo e attivazione in numerosi tipi cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per l'uso di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in cellule CLL umane per identificare geni di nuovi target di NFAT2.

Un'analisi di immunoprecipitazione della cromatina per identificare geni bersaglio NFAT2 romanzo nella leucemia linfocitaria cronica

Utilizzando sistemi di coltura di multi-step, segnaliamo un in vitro delle cellule B al modello di differenziazione delle cellule di plasma.

In Vitro modello di differenziazione delle cellule di memoria umana normale B a plasmacellule longevo

Qui descriviamo due approcci per caratterizzare gli eventi di polarizzazione cellulare nei linfociti B durante la formazione di un IS. Il primo, comporta la quantificazione del reclutamento di organelli e riarrangiamenti del citoscheletro nella membrana sinaptica. Il secondo è un approccio biochimico, per caratterizzare i cambiamenti nella composizione del centrosome, che subisce la polarizzazione alla sinapsi immunitaria.

Studiare le dinamiche di Organelle nelle cellule B durante la formazione immunitaria di sinapsi

Questo protocollo consente l'ottimizzazione e la successiva generazione efficiente di frazioni nucleari e citoplasmiche dalle cellule leucemiche linfocitiche croniche primarie. Questi campioni sono utilizzati per determinare la localizzazione delle proteine e i cambiamenti nel traffico di proteine che si svolgono tra i compartimenti nucleari e citoplasmatici dopo la stimolazione cellulare e il trattamento farmacologico.

Frazione subcellulare delle cellule linfonetiche croniche primarie per monitorare il traffico di proteine nucleari/citoplasmiche

Qui presentiamo un protocollo utilizzato per eseguire esperimenti di microscopia a forza di trazione su cellule B. Descriviamo la preparazione di gel morbidi in poliacrilammide e la loro funzionalizzazione, nonché l'acquisizione dei dati al microscopio e un riepilogo dell'analisi dei dati.

Microscopia a forza di trazione per studiare l'attivazione dei linfociti B

Abbiamo utilizzato la colorazione della proliferazione cellulare per identificare le cellule quiescenti nel modello di leucemia linfoblastica acuta T di zebrafish. La colorazione viene trattenuta nelle cellule non in divisione e ridotta durante la proliferazione cellulare, consentendo la selezione delle cellule dormienti per ulteriori interrogatori. Questo protocollo fornisce uno strumento funzionale allo studio dell'autorinnovamento nel contesto della quiescenza cellulare.

Identificazione di cellule quiescenti in un modello di leucemia linfoblastica acuta a cellule T di pesce zebra mediante colorazione della proliferazione cellulare 

Scopri l'approccio proteomico combinato 2DE e spettrometria di massa per identificare marcatori prognostici nella leucemia linfocitica cronica. Questo metodo aiuta a rivelare bersagli terapeutici validati.

Da un 2DE-Gel Spot Proteine ​​Funzione: Lesson Learned From HS1 nella leucemia linfocitica cronica

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