Name: Misurazione spaziale e temporale Ca 2 + Segnali in Arabidopsis Piante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Scopri come monitorare i segnali di calcio spaziali e temporali in Arabidopsis utilizzando indicatori geneticamente codificati. Questo metodo semplice e robusto permette di studiare le risposte allo stress abiotico nelle piante.

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Siamo grati a B. Stevenson per l'assistenza tecnica e al dottor Marc R. Knight per aver fornito la linea transgenica di equorina. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health Grant R01 GM059138.

1 aequorina Based Imaging Ca 2 + Uso del sistema FAS <ol><li> Preparare piantine per l&#39;imaging luminescenza. Sterilizzare semi di piante di Arabidopsis esprimenti aequorina con una soluzione di candeggina al 10% contenente 0,01% Triton-100. Seminare i semi sterili su un piatto quadrato (10 x 10 centimetri piatto quadrato Petri con griglia,) contenenti piena forza MS (Murashige e Skoog basale Sale Miscela), 1% di saccarosio, e il 1,2% agar. Piastre Inserire verticalmente in una camera di crescita dopo stratificazione a 4 ° C per 2 giorni (Figura 1A). </li><li> Trasferire le piantine su un film. Inserire un film adesivo (Figura 1B) sulla parte superiore del 7-10 giorno piantine che crescono sulla piastra. Spingere delicatamente la pellicola a mano per garantire che le piantine aderiscono alla pellicola (Figura 1C). Sbucciare la pellicola delicatamente in modo che le piantine restano aderito al film (Figura 1D e 1E) </li><li> Incubare le piantine con cofattore. Posizionare l&#39;unapiantine dhered sulla piastra quadrata (10 x 10 cm) contenente 15 ml di 2 mg / ml h-CTZ (coelenterazine) in acqua. Incubare le piantine a temperatura ambiente per 4 ore a notte (Figura 1F). </li><li> Preparare per l&#39;imaging luminescenza. Prendere la pellicola dalla soluzione h-CTZ e tagliarlo a metà, formando due pezzi. Mettere ogni pezzo di pellicola con piantine a faccia in su in due piatti diversi. Lasciare le piastre al buio per 5 min. </li><li> Acquisire le immagini di luminescenza. Nel buio, posizionare le due piastre accanto all&#39;altro sul palco del sistema di imaging luminescenza (Figura 1G). Acquisire immagini immediatamente dopo l&#39;aggiunta di 20 ml di soluzione di stimoli alle piastre simultaneamente. </li><li> Analizzare le immagini di luminescenza. Scegliere lo stesso intervallo di visualizzazione per tutte le immagini di luminescenza. Ritagliare la regione di interesse (ROI) e generare le immagini come file JPEG (Figura 2A). In alternativa, esportare le immagini come file in formato SPE e importarli nelSoftware di analisi delle immagini ImageJ. Impostare le misure per il calcolo del valore medio grigio di ROI. Selezionare la stessa dimensione di area ROI e misurare i dati di grigi e presentano media come grafici a barre (Figura 2b). </li></ol> 2. cellulare dal vivo confocale Imaging Ca 2 + <ol><li> Preparare piantine per l&#39;imaging confocale. Sterilizzare semi di piante di Arabidopsis esprimenti case12 con una soluzione di candeggina al 10% contenente 0,01% Triton. Seminare i semi sterili su un piatto contenente sali di resistenza pieno MS, 1% di saccarosio, e 1.2% agar. Inserire piastre verticalmente in una camera di crescita dopo stratificazione a 4 ° C per 2 giorni. </li><li> Chambers Setup Imaging <ol><li> Montare una camera di imaging utilizzando un vetrino e coprioggetto (Sezione A). Posizionare un pezzo di cotone idrofilo imbevuto di acqua sul centro della diapositiva. Poi il trasferimento di uno o due piantine cinque giorni dalla piastra sulla parte superiore di acqua imbevuto cotone. Stick piccoli pezzi di argilla per ogni angolo di un coprioggetto, und coprioggetto posto sulla cima di piantine per creare un gap (camera) tra il vetrino e il vetrino (Figura 3A, pannello di sinistra). Collegare un&#39;estremità del tubo di polietilene (diametro 0,58 millimetri) per una siringa da 1 ml e posizionare l&#39;altra estremità del tubo immediatamente adiacente alla camera. Tenere il tubo in posizione con nastro adesivo (Figura 3A, pannello di destra). </li><li> Montare una camera di imaging utilizzando una camera di plexiglass (Sezione B). <ol><li> Stendere un sottile strato di grasso al silicone attorno a due tubi in polietilene (diametro 0,58 millimetri) e premere i tubi rivestiti nei canali su ogni lato della camera di plexiglass (Figura 3B sinistra del pannello). Stendere un velo di grasso al silicone sulla superficie della camera che contiene le scanalature del tubo e premere un coprioggetto nel grasso per sigillare un lato della camera di apertura (tagliate). </li><li> Trasferire una cinque giorni di età piantina dal piatto nella camera e mettere un batuffolo di cotone imbevuto di acqua sulla parte superiore of la piantina. Spalmare grasso al silicone sulla altra superficie della camera, e premere un altro coprioggetto sulla parte superiore per sigillare. Collegare l&#39;estremità di uno dei tubi di una siringa da 1 ml. Lasciare l&#39;estremità dell&#39;altro tubo aperto (Figura 3B pannello di destra). </li></ol></li><li> Preparare una camera di imaging con una copertura in vetro a camera (Sezione C). Sterilizzare il vetro di copertura camerata con il 70% di etanolo e lasciare sul cofano fino a secco. Aggiungere 0,6 ml o 0,2 ml di MS media resistenza completa contenente 1% di saccarosio e 0,5% phytagel in ciascun pozzetto di una camera 2-bene o una camera da 8 pozzetti (Figura 3C pannello di destra), rispettivamente. Sterilizzare i semi e seminare i semi direttamente in un vetro di copertura camerata contenente un sottile strato di gel trasparente e farli crescere in verticale per 5 giorni (Figura 3C). </li></ol></li><li> Acquisire le immagini utilizzando un microscopio confocale. Per applicare stimoli di stress, come il sale, il freddo o il perossido, iniettare lentamente circa 200 ml di 150 mM NaCl, ice-cold acqua o 1 mM soluzione H 2 O 2 nella camera (Sezione A o B) appena prima di acquisire immagini, o aggiungere lentamente 500 ml o 100 ml di soluzione di stimolo al pozzo di una camera a 2 o 8 pozzetti, rispettivamente, . Catturare immagini subito dopo l&#39;applicazione della soluzione stimolo utilizzando un microscopio confocale a scansione laser Nikon A1R invertita con un obiettivo 20X immersione in acqua (apertura numerica 0,75). Raccogliere una serie temporale di immagini ad intervalli di 4 sec con eccitazione e di emissione lunghezze d&#39;onda di 488 nm e 500-550 nm, rispettivamente, e ad una risoluzione in pixel di 512 x 512. </li><li> Image Analysis Utilizzando Nikon Elementi, ROI, compilati intorno a ciascuna cella (o area) di interesse. Intensità totale all&#39;interno di ogni ROI è stata misurata nel tempo utilizzando la finestra di dialogo Tempo di misura (ImageJ può essere usato al posto). Misure totali intensità sono stati esportati ed elaborati in Datagraph. Ca 2 + ampiezza picco è stata definita come l&#39;intensità di picco meno di riposo intensità, durata come the di tempo tra l&#39;inizio e il completamento di un picco, e il periodo come l&#39;intervallo di tempo tra i picchi picco adiacenti di due punte. t-test è stato utilizzato per confrontare i mezzi. </li></ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+the+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: the lead currency of plant information processing.</a> Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+screening+Arabidopsis+mutants+with+disordered+abiotic+stress-induced+calcium+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal.</a> J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+calcium+signalling+pathways+regulate+calmodulin+gene+expression+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco.</a> Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).</li>
<li>Johnson, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+oscillations+of+cytosolic+and+chloroplastic+free+calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants.</a> Science. 269 (5232), 489-503 (1995).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signature+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation.</a> Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).</li>
<li>Logan, D. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+cytosolic+calcium+dynamics+are+differentially+regulated+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants.</a> Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).</li>
<li>Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+calcium+responses+to+drought%2C+salt+and+cold+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root.</a> Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Souslova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+fluorescent+protein-based+Ca2%2B+sensors+with+increased+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range.</a> BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).</li>
<li>Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nucleotides+elicit+cytosolic+free+calcium+oscillations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).</li>
<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+the+cytoplasmic+Ca2%2B+concentration+is+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).</li>
<li>Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear-targeted+Cameleon+demonstrates+intranuclear+Ca2%2B+spiking+in+Medicago+truncatula+root+hairs+in+response+to+rhizobial+nodulation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).</li>
<li>Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Cameleons+to+different+subcellular+compartments+reveals+a+strict+cytoplasmic%2Fmitochondrial+Ca2%2B+handling+relationship+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells.</a> Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics.</a> Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+accumulation+and+dynamics+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Arabidopsis+root+cells+using+a+genetically+encoded+Cameleon+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor.</a> Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+in+plant+peroxisomes%3A+An+in+vivo+analysis+uncovers+a+Ca2%2B+dependent+scavenging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system.</a> Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).</li>
<li>Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+in+innate+immunity-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death.</a> EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo dimostrato un sistema FAS per la registrazione del spazio-temporale Ca 2 + risposta di piantine di Arabidopsis. Questo 2+ sistema di registrazione FAS Ca offre un approccio semplice, sensibile e robusto che può essere adattato per misurare Ca 2 + dinamiche innescate da vari stimoli, oltre agli stimoli di stress abiotici che vengono presentati qui. Utilizzando questo sistema, siamo in grado di confrontare facilmente tessutale o stimoli specifici spazio-temporali Ca 2 + ...

La cellula vegetale risponde all&#39;ambiente via di segnalazione che coordina le azioni delle cellule. Una cella all&#39;inizio di segnalazione evento in risposta a stimoli ambientali è un transitorio aumento di Ca 2 +. Il modello, o la firma di un aumento transitorio della concentrazione di Ca 2 + libero si caratterizza per la sua ampiezza, frequenza e durata. Firme Ca 2 + spazio-temporali distinti regolano diverse attività cellulari 1. Stimoli specifici, come il caldo, il freddo, il sale, la siccità, la luce, o ormoni vegetali, possono ottimizzare l&#39;attività spazio-temporale della membrana localizzata Ca 2 + canali e / o trasportatori, con conseguente specifici Ca 2 + firme. Sebbene Ca 2 + trasportatori sono stati ben caratterizzati, poco si sa circa l&#39;identità molecolare e le funzioni dei canali del Ca 2 + nelle piante 1. Schermi genetici per mutanti con alterata Ca 2 + risposta allo stress stimoli possono essere un efficace approach per identificare i componenti che compongono Ca 2 + firme. Sistemi di rilevamento Ca 2 + Recentemente fonda diversi aequorina sono stati sviluppati che facilitano schermi genetici per Ca 2 + componenti di segnalamento in risposta agli attacchi patogeni e stress abiotici 2-4. Aequorina è stato utilizzato prima per rilevare Ca 2 + segnali nelle piante nei primi anni 1990 5. Da allora, equorina è stata mirata ai vari compartimenti cellulari, come il citoplasma 5, nucleo 6, 7 cloroplasti, tonoplasto 8, 9 mitocondri, stroma e 10, nonché di differenti tipi cellulari nella radice di monitorare cella specifica Ca 2 + segnali 11. Ca 2 + base aequorina misurazioni rivelano l&#39;spaziale e temporale Ca 2 + risposta di una popolazione di cellule allo stress stimoli. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, il Ca 2 + risposte di cellule singole sono unsynchronized nel tessuto risposta 4. Pertanto, la registrazione aequorina Ca 2 + non necessariamente riporta il segnale Ca 2 + in celle singole. Negli ultimi anni, proteina fluorescente geneticamente codificato (FP) a base di Ca 2 + indicatori, come cameleon giallo (YCS) 12 e CASEs12 13 sono stati utilizzati per studiare Ca 2 + di segnalazione ad alta risoluzione subcellulare. YCS sono fluorescenza trasferimento di energia di risonanza (FRET) a base di Ca 2 + indicatori, contenente PCP e YFP varianti aggiunto dal Ca 2 + -binding proteina calmodulina e-calmodulina legame peptide M13. Calmodulina subisce un cambiamento conformazionale in quanto si lega al Ca 2 +, quindi porta la PCP e YFP più vicini, con conseguente aumento del trasferimento di energia (maggiore FRET). Il livello di FRET nel corso del tempo, calcolato approssimativamente come il rapporto tra YFP per intensità di segnale della PCP, riflette intracellulare Ca 2 + dinamica. Diverse versioni YC sono stati utilizzati negli impianti. YC3.6 era targeted al citosol 14,15, 16 nucleo, mitocondri 17, e la membrana plasmatica 18, e YC4.6 e D4ER sono stati mirati al pronto soccorso 15,19, e D3cpv è stato destinato ai perossisomi 20. Le piante transgeniche esprimenti YCS consentono al live-cell imaging di Ca 2 + dinamiche all&#39;interno di diversi compartimenti cellulari di diversi tipi di cellule. Casi (presumibilmente Ca lcium se nsor) sono singole proteine ​​circolarmente permutati fluorescenti (cpFPs) ospitano una calmodulina e-calmodulina legame peptide M13. Al legame con Ca 2 +, casi subiscono cambiamenti conformazionali, portando ad un aumento di intensità di fluorescenza. La correlazione tra la risposta di fluorescenza del CASE e Ca 2 + permette la concentrazione intracellulare di Ca 2 + dinamiche da misurare quantitativamente. La variante Case12 è 12 volte maggiore fluorescenza nelle Ca 2 + forme -saturated. N. piante benthiminana transitoriamente expressing Case12 o piante di Arabidopsis che esprimono stabilmente involucro 12 sono stati utilizzati per studiare Ca 2 + Segnalazione di difesa e lo stress abiotici 4,21. Asincrono Ca spaziale e temporale 2+ oscillazioni nelle cellule rispondono agli attacchi patogeni, o per lo stress disidratazione sono stati rivelati con base Case12 Ca 2 + imaging. Qui, vi presentiamo le istruzioni dettagliate per aequorina basato luminescenza imaging tessuto- e stimoli specifici Ca 2 + dinamiche di piantine di Arabidopsis, e per l&#39;imaging confocale di citosolico e nucleare Ca 2 + dinamiche nelle cellule della radice di Arabidopsis che esprimono, causa 12 Luminescence imaging FAS potrebbe essere adattato per l&#39;analisi di stress-indotta Ca 2 + dinamiche in impianti o tessuti qui non descritti intatti, o per lo screening popolazioni di piante di Arabidopsis mutagenizzate per mutanti con alterata dello stress indotto Ca 2 + segnali. La configurazione Imaging Ca 2 + cellule vive potrebbe essere adattato per analizzare Ca2+ dinamiche all&#39;interno diversi scomparti subcelluar o in diversi tipi di cellule utilizzando altri indicatori di Ca 2 +.

<table><tbody><tr><td>Piastra di Petri quadrata 10 cm x 10 cm</td><td>VWR</td><td>60872-310</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola adesiva</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polietilene</td><td>PerkinElmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>VWR</td><td>53548-000</td><td></td></tr><tr><td>Grasso siliconico</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>vetro di copertura a 2 pozzetti&nbsp;</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td></td></tr><tr><td>vetro di copertura a 8 pozzetti</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging a luminescenza</td><td>Princeton Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale invertito a scansione laser</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon A1R&nbsp;</td></tr><tr><td>Software di imaging</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Elementi Nikon&nbsp;</td></tr><tr><td>DataGraph</td><td>Visual Data Tools Inc</td><td>N/A</td><td>DataGraph 3.1.1 è la versione più recente</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>NanoLight Technolgies</td><td>#301B NF-BCTZ-FB</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina per tutti gli usi</td><td>Qualsiasi negozio locale</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151500</td><td></td></tr><tr><td>MS sale</td><td>Phytotechnology Labs</td><td>M524-50L</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>VWR</td><td>BDH8029-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione spaziale e temporale ca 2 + segnali in arabidopsis piante

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Spunti di sviluppo e ambientali inducono Ca 2 + fluttuazioni di cellule vegetali. Specifica-Stimolo spazio-temporali Ca 2 + modelli vengono rilevati da Ca 2 + legame proteine ​​cellulari che avviano Ca cascate di segnalazione 2 +. Tuttavia, sappiamo ancora poco su come i segnali di stimolo specifico Ca 2 + sono generati. La specificità di un segnale Ca 2 + può essere attribuito al sofisticato regolamentazione delle attività di Ca 2 + canali e / o trasportatori in risposta ad un dato stimolo. Per identificare questi componenti cellulari e capire le loro funzioni, è fondamentale utilizzare sistemi che permettono una registrazione sensibile e robusto di segnali Ca2 + sia a livello tissutale e cellulare. Geneticamente codificati Ca 2 + indicatori che sono indirizzate ai vari compartimenti cellulari hanno fornito una piattaforma per cellule in vivo confocale di cellulari Ca 2 + segnali. Qui si descrive l&#39;istruziones per l&#39;utilizzo di due sistemi di rilevamento Ca 2 +: aequorina basa FAS (film piantine adesivi) luminescenza Ca 2 + di imaging e case12 a base di cellule dal vivo confocale Ca 2 + imaging. Di imaging luminescenza utilizzando il sistema FAS fornisce un rilevamento semplice, robusta e sensibile spaziali e temporali Ca 2 + segnali a livello dei tessuti, mentre cellule vive di imaging confocale utilizzando Case12 fornisce rilevamento simultaneo di citosoliche e nucleari Ca 2 + segnali ad alta risoluzione.

Mannitolo, NaCl e H 2 O 2 sono stati utilizzati come proxy per gli stimoli disidratazione, il sale e lo stress ossidativo, rispettivamente. Per controllare se lo ione metallo pesante Cu 2 + sinergia con qualsiasi di questi tre stimoli di stress, abbiamo confrontato il Ca 2 + risposta ad ogni stimolo in presenza o assenza di Cu 2 +. Come mostrato in Figura 2, FAS di imaging luminescenza rivelato che piantine Arabidoposis risposto diversamente a disid...

Segnalazione Ca 2 + regola diversi processi biologici nelle piante. Qui vi presentiamo approcci per il monitoraggio di stress abiotico indotto Ca spaziale e temporale 2+ segnali nelle cellule e tessuti utilizzando le geneticamente codificati Ca 2 + indicatori aequorina o Case12 Arabidopsis.

Misurazione spaziale e temporale Ca 2 + Segnali in Arabidopsis Piante

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare un metodo per monitorare i segnali del calcio sia a livello cellulare che a livello dell'intera pianta. Ciò si ottiene coltivando prima le piantine sulla piastra di agar MS o direttamente all'interno della camera di imaging. Il secondo passo consiste nel trasferire le piantine su una pellicola adesiva o nel conservarle nella camera di imaging.Successivamente gli stimoli applicati alle piantine per indurre segnali di calcio. In definitiva, la luminescenza dello stile di vita o l'imaging a fluorescenza vengono utilizzati per mostrare rispettivamente la risposta dell'intera piantina o del calcio nucleare citosolico a diversi stimoli. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la singola pianta che si verifica, ad esempio, è che il saggio delle piantine adesive con pellicola è semplice, sensibile e robusto.Pertanto, questa tecnica può essere adattata allo screening ad alto rendimento per mutanti con risposte alterate al segnale del calcio. Inoltre, rispetto all'imaging del calcio su base piatta, l'utilizzo di un indicatore di calcio geneticamente codificato basato su GFP evita complicate im

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Cella di analisi specifica di<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Foglie usando fluorescenza activated cell sorting

Questo articolo fornisce un protocollo per la coltivazione di piantine di Arabidopsis in RootChip, una piattaforma di imaging microfluidico che combina controllo automatizzato delle condizioni di crescita con il monitoraggio radice al microscopio e FRET-based misura i livelli di metaboliti intracellulari.

Time-lapse imaging di fluorescenza della crescita Root Arabidopsis con manipolazione accelerato dell&#39;ambiente root usando il RootChip

Questo protocollo descrive un metodo per testare l'ipotesi che l'inversione del campo geomagnetico effettivo (GMF) induca un'espressione genica differenziale e alteri la morfologia di Arabidopsis thaliana. Un sistema ottagonale triassiale di coppie di bobine di Helmholtz è stato utilizzato per generare artificialmente condizioni GMF invertite nella camera di crescita delle piante.

Geomagnetico Field (Gmf) e Stabilimento Evolution: studio degli effetti di Gmf Storno su<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sviluppo e Gene Expression

Questo protocollo descrive un metodo semplice per analizzare segnali di calcio negli impianti generati da insetti Pentatomomorfi, come gli afidi. Thaliana di Arabidopsis trasformate con il biosensore di calcio GFP GCaMP3 consentire per l'imaging in tempo reale in vivo della dinamica del calcio con un'alta risoluzione temporale e spaziale.

Registrazione in tempo reale In Vivo di Arabidopsis segnali di calcio durante l'alimentazione dell'insetto utilizzando un biosensore fluorescente

Qui, presentiamo un protocollo per lo studio di comportamento di sviluppo di pianta e soprattutto fenotipi in maniera riproducibile. Vi mostriamo come fornire variabile e allo stesso tempo luce stabile condizione. Adeguata analisi dipendono dal numero di campione sufficiente e valide valutazioni statistiche.

Analisi del comportamento di crescita di Arabidopsis thaliana in diverse qualità di luce

Gibberellina percezione sensore 1 (GPS1) è il primo Förster risonanza energia basati su trasferimento biosensore per misurare i livelli cellulari di fitormoni gibberellina con un'alta risoluzione spazio-temporale. Questo protocollo segnala sul metodo per visualizzare e quantificare i livelli cellulari gibberellina utilizzando il biosensore codificato geneticamente nlsGPS1 in Arabidopsis ipocotili e punte delle radici.

Visualizzazione livelli gibberellina cellulare utilizzando l'energia di risonanza di Förster NlsGPS1 Transfer (FRET) biosensore

L'obiettivo di questo protocollo è quello di mostrare come caricare il CFDA in diversi siti delle parti inferiori di Arabidopsis. Presentiamo quindi il modello di distribuzione risultante di CF nei germogli.

Movimento shootward di CFDA Tracer caricato nei tessuti lavello inferiore di Arabidopsis

La segnalazione sistemica del calcio extracellulare innescata dal glutammato è fondamentale per l'induzione delle risposte della difesa delle piante al mento meccanico e all'attacco di erbivoro nelle piante. Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la dinamica spaziale e temporale di entrambi questi fattori utilizzando piante di thaliana arabidopsis che esprimono biosensori fluorescenti sensibili al calcio e al glutammato.

Imaging in tempo reale a ampio campo dei segnali di ferita locali e sistemici in Arabidopsis

In questo articolo, descriviamo uno strumento avanzato progettato per il monitoraggio della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi di de-eziolamento delle piantine di Arabidopsis . La nuova metodologia fornisce immagini non invasive in tempo reale della fluorescenza della clorofilla ad alta risoluzione spaziale e temporale.

Test non invasivo per la determinazione della cinetica della biosintesi della clorofilla durante le prime fasi della deeziolazione dell'Arabidopsis

Questa è una dimostrazione di come le membrane biologiche può essere compreso utilizzando modelli elettrici. Abbiamo anche dimostrare le procedure per la registrazione di potenziali d'azione dal cordone nervoso ventrale del gambero per i laboratori di orientamento degli studenti.

Modellazione membrane biologiche con Circuiti e misurazione dei segnali elettrici negli assoni: Esercizi di laboratorio per studenti

Scopri come monitorare i segnali di calcio spaziali e temporali in Arabidopsis utilizzando indicatori geneticamente codificati. Questo metodo semplice e robusto permette di studiare le risposte allo stress abiotico nelle piante.

Misurazione spaziale e temporale Ca^{2 +} Segnali in Arabidopsis Piante

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