Name: Misurazione spaziale e temporale Ca 2 + Segnali in Arabidopsis Piante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Scopri come monitorare i segnali di calcio spaziali e temporali in Arabidopsis utilizzando indicatori geneticamente codificati. Questo metodo semplice e robusto permette di studiare le risposte allo stress abiotico nelle piante.

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Siamo grati a B. Stevenson per l'assistenza tecnica e al dottor Marc R. Knight per aver fornito la linea transgenica di equorina. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health Grant R01 GM059138.

1 aequorina Based Imaging Ca 2 + Uso del sistema FAS <ol><li> Preparare piantine per l&#39;imaging luminescenza. Sterilizzare semi di piante di Arabidopsis esprimenti aequorina con una soluzione di candeggina al 10% contenente 0,01% Triton-100. Seminare i semi sterili su un piatto quadrato (10 x 10 centimetri piatto quadrato Petri con griglia,) contenenti piena forza MS (Murashige e Skoog basale Sale Miscela), 1% di saccarosio, e il 1,2% agar. Piastre Inserire verticalmente in una camera di crescita dopo stratificazione a 4 ° C per 2 giorni (Figura 1A). </li><li> Trasferire le piantine su un film. Inserire un film adesivo (Figura 1B) sulla parte superiore del 7-10 giorno piantine che crescono sulla piastra. Spingere delicatamente la pellicola a mano per garantire che le piantine aderiscono alla pellicola (Figura 1C). Sbucciare la pellicola delicatamente in modo che le piantine restano aderito al film (Figura 1D e 1E) </li><li> Incubare le piantine con cofattore. Posizionare l&#39;unapiantine dhered sulla piastra quadrata (10 x 10 cm) contenente 15 ml di 2 mg / ml h-CTZ (coelenterazine) in acqua. Incubare le piantine a temperatura ambiente per 4 ore a notte (Figura 1F). </li><li> Preparare per l&#39;imaging luminescenza. Prendere la pellicola dalla soluzione h-CTZ e tagliarlo a metà, formando due pezzi. Mettere ogni pezzo di pellicola con piantine a faccia in su in due piatti diversi. Lasciare le piastre al buio per 5 min. </li><li> Acquisire le immagini di luminescenza. Nel buio, posizionare le due piastre accanto all&#39;altro sul palco del sistema di imaging luminescenza (Figura 1G). Acquisire immagini immediatamente dopo l&#39;aggiunta di 20 ml di soluzione di stimoli alle piastre simultaneamente. </li><li> Analizzare le immagini di luminescenza. Scegliere lo stesso intervallo di visualizzazione per tutte le immagini di luminescenza. Ritagliare la regione di interesse (ROI) e generare le immagini come file JPEG (Figura 2A). In alternativa, esportare le immagini come file in formato SPE e importarli nelSoftware di analisi delle immagini ImageJ. Impostare le misure per il calcolo del valore medio grigio di ROI. Selezionare la stessa dimensione di area ROI e misurare i dati di grigi e presentano media come grafici a barre (Figura 2b). </li></ol> 2. cellulare dal vivo confocale Imaging Ca 2 + <ol><li> Preparare piantine per l&#39;imaging confocale. Sterilizzare semi di piante di Arabidopsis esprimenti case12 con una soluzione di candeggina al 10% contenente 0,01% Triton. Seminare i semi sterili su un piatto contenente sali di resistenza pieno MS, 1% di saccarosio, e 1.2% agar. Inserire piastre verticalmente in una camera di crescita dopo stratificazione a 4 ° C per 2 giorni. </li><li> Chambers Setup Imaging <ol><li> Montare una camera di imaging utilizzando un vetrino e coprioggetto (Sezione A). Posizionare un pezzo di cotone idrofilo imbevuto di acqua sul centro della diapositiva. Poi il trasferimento di uno o due piantine cinque giorni dalla piastra sulla parte superiore di acqua imbevuto cotone. Stick piccoli pezzi di argilla per ogni angolo di un coprioggetto, und coprioggetto posto sulla cima di piantine per creare un gap (camera) tra il vetrino e il vetrino (Figura 3A, pannello di sinistra). Collegare un&#39;estremità del tubo di polietilene (diametro 0,58 millimetri) per una siringa da 1 ml e posizionare l&#39;altra estremità del tubo immediatamente adiacente alla camera. Tenere il tubo in posizione con nastro adesivo (Figura 3A, pannello di destra). </li><li> Montare una camera di imaging utilizzando una camera di plexiglass (Sezione B). <ol><li> Stendere un sottile strato di grasso al silicone attorno a due tubi in polietilene (diametro 0,58 millimetri) e premere i tubi rivestiti nei canali su ogni lato della camera di plexiglass (Figura 3B sinistra del pannello). Stendere un velo di grasso al silicone sulla superficie della camera che contiene le scanalature del tubo e premere un coprioggetto nel grasso per sigillare un lato della camera di apertura (tagliate). </li><li> Trasferire una cinque giorni di età piantina dal piatto nella camera e mettere un batuffolo di cotone imbevuto di acqua sulla parte superiore of la piantina. Spalmare grasso al silicone sulla altra superficie della camera, e premere un altro coprioggetto sulla parte superiore per sigillare. Collegare l&#39;estremità di uno dei tubi di una siringa da 1 ml. Lasciare l&#39;estremità dell&#39;altro tubo aperto (Figura 3B pannello di destra). </li></ol></li><li> Preparare una camera di imaging con una copertura in vetro a camera (Sezione C). Sterilizzare il vetro di copertura camerata con il 70% di etanolo e lasciare sul cofano fino a secco. Aggiungere 0,6 ml o 0,2 ml di MS media resistenza completa contenente 1% di saccarosio e 0,5% phytagel in ciascun pozzetto di una camera 2-bene o una camera da 8 pozzetti (Figura 3C pannello di destra), rispettivamente. Sterilizzare i semi e seminare i semi direttamente in un vetro di copertura camerata contenente un sottile strato di gel trasparente e farli crescere in verticale per 5 giorni (Figura 3C). </li></ol></li><li> Acquisire le immagini utilizzando un microscopio confocale. Per applicare stimoli di stress, come il sale, il freddo o il perossido, iniettare lentamente circa 200 ml di 150 mM NaCl, ice-cold acqua o 1 mM soluzione H 2 O 2 nella camera (Sezione A o B) appena prima di acquisire immagini, o aggiungere lentamente 500 ml o 100 ml di soluzione di stimolo al pozzo di una camera a 2 o 8 pozzetti, rispettivamente, . Catturare immagini subito dopo l&#39;applicazione della soluzione stimolo utilizzando un microscopio confocale a scansione laser Nikon A1R invertita con un obiettivo 20X immersione in acqua (apertura numerica 0,75). Raccogliere una serie temporale di immagini ad intervalli di 4 sec con eccitazione e di emissione lunghezze d&#39;onda di 488 nm e 500-550 nm, rispettivamente, e ad una risoluzione in pixel di 512 x 512. </li><li> Image Analysis Utilizzando Nikon Elementi, ROI, compilati intorno a ciascuna cella (o area) di interesse. Intensità totale all&#39;interno di ogni ROI è stata misurata nel tempo utilizzando la finestra di dialogo Tempo di misura (ImageJ può essere usato al posto). Misure totali intensità sono stati esportati ed elaborati in Datagraph. Ca 2 + ampiezza picco è stata definita come l&#39;intensità di picco meno di riposo intensità, durata come the di tempo tra l&#39;inizio e il completamento di un picco, e il periodo come l&#39;intervallo di tempo tra i picchi picco adiacenti di due punte. t-test è stato utilizzato per confrontare i mezzi. </li></ol>

<ol><li>Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signals%3A+the+lead+currency+of+plant+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signals: the lead currency of plant information processing.</a> Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).</li>
<li>Pan, Z., Zhao, Y., Zheng, Y., Liu, J., Jiang, X., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+screening+Arabidopsis+mutants+with+disordered+abiotic+stress-induced+calcium+signal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Genet.+Genomics%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for screening Arabidopsis mutants with disordered abiotic stress-induced calcium signal.</a> J. Genet. Genomics. 39 (5), 225-235 (2012).</li>
<li>Ranf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defense-related+calcium+signaling+mutants+uncovered+via+a+quantitative+high-throughput+screen+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana.</a> Mol. Plant. 5 (1), 115-130 (2012).</li>
<li>Zhu, X., Feng, Y., Liang, G., Liu, N., Zhu, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aequorin-based+luminescence+imaging+reveals+stimulus-+and+tissue-specific+Ca2%2B+dynamics+in+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants.</a> Mol. Plant. 6 (2), 444-455 (2013).</li>
<li>Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+plant+aequorin+reports+the+effects+of+touch+and+cold-shock+and+elicitors+on+cytoplasmic+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium.</a> Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).</li>
<li>Van der Luit, A. H., Olivari, C., Haley, A., Knight, M. R., Trewavas, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+calcium+signalling+pathways+regulate+calmodulin+gene+expression+in+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Distinct calcium signalling pathways regulate calmodulin gene expression in tobacco.</a> Plant Physiol. 121 (3), 705-714 (1999).</li>
<li>Johnson, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+oscillations+of+cytosolic+and+chloroplastic+free+calcium+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants.</a> Science. 269 (5232), 489-503 (1995).</li>
<li>Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+calcium+signaling+in+Arabidopsis+involves+two+cellular+pools+and+a+change+in+calcium+signature+after+acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signature after acclimation.</a> Plant Cell. 8 (3), 489-503 (1996).</li>
<li>Logan, D. C., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+cytosolic+calcium+dynamics+are+differentially+regulated+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and cytosolic calcium dynamics are differentially regulated in plants.</a> Plant Physiol. 133 (1), 21-24 (2003).</li>
<li>Mehlmer, N., Parvin, N., Hurst, C. H., Knight, M. R., Teige, M., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolset+of+aequorin+expression+vectors+for+in+planta+studies+of+subcellular+calcium+concentrations+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63 (4), 1751-1761 (2012).</li>
<li>Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+calcium+responses+to+drought%2C+salt+and+cold+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root.</a> Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Souslova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+fluorescent+protein-based+Ca2%2B+sensors+with+increased+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range.</a> BMC. Biotechnol. 7, 37-46 (2007).</li>
<li>Tanaka, K., Swanson, S., Gilroy, S., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nucleotides+elicit+cytosolic+free+calcium+oscillations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular nucleotides elicit cytosolic free calcium oscillations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154 (2), 705-719 (2010).</li>
<li>Iwano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine-tuning+of+the+cytoplasmic+Ca2%2B+concentration+is+essential+for+pollen+tube+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fine-tuning of the cytoplasmic Ca2+ concentration is essential for pollen tube growth.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1322-1334 (2009).</li>
<li>Sieberer, B., Chabaud, M., Timmers, A., Monin, A., Fournier, J., Barker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nuclear-targeted+Cameleon+demonstrates+intranuclear+Ca2%2B+spiking+in+Medicago+truncatula+root+hairs+in+response+to+rhizobial+nodulation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A nuclear-targeted Cameleon demonstrates intranuclear Ca2+ spiking in Medicago truncatula root hairs in response to rhizobial nodulation factors.</a> Plant Physiol. 151 (3), 1197-1206 (2009).</li>
<li>Loro, G., Drago, I., Pozzan, T., Lo Schiavo, F., Zottini, M., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Cameleons+to+different+subcellular+compartments+reveals+a+strict+cytoplasmic%2Fmitochondrial+Ca2%2B+handling+relationship+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Targeting of Cameleons to different subcellular compartments reveals a strict cytoplasmic/mitochondrial Ca2+ handling relationship in plant cells.</a> Plant J. 71 (1), 1-13 (2012).</li>
<li>Krebs, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+genetically+encoded+sensors+allow+high-resolution+live+cell+imaging+of+Ca2%2B+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics.</a> Plant J. 69 (1), 181-192 (2012).</li>
<li>Bonza, M. C., Loro, G., Behera, S., Wong, A., Kudla, J., Costa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+Ca2%2B+accumulation+and+dynamics+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Arabidopsis+root+cells+using+a+genetically+encoded+Cameleon+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Analyses of Ca2+ accumulation and dynamics in the endoplasmic reticulum of Arabidopsis root cells using a genetically encoded Cameleon sensor.</a> Plant Physiol. 163 (3), 1230-1241 (2013).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+in+plant+peroxisomes%3A+An+in+vivo+analysis+uncovers+a+Ca2%2B+dependent+scavenging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">H2O2 in plant peroxisomes: An in vivo analysis uncovers a Ca2+ dependent scavenging system.</a> Plant J. 62 (5), 760-772 (2010).</li>
<li>Zhu, X., Caplan, J., Mamillapalli, P., Czymmek, K., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+in+innate+immunity-mediated+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Function of endoplasmic reticulum calcium ATPase in innate immunity-mediated programmed cell death.</a> EMBO J. 29 (5), 1007-1018 (2010).</li>
<li>Roszik, J., Lisboa, D., Szöllosi, J., Vereb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intensity-based+ratiometric+FRET+in+image+cytometry--approaches+and+a+software+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intensity-based ratiometric FRET in image cytometry--approaches and a software solution.</a> Cytometry A. 75 (9), 761-767 (2009).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J. Physiol. 578 (Pt 1), 55-67 (2007).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo dimostrato un sistema FAS per la registrazione del spazio-temporale Ca 2 + risposta di piantine di Arabidopsis. Questo 2+ sistema di registrazione FAS Ca offre un approccio semplice, sensibile e robusto che può essere adattato per misurare Ca 2 + dinamiche innescate da vari stimoli, oltre agli stimoli di stress abiotici che vengono presentati qui. Utilizzando questo sistema, siamo in grado di confrontare facilmente tessutale o stimoli specifici spazio-temporali Ca 2 + ...

La cellula vegetale risponde all&#39;ambiente via di segnalazione che coordina le azioni delle cellule. Una cella all&#39;inizio di segnalazione evento in risposta a stimoli ambientali è un transitorio aumento di Ca 2 +. Il modello, o la firma di un aumento transitorio della concentrazione di Ca 2 + libero si caratterizza per la sua ampiezza, frequenza e durata. Firme Ca 2 + spazio-temporali distinti regolano diverse attività cellulari 1. Stimoli specifici, come il caldo, il freddo, il sale, la siccità, la luce, o ormoni vegetali, possono ottimizzare l&#39;attività spazio-temporale della membrana localizzata Ca 2 + canali e / o trasportatori, con conseguente specifici Ca 2 + firme. Sebbene Ca 2 + trasportatori sono stati ben caratterizzati, poco si sa circa l&#39;identità molecolare e le funzioni dei canali del Ca 2 + nelle piante 1. Schermi genetici per mutanti con alterata Ca 2 + risposta allo stress stimoli possono essere un efficace approach per identificare i componenti che compongono Ca 2 + firme. Sistemi di rilevamento Ca 2 + Recentemente fonda diversi aequorina sono stati sviluppati che facilitano schermi genetici per Ca 2 + componenti di segnalamento in risposta agli attacchi patogeni e stress abiotici 2-4. Aequorina è stato utilizzato prima per rilevare Ca 2 + segnali nelle piante nei primi anni 1990 5. Da allora, equorina è stata mirata ai vari compartimenti cellulari, come il citoplasma 5, nucleo 6, 7 cloroplasti, tonoplasto 8, 9 mitocondri, stroma e 10, nonché di differenti tipi cellulari nella radice di monitorare cella specifica Ca 2 + segnali 11. Ca 2 + base aequorina misurazioni rivelano l&#39;spaziale e temporale Ca 2 + risposta di una popolazione di cellule allo stress stimoli. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, il Ca 2 + risposte di cellule singole sono unsynchronized nel tessuto risposta 4. Pertanto, la registrazione aequorina Ca 2 + non necessariamente riporta il segnale Ca 2 + in celle singole. Negli ultimi anni, proteina fluorescente geneticamente codificato (FP) a base di Ca 2 + indicatori, come cameleon giallo (YCS) 12 e CASEs12 13 sono stati utilizzati per studiare Ca 2 + di segnalazione ad alta risoluzione subcellulare. YCS sono fluorescenza trasferimento di energia di risonanza (FRET) a base di Ca 2 + indicatori, contenente PCP e YFP varianti aggiunto dal Ca 2 + -binding proteina calmodulina e-calmodulina legame peptide M13. Calmodulina subisce un cambiamento conformazionale in quanto si lega al Ca 2 +, quindi porta la PCP e YFP più vicini, con conseguente aumento del trasferimento di energia (maggiore FRET). Il livello di FRET nel corso del tempo, calcolato approssimativamente come il rapporto tra YFP per intensità di segnale della PCP, riflette intracellulare Ca 2 + dinamica. Diverse versioni YC sono stati utilizzati negli impianti. YC3.6 era targeted al citosol 14,15, 16 nucleo, mitocondri 17, e la membrana plasmatica 18, e YC4.6 e D4ER sono stati mirati al pronto soccorso 15,19, e D3cpv è stato destinato ai perossisomi 20. Le piante transgeniche esprimenti YCS consentono al live-cell imaging di Ca 2 + dinamiche all&#39;interno di diversi compartimenti cellulari di diversi tipi di cellule. Casi (presumibilmente Ca lcium se nsor) sono singole proteine ​​circolarmente permutati fluorescenti (cpFPs) ospitano una calmodulina e-calmodulina legame peptide M13. Al legame con Ca 2 +, casi subiscono cambiamenti conformazionali, portando ad un aumento di intensità di fluorescenza. La correlazione tra la risposta di fluorescenza del CASE e Ca 2 + permette la concentrazione intracellulare di Ca 2 + dinamiche da misurare quantitativamente. La variante Case12 è 12 volte maggiore fluorescenza nelle Ca 2 + forme -saturated. N. piante benthiminana transitoriamente expressing Case12 o piante di Arabidopsis che esprimono stabilmente involucro 12 sono stati utilizzati per studiare Ca 2 + Segnalazione di difesa e lo stress abiotici 4,21. Asincrono Ca spaziale e temporale 2+ oscillazioni nelle cellule rispondono agli attacchi patogeni, o per lo stress disidratazione sono stati rivelati con base Case12 Ca 2 + imaging. Qui, vi presentiamo le istruzioni dettagliate per aequorina basato luminescenza imaging tessuto- e stimoli specifici Ca 2 + dinamiche di piantine di Arabidopsis, e per l&#39;imaging confocale di citosolico e nucleare Ca 2 + dinamiche nelle cellule della radice di Arabidopsis che esprimono, causa 12 Luminescence imaging FAS potrebbe essere adattato per l&#39;analisi di stress-indotta Ca 2 + dinamiche in impianti o tessuti qui non descritti intatti, o per lo screening popolazioni di piante di Arabidopsis mutagenizzate per mutanti con alterata dello stress indotto Ca 2 + segnali. La configurazione Imaging Ca 2 + cellule vive potrebbe essere adattato per analizzare Ca2+ dinamiche all&#39;interno diversi scomparti subcelluar o in diversi tipi di cellule utilizzando altri indicatori di Ca 2 +.

<table><tbody><tr><td>Piastra di Petri quadrata 10 cm x 10 cm</td><td>VWR</td><td>60872-310</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola adesiva</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polietilene</td><td>PerkinElmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>VWR</td><td>53548-000</td><td></td></tr><tr><td>Grasso siliconico</td><td>Beckman</td><td>335148</td><td></td></tr><tr><td>vetro di copertura a 2 pozzetti&nbsp;</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155379</td><td></td></tr><tr><td>vetro di copertura a 8 pozzetti</td><td>Nalge Nunc international</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging a luminescenza</td><td>Princeton Instruments</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale invertito a scansione laser</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Nikon A1R&nbsp;</td></tr><tr><td>Software di imaging</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>N/A</td><td>Elementi Nikon&nbsp;</td></tr><tr><td>DataGraph</td><td>Visual Data Tools Inc</td><td>N/A</td><td>DataGraph 3.1.1 è la versione più recente</td></tr><tr><td>Coelenterazine</td><td>NanoLight Technolgies</td><td>#301B NF-BCTZ-FB</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina per tutti gli usi</td><td>Qualsiasi negozio locale</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151500</td><td></td></tr><tr><td>MS sale</td><td>Phytotechnology Labs</td><td>M524-50L</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>VWR</td><td>BDH8029-12KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma</td><td>P8169-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione spaziale e temporale ca 2 + segnali in arabidopsis piante

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Spunti di sviluppo e ambientali inducono Ca 2 + fluttuazioni di cellule vegetali. Specifica-Stimolo spazio-temporali Ca 2 + modelli vengono rilevati da Ca 2 + legame proteine ​​cellulari che avviano Ca cascate di segnalazione 2 +. Tuttavia, sappiamo ancora poco su come i segnali di stimolo specifico Ca 2 + sono generati. La specificità di un segnale Ca 2 + può essere attribuito al sofisticato regolamentazione delle attività di Ca 2 + canali e / o trasportatori in risposta ad un dato stimolo. Per identificare questi componenti cellulari e capire le loro funzioni, è fondamentale utilizzare sistemi che permettono una registrazione sensibile e robusto di segnali Ca2 + sia a livello tissutale e cellulare. Geneticamente codificati Ca 2 + indicatori che sono indirizzate ai vari compartimenti cellulari hanno fornito una piattaforma per cellule in vivo confocale di cellulari Ca 2 + segnali. Qui si descrive l&#39;istruziones per l&#39;utilizzo di due sistemi di rilevamento Ca 2 +: aequorina basa FAS (film piantine adesivi) luminescenza Ca 2 + di imaging e case12 a base di cellule dal vivo confocale Ca 2 + imaging. Di imaging luminescenza utilizzando il sistema FAS fornisce un rilevamento semplice, robusta e sensibile spaziali e temporali Ca 2 + segnali a livello dei tessuti, mentre cellule vive di imaging confocale utilizzando Case12 fornisce rilevamento simultaneo di citosoliche e nucleari Ca 2 + segnali ad alta risoluzione.

Mannitolo, NaCl e H 2 O 2 sono stati utilizzati come proxy per gli stimoli disidratazione, il sale e lo stress ossidativo, rispettivamente. Per controllare se lo ione metallo pesante Cu 2 + sinergia con qualsiasi di questi tre stimoli di stress, abbiamo confrontato il Ca 2 + risposta ad ogni stimolo in presenza o assenza di Cu 2 +. Come mostrato in Figura 2, FAS di imaging luminescenza rivelato che piantine Arabidoposis risposto diversamente a disid...

Segnalazione Ca 2 + regola diversi processi biologici nelle piante. Qui vi presentiamo approcci per il monitoraggio di stress abiotico indotto Ca spaziale e temporale 2+ segnali nelle cellule e tessuti utilizzando le geneticamente codificati Ca 2 + indicatori aequorina o Case12 Arabidopsis.

Misurazione spaziale e temporale Ca 2 + Segnali in Arabidopsis Piante

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare un metodo per monitorare i segnali del calcio sia a livello cellulare che a livello dell'intera pianta. Ciò si ottiene coltivando prima le piantine sulla piastra di agar MS o direttamente all'interno della camera di imaging. Il secondo passo consiste nel trasferire le piantine su una pellicola adesiva o nel conservarle nella camera di imaging.Successivamente gli stimoli applicati alle piantine per indurre segnali di calcio. In definitiva, la luminescenza dello stile di vita o l'imaging a fluorescenza vengono utilizzati per mostrare rispettivamente la risposta dell'intera piantina o del calcio nucleare citosolico a diversi stimoli. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la singola pianta che si verifica, ad esempio, è che il saggio delle piantine adesive con pellicola è semplice, sensibile e robusto.Pertanto, questa tecnica può essere adattata allo screening ad alto rendimento per mutanti con risposte alterate al segnale del calcio. Inoltre, rispetto all'imaging del calcio su base piatta, l'utilizzo di un indicatore di calcio geneticamente codificato basato su GFP evita complicate impostazioni e calcoli microscopici. Questo metodo fornisce informazioni sulla segnalazione del calcio durante la risposta allo stress in Arabidopsis, ma può essere utilizzato anche in altri contesti, come durante lo sviluppo o la difesa in altri modelli vegetali.Dimostrare questo metodo sarà brillante. Uno studente del nostro laboratorio Per iniziare questa procedura sterilizzare i semi di un coniglio opsis piante che esprimono un quain con una soluzione di candeggina al 10% contenente lo 0,01% di Triton 100, seminare i semi su una piastra quadrata contenente MS a piena forza 1% saccarosio e 1,2% agar. Quindi, posizionare le piastre verticalmente in una camera di crescita dopo una stratificazione di quattro gradi Celsius per due giorni.Successivamente, trasferisci le piantine su un film. Metti una pellicola adesiva sopra le piantine di sette-10 giorni che crescono sul piatto. Spingere delicatamente la pellicola a mano per assicurarsi che le piantine aderiscano alla pellicola.Quindi sbucciare delicatamente la pellicola in modo che le piantine rimangano aderenti alla pellicola. Successivamente, incubare le piantine con il cofattore posizionando le piantine aderenti A su una piastra quadrata contenente 15 millilitri di due microgrammi per millilitro di HCTZ in acqua. Incubare le piantine a temperatura ambiente per quattro ore o durante la notte.Per prepararsi all'imaging a luminescenza, estrarre la pellicola dalla soluzione HCTZ e tagliarla al centro per formare due pezzi. Posizionare i due pezzi di pellicola con le piantine rivolte verso l'alto in due piatti diversi. Quindi lasciare le lastre al buio per cinque minuti per acquisire immagini di luminescenza al buio.Posizionare due piastre una accanto all'altra sul tavolino del sistema di imaging a luminescenza. Acquisire le immagini immediatamente dopo aver aggiunto contemporaneamente 20 millilitri di soluzione di stimoli alle lastre. Per analizzare le immagini di luminescenza, scegliere lo stesso intervallo di visualizzazione per tutte le immagini di luminescenza, ritagliare il ROI e generare le immagini come file jpeg.In alternativa, esportare le immagini come file in formato SPE e importarle nel software di analisi delle immagini Image J. Impostare le misure per il calcolo del valore medio di grigio della ROI, selezionare la stessa dimensione dell'area della ROI. Quindi misura il valore medio del grigio e presenta i dati come grafici a barre.Per preparare le piantine per l'imaging confocale. Sterilizzare i semi delle piante di opsi che esprimono il caso 12 con una soluzione di candeggina al 10% contenente lo 0,01% di Tritone. Quindi i semi sterili su una piastra contenente sali MS a piena potenza, 1% di saccarosio e 1,2% di agar.Quindi posizionare le piastre verticalmente in una camera di crescita dopo la stratificazione a quattro gradi Celsius per due giorni. Nel frattempo, assemblare una camera di imaging con un vetrino e un vetrino coprioggetto. Metti un pezzo di cotone idrofilo imbevuto d'acqua sulla parte superiore dello scivolo.Quindi trasferisci una o due piantine di cinque giorni dalla piastra al centro del vetrino. Quindi attacca piccoli pezzi di argilla a ciascun angolo del vetrino coprioggetti e posiziona il vetrino coprioggetti sopra le piantine per creare uno spazio tra il vetrino coprioggetti e il vetrino. Successivamente, collegare un'estremità del tubo di polietilene a una siringa da un millilitro e posizionare l'altra estremità del tubo immediatamente adiacente alla camera.Tenere il tubo in posizione con del nastro adesivo per assemblare una camera di imaging con una camera di plexiglass. Stendere un sottile strato di grasso siliconico attorno a due tubi di polietilene e premere i tubi rivestiti nei canali su ciascun lato della camera in plexiglass. Quindi stendere un sottile strato di grasso siliconico sulla superficie della camera che contiene le scanalature del tubo e posizionare un vetrino coprinte sul grasso per sigillare un lato dell'apertura della camera.Quindi, trasferisci una piantina di cinque giorni dal piatto nella camera e posiziona un pezzo di cotone idrofilo imbevuto d'acqua sopra la piantina. Stendere il grasso siliconico sull'altra superficie della camera e premere un altro vetrino coprinte sulla parte superiore per sigillare. Successivamente, collegare l'estremità di uno dei tubi a una siringa da un millilitro e lasciare aperta l'estremità dell'altro tubo.Per preparare una camera di imaging con un vetro di copertura a camera, sterilizzare prima il vetro di copertura a camera con etanolo al 70% e lasciarlo nella cappa fino a quando non si asciuga a 0,6 millilitri o 0,2 millilitri di MS a piena potenza. Terreno contenente l'1% di saccarosio e lo 0,5% di gel combattente in ciascun pozzetto di una camera a due pozzetti o di una camera a otto pozzetti, rispettivamente. Quindi sterilizzare i semi e seminarli direttamente su un vetro di copertura a camera contenente un sottile strato di gel trasparente e lasciarli crescere verticalmente per cinque giorni. Per l'acquisizione di immagini.L'uso di un microscopio confocale applica gli stimoli dello stress iniettando lentamente 200 microlitri di cloruro di sodio da 150 millimolari, acqua ghiacciata o una soluzione millimolare di perossido di idrogeno nella camera appena prima di acquisire le immagini. Cattura le immagini subito dopo aver applicato la soluzione di stimolo. Utilizzando un microscopio a scansione laser confocale invertito con una lente a immersione in acqua 20x.Raccogli una serie temporale di immagini a intervalli di quattro secondi con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 4, 88 nanometri e da 500 a 550 nanometri e una risoluzione AIX di cinque 12 per cinque 12 o analisi delle immagini utilizzando elementi Nikon. Le ROI vengono disegnate attorno a ciascuna cella di interesse. L'intensità totale all'interno di ciascun ROI viene misurata nel tempo utilizzando la finestra di dialogo di misurazione del tempo.Quindi le misurazioni dell'intensità totale vengono esportate ed elaborate nel grafico dei dati mostrato. Ecco il confronto della risposta temporale spaziale del calcio delle piantine a 10 giorni. I diversi stimoli di stress qui sono le serie temporali della luminescenza, le immagini di piantine sottoposte a 400 millimolari di mannitolo e 400 millimolari di ole più un millimolare di cloruro di rame, 75 millimolari di cloruro di sodio e 75 millimolari di cloruro di sodio più un millimolare di cloruro di rame e un millimolare di perossido di idrogeno o un millimolare di perossido di idrogeno più un millimolare di cloruro di rame.I pannelli superiore e inferiore sono le immagini a luminescenza acquisite rispettivamente durante i primi 40 secondi e i secondi 40 secondi. Ed ecco il grafico a barre dell'intensità media di luminescenza delle piantine in risposta agli stimoli di stress indicati qui mostrati come l'oscillazione citosolica e nucleare del calcio. In risposta allo stress salino, le immagini confocali mostrano che il caso 12 è espresso nel citoplasma e nei nuclei delle cellule radicali e nelle cellule fogliari delle piante transgeniche che esprimono il caso 12.È emersa questa immagine, immagine del rosso, dell'autofluorescenza dei cloroplasti e della fluorescenza verde del caso 12. Questi due grafici mostrano l'oscillazione del calcio indotta dallo stress salino nel citosol, un nucleo delle cellule radicali. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare piantine ben cresciute.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come monitorare le dynas sia a livello cellulare che a livello dell'intera pianta.

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