Name: Strategie per linseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Scopri come rilevare e tracciare l'anastasi, il processo di inversione dell'apoptosi nelle cellule mammifero, utilizzando microscopia a cellule vive e biosensori. Questo metodo permette di osservare il recupero cellulare.

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Ringraziamo Rev. Dr. Ralph Bohlmann e Rev. Dr. James Voelz per suggerire la parola &quot;Anastasis&quot; per descrivere l&#39;inversione di apoptosi; Douglas R. verde per le cellule HeLa esprimono stabilmente citocromo c-GFP; Charles M. Rudin e Eric E. Gardner per H446 cellule; Heather Lamb per l&#39;assistenza in disegno a fumetti al video; Yee Hui Yeo per preziosa la discussione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), la borsa di studio Dr. Walter Szeto Memorial (HLT), borsa di studio Fulbright 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation Fellowship (HLT), NIH concede NS037402 (JMH) e NS083373 (JMH), e del Comitato Grants Università di Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang è un Shurl e Kay Curci Foundation Fellow della Research Foundation Life Sciences.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Anastasis si riferisce al fenomeno in cui le cellule che hanno attivato cellule morte percorso successivamente invertire il processo di morte e sopravvivere. Qui, abbiamo dimostrato che l&#39;imaging cellulare dal vivo può essere utilizzata per confermare che le stesse cellule singole, infatti, possono invertire apoptotica processo di morte cellulare in una fase avanzata, e poi continuare a sopravvivere e riprodursi. I nostri protocolli descrivono diversi cellulari ottimizzati condizioni trattamento specifico tipo di in...

Apoptosis (greco per &quot;cadere a morte&quot;) è generalmente accettato di essere un processo a senso unico che termina nella cella suicidio 1-7. L&#39;alterazione del gene pro-morte geni risultati nella sopravvivenza delle cellule in più che altrimenti morirebbero in animali interi, comprese le cellule che hanno già avviato il 8,9 apoptosi percorso. Allo stesso modo, le manipolazioni genetiche consentono alle cellule di mammifero sane che artificialmente DISPLAY &quot;eat me&quot; segnali o che perdono adesività per la loro matrice extracellulare per sfuggire alla morte per fagocitosi delle cellule tutto o entosis, rispettivamente, 10,11. Tuttavia, noi ed altri hanno dimostrato che senza manipolazione genetica normali cellule di mammifero sane e linee cellulari possono anche recuperare dalle prime fasi di apoptosi 12-15. Utilizzo di strumenti per monitorare le singole cellule, abbiamo ulteriormente dimostrato il recupero da stadio avanzato di apoptosi 12,13, dopo che le cellule sono passati importanti posti di blocco che tipicoly segnare il &quot;punto di non ritorno&quot; 2-6. Questi punti di controllo di fase apoptosi tardiva includono rilascio mitocondriale di citocromo c, attivazione delle caspasi, frammentazione nucleare, e la formazione di corpi apoptotici. Abbiamo adottato una parola composta greco &quot;Anastasis&quot;, che significa &quot;in aumento per la vita&quot;, per descrivere questa inversione di apoptosi sull&#39;orlo della morte cellulare 2-6. A meno che l&#39;intero processo di morte-recupero è osservato da imaging cellulare dal vivo, che è difficile da distinguere le cellule che hanno subito anastasis da cellule che non hanno riportato eventi apoptotici. Decenni di lavoro hanno rivelato che le caratteristiche morfologiche del suicidio cellulare per apoptosi sono guidati da eventi biochimici e molecolari evolutivamente conservati 16-19. Questi eventi promuovono autodistruzione delle cellule di regolare i processi di sviluppo e omeostatici di organismi unicellulari e pluricellulari eliminando danneggiato o dcellule angerous 16-19. Mentre le cellule apoptosi possono essere facilmente distinguono per manifestazioni morfologiche, biochimiche e molecolari standardizzate di apoptosi 1,5,6,16,20, attualmente non esiste un marcatore nota specifica per Anastasis 12,13. È importante sottolineare che, le cellule che hanno subito anastasis sembrano essere normali cellule sane e cellule che appena iniziano invertendo apoptosi apparire cellule morenti come apoptotici 12,13. Pertanto, sono necessari nuovi strumenti per concludere con certezza che una data cellula superstite aveva precedentemente sperimentato processi apoptotici attivi. L&#39;apoptosi è generalmente assunto come una cascata irreversibile perché è un processo di distruzione rapida e massiccia. Mentre potrebbe richiedere alcuni minuti a giorni per alcune cellule di avviare apoptosi, una volta che i mitocondri hanno rilasciato fattori citotossici, come il citocromo c nel citosol 21,22, caspasi possono essere attivate entro 5 minuti 23,24, seguito da citoplasmatica econdensazione nucleare entro 10 minuti 25-27, e la morte cellulare poco dopo 25-27. Caspasi attivate orchestrano apoptosi con l&#39;adesione e inattivando componenti strutturali e funzionali chiave al fine di demolizione cellulari 2,28, come l&#39;inibitore endonucleasi DFF45 / ICAD 29,30. Caspases attivano anche i fattori pro-apoptotici, come BID membro BCL-2 famiglia, che trasloca mitocondri per promuovere il rilascio mitocondriale di citocromo c 31,32. Attività di caspasi traduce anche nella cella di esposizione della superficie della fosfatidilserina come un segnale &quot;eat me&quot; per promuovere fagocitazione di morire cellule da parte dei macrofagi o cellule vicine attraverso fagocitosi 33. Inoltre, gli eventi apoptotici rendono mitocondri disfunzionali, che perturbano bioenergetica cellulari e metabolismo 34,35,36. Così, il recupero da tale distruzione sembra intuitivamente improbabile. Contrariamente all&#39;originale aspettarsizioni, le cellule possono invertire il processo di morte cellulare per apoptosi anche in una fase avanzata. Monitorando costantemente il destino di morire le cellule in coltura, abbiamo osservato la reversibilità della fase apoptosi in ritardo in un intervallo di celle primarie e linee cellulari 12,13. La rimozione dello stimolo morte ha permesso il recupero dalle caratteristiche evidenti di apoptosi, come la frammentazione mitocondriale, la condensazione della cromatina, il danno al DNA, membrana plasmatica blebbing, l&#39;esposizione della superficie delle cellule della fosfatidilserina, rilascio di mitocondriale citocromo c, attivazione delle caspasi, la frammentazione nucleare, restringimento delle cellule, e la formazione di corpi apoptotici. Queste osservazioni sollevano domande senza risposta per quanto riguarda le funzioni, conseguenze, e meccanismi di Anastasis. Per rispondere a queste domande, un prerequisito è quello di identificare in modo affidabile le cellule che hanno subito Anastasis. Qui, descriviamo i metodi di microscopia dal vivo e un biosensore caspasi per rilevare le cellule che hanno già invertito apoptosi fase tardiva e then sopravvissuto.

<table><tbody><tr><td>Microscopia confocale LSM780</td><td>Carl Zeiss Piatto di</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coltura con fondo in vetro</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>CultFoi</td><td>trasparente Carl Zeiss</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo indipendente CO2</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Rosso CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Annessina V marcata fluorescente</td><td>Biovision</td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

strategie per l&#39;inseguimento anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che inverte apoptosis

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (greco per &quot;l&#39;aumento per la vita&quot;) si riferisce al recupero delle cellule morenti. Prima di queste cellule recuperare, hanno attraversato importanti posti di blocco di apoptosi, tra cui la frammentazione mitocondriale, il rilascio di mitocondriale citocromo c nel citosol, attivazione delle caspasi, condensazione della cromatina, il danno al DNA, la frammentazione nucleare, membrana plasmatica blebbing, restringimento delle cellule, l&#39;esposizione della superficie cellulare di fosfatidilserina, e la formazione di corpi apoptotici. Anastasis può verificarsi quando stimoli apoptotici vengono rimossi prima della morte, consentendo in tal modo le cellule che muoiono per invertire l&#39;apoptosi e potenzialmente di altri meccanismi di morte. Pertanto, Anastasis sembra coinvolgere i processi di guarigione fisiologici che potrebbe anche sostenere le cellule danneggiate in modo inappropriato. Le funzioni ei meccanismi di Anastasis non sono ancora chiare, ostacolato in parte dagli strumenti limitati per rilevare eventi passati dopo il recupero di cellule apparentemente sani. Strategie per l&#39;individuazione Anastasis consentirà studi dei meccanismi fisiologici, i rischi di cellule non-morti in patologia della malattia, e potenziali terapie per modulare Anastasis. Qui, descriviamo strategie efficaci utilizzando la microscopia cellulare dal vivo e un biosensore caspasi mammiferi per l&#39;identificazione e il monitoraggio Anastasis in cellule di mammifero.

Per studiare l'inversione di apoptosi, le cellule di coltura di tessuti vengono prima esposti ad uno stimolo morte per innescare l'apoptosi. Quando le cellule mostrano caratteristiche di apoptosi, terreno di coltura fresco viene poi applicato per lavare via stimolo e poi incubare le cellule morenti per consentire il recupero (Figura 1A). Qui, la questione chiave affrontata è fino a che punto le singole cellule in coltura morenti possono progredire verso l'apoptosi e ancora subire Anastasis. Questa doman...

Il termine anastasi si riferisce al fenomeno in cui le cellule morenti invertono un processo di suicidio cellulare in una fase avanzata, si riparano e infine sopravvivono. Qui dimostriamo i protocolli per rilevare e tracciare le cellule sottoposte ad anastasi.

Strategie per l&#39;inseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare e tracciare l'inversione del processo di morte cellulare apoptotica e delle cellule in coltura mediante microscopia cellulare viva. Le cellule sane si diffondono sul substrato e contengono mitocondri filamentosi tubulari attorno al nucleo. Tuttavia, quando le cellule si suicidano attraverso l'apoptosi, le cellule morenti mostrano caratteristiche morfologiche uniche per rilevare e tracciare l'inversione dell'apoptosi.Le cellule vengono piastrate in piastre di coltura cellulare con fondo di vetro. Il passo successivo consiste nell'eseguire la colorazione delle cellule vive per marcare i mitocondri e i nuclei. Ciò consente di rilevare le caratteristiche morfologiche delle cellule sane e apoptotiche.Mediante microscopia su cellule vive, le cellule sane marcate vengono quindi esposte a uno stimolo di morte per indurre l'apoptosi. Quando viene rilevata l'apoptosi, le cellule morenti vengono lavate e quindi incubate con terreno di coltura cellulare fresco per consentire il recupero cellulare, l'imaging di cellule vive viene utilizzato per rilevare e monitorare l'inversione dell'apoptosi e le sue conseguenze come la riparazione cellulare e la sopravvivenza, come dimostrato rispettivamente dal recupero morfologico e dalla migrazione cellulare. L'apoptosi è un tipo di morte cellulare programmata che svolge un ruolo essenziale nell'eliminare le cellule indesiderate o pericolose nel nostro corpo.Si presume generalmente che questi processi di sintesi cellulare siano irreversibili perché una volta che è iniziato la cellula muore sicuramente dopo, tuttavia, abbiamo scoperto che in realtà, la cellula morente può invertire l'inizio del processo di morte cellulare e quindi sopravvivere e derivare pari. Hanno possibili passaggi critici che sono stati costretti ad essere il punto di basso ritorno, come il cito C, il rilascio, l'attivazione basata sul caso, la frammentazione nucleare e la formazione di corpi apoptotici. Dopo aver consultato esperti greci, adottiamo un termine, una stasi, che significa risorgere alla vita.Per descrivere il fenomeno dell'inversione dell'apoptosi e di altri processi di morte cellulare, l'antesi è difficile da rilevare perché le cellule che invertono l'apoptosi assomigliano a normali cellule pesanti. Tuttavia, mediante microscopia continua su cellule vive, possiamo rilevare che l'anastasi si verifica in un'ampia porzione di cellule. Padroneggiare questa tecnica è importante perché ci permette di studiare la ricreazione dell'antesi.Abbiamo proposto che quell'antesi potrebbe guarire il danno al tessuto, ma potrebbe anche consentire alle cellule danneggiate di sopravvivere e formare tumori. Pertanto, l'identificazione dei meccanismi che controllano le anestesie potrebbe fornirci nuovi approcci per il trattamento di malattie iniettabili come il cancro, l'insufficienza cardiaca e la degenerazione mediando la morte cellulare e la sopravvivenza Per rilevare e monitorare l'anastasi. Dopo gli eventi apoptotici, viene eseguita la microscopia su cellule vive time-lapse per tracciare quali cellule possono invertire l'apoptosi dopo l'induzione della morte cellulare transitoria.Per iniziare, aggiungere un millilitro di soluzione di polide luccina a una piastra di coltura cellulare da 35 millimetri con un fondo di vetro più sottile. Dopo un'incubazione di un minuto per rivestire la superficie del vetro, aspirare la soluzione e lavare il vetro con due millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato Per preparare le cellule prima gli occhi della tripsina, le cellule del tallone all'80-90% di confluenza Dopo che le cellule si sono staccate, aggiungere 10 millilitri di terreno a 37 gradi Celsius per sospendere le cellule. Quindi trasferire la soluzione di sospensione cellulare in una provetta sterile da 10 millilitri per centrifugare a 160 volte G per uno o due minuti.Dopo la centrifuga, aspirare con cura il substrato. Non disturbare il pellet della cella sul fondo del tubo. Procedere alla risospensione delle cellule con 10 millilitri di terreno di coltura cellulare mediante pipettaggio delicato.Quindi vedere due millilitri di celle sospese su vetro preverniciato da 35 millimetri. Piastre per colture cellulari inferiori. Incubare le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per un giorno.Potrebbe essere necessario regolare il numero di cellule in modo che le cellule possano raggiungere l'80% di fluenza di CO al momento dell'imaging. La frammentazione mitocondriale e nucleare sono i segni morfologici distintivi dell'apoptosi. Per visualizzare i mitocondri e i nuclei, eseguire la colorazione poco prima dell'imaging delle cellule vive.Inizia il protocollo di colorazione aggiungendo prima due microlitri di colorazione mitocondriale. MIT tracker rosso 50 micromolare soluzione madre e due microlitri di colorante di DNA agganciato 3 3 3 4 2 10 milligrammi per millilitro di soluzione madre in una provetta sterile per microcentrifuga, aggiungere un millilitro del terreno di coltura condizionato dal piatto di coltura cellulare alla provetta per microcentrifuga e mescolare bene con i coloranti mediante pipettaggio. Quindi aggiungere nuovamente il composto al piatto di coltura.Dopo aver incubato la capsula a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 20 minuti, aspirare il terreno e lavare le cellule colorate tre volte con un millilitro di coltura cellulare calda, terreno o soluzione salina tamponata con fosfato. Quindi incubare le cellule con terreno di coltura cellulare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per altri cinque minuti. Evitare un tempo di colorazione prolungato poiché il segnale di fondo non specifico delle cellule di colorazione potrebbe aumentare a causa di una colorazione eccessiva.Dopo l'incubazione, aspirare il terreno, lavare nuovamente le cellule e quindi continuare a incubare le cellule con due millilitri di terreno di coltura cellulare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. I componenti del microscopio devono raggiungere l'equilibrio termico per evitare la deriva della messa a fuoco e lo spostamento del piano XY dovuti all'espansione e alla contrazione termica dei componenti. Per garantire il raggiungimento dell'equilibrio termico, accendere la camera di controllo ambientale e l'incubatore del tavolino per preriscaldare il microscopio a 37 gradi Celsius almeno due ore prima dell'inizio dell'imaging.Quindi accendere il regolatore di anidride carbonica per fornire il 5% di anidride carbonica alla camera di controllo ambientale. Quando l'apporto di anidride carbonica non è disponibile, è possibile utilizzare un terreno indipendente dall'anidride carbonica per sostenere la crescita cellulare. Prima dell'imaging, posizionare una goccia di olio da immersione direttamente su un obiettivo 40x con un'apertura numerica di 1,4.Quindi posizionare delicatamente il piatto di coltura con le cellule colorate sull'incubatore a 37 gradi Celsius. Coprire il piatto con un foglio freddo trasparente per evitare la perdita di acqua dovuta all'evaporazione e alla contaminazione del campione per eseguire la microscopia a contrasto di interferenza differenziale. Non utilizzare il coperchio del piatto di coltura in plastica poiché la plastica può disturbare la polarità della luce.Successivamente, individua e concentrati su un gruppo di cellule sane che si diffondono sulla superficie del vetro con mitocondri tubulari e nuclei rotondi. Scegliere le cellule al centro o vicino al centro del piatto di coltura per assicurarsi che le cellule siano sullo stesso piano focale una volta posizionate, eseguire una rapida esposizione mediante microscopia confocale per determinare l'intensità laser minima e il tempo di esposizione per ottenere immagini chiare delle cellule e dei loro organelli. Questo passaggio è fondamentale.Poiché la luce laser è fototossica per le celle, sono necessarie l'ottimizzazione e la regolazione Per eliminare la deriva della messa a fuoco, utilizzare un dispositivo di compensazione automatica continua della deriva della messa a fuoco che utilizza un diodo a emissione di luce infrarossa. In alternativa, il piano di messa a fuoco può essere corretto manualmente. Una volta identificate le cellule e il piano focale, ottimizzare tutti i parametri e scattare un'immagine di prova prima di iniziare l'imaging delle cellule vive.Quindi avviare l'imaging dal vivo per visualizzare le cellule sane con intervalli di un minuto per 10 cicli per indurre l'apoptosi. Rimuovere il terreno cellulare con una pipetta trasparente. Applicare sul piatto uno stimolo di morte cellulare premiscelato con un terreno di coltura cellulare a 37 gradi Celsius.Continuate a coprire il piatto con un foglio di alluminio trasparente. Durante l'imaging time-lapse dopo l'applicazione dello stimolo di morte cellulare, regolare l'intervallo di tempo per visualizzare le cellule trattate per rilevare l'apoptosi catturando i segni morfologici distintivi dell'apoptosi come il blobbing della membrana plasmatica, la frammentazione mitocondriale, la condensazione e la frammentazione nucleare, la condensazione citoplasmatica, il restringimento cellulare e la formazione di corpi apoptotici. Quando si osserva apoptosi, rimuovere il terreno con lo stimolo di morte cellulare e applicare due millilitri di terreno di coltura cellulare fresco per incubare le cellule.Continuare l'imaging time-lapse per osservare il recupero morfologico delle cellule e le conseguenze dell'anastasi. Dopo la rimozione di uno stimolo di morte cellulare che fa morire il cancro del polmone umano, le cellule H 4 46 possono invertire l'apoptosi. Sebbene le cellule mostrino segni distintivi di apoptosi come il restringimento cellulare, il blabbing della membrana, la frammentazione mitocondriale, la condensazione nucleare e la frammentazione e l'apoptosia, la formazione del corpo dopo l'anastasi della divisione cellulare può essere anormale.In questo esempio, invece di due nuclei punteggiati, dopo la divisione cellulare si formano tre nuclei principali con formazione di micronuclei che indicano alterazioni genetiche nelle cellule dottere. Ciò suggerisce che l'anastasi potrebbe essere mutagena dopo l'esposizione di una cellula a uno stimolo di morte cellulare. I fattori pro apoptotici traslocano nei mitocondri per innescare il rilascio del citocromo C, che porta all'assemblaggio di un protosoma e all'attivazione basata sul cast per la demolizione cellulare e quindi la morte cellulare.Qui ci sono cellule HELOC che esprimono citocromo C marcato con GFP, che si localizza nei mitocondri dopo l'induzione dell'apoptosi. Il citocromo C viene rilasciato nel citosol. Tuttavia, dopo che le cellule sono state lavate e poi incubate con citosol di terreno fresco, l'ex citocromo C si riduce ai livelli normali, indicando che l'anastasi può verificarsi dopo il rilascio del citocromo C.Qui sono mostrate le cellule hela che esprimono il biosensore CA N-E-S-D-E-V-D-Y-F-P-N-L-S, che si localizza per la prima volta nel citosol dopo l'induzione dell'apoptosi, come previsto. Y-F-P-N-L-S trasloca nel nucleo a causa della scissione di DEVD da parte di basi fuse attivate. Tuttavia, dopo che lo stimolo di morte è stato lavato via e le cellule sono state incubate con terreno fresco, Y-F-P-N-L-S rimane nel nucleo mentre le cellule riacquistano la normale morfologia, indicando che la ptosi VA inversa può verificarsi dopo l'attivazione della base fusa.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare l'imaging di cellule vive per rilevare l'antesi e le sue conseguenze. In questa dimostrazione, utilizziamo l'etanolo come induttore ATO. Allo stesso tempo, la cellula può invertire il processo di morte cellulare indotto da altri stimoli di morte come il teso DMSO e la sporina La luce fluorescente è fototoica per le cellule, quindi è fondamentale ridurre al minimo le notti che riscaldano un campione durante l'imaging delle cellule vive.Il processo di apoptosi e anastasi notturna dipende dalle attività sensibili alla temperatura e dalle attività semotiche. Pertanto, è importante mantenere le celle alla stessa temperatura per l'esperimento per garantire risultati ripetibili.

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