Name: Strategie per linseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Scopri come rilevare e tracciare l'anastasi, il processo di inversione dell'apoptosi nelle cellule mammifero, utilizzando microscopia a cellule vive e biosensori. Questo metodo permette di osservare il recupero cellulare.

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Ringraziamo Rev. Dr. Ralph Bohlmann e Rev. Dr. James Voelz per suggerire la parola &quot;Anastasis&quot; per descrivere l&#39;inversione di apoptosi; Douglas R. verde per le cellule HeLa esprimono stabilmente citocromo c-GFP; Charles M. Rudin e Eric E. Gardner per H446 cellule; Heather Lamb per l&#39;assistenza in disegno a fumetti al video; Yee Hui Yeo per preziosa la discussione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), la borsa di studio Dr. Walter Szeto Memorial (HLT), borsa di studio Fulbright 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation Fellowship (HLT), NIH concede NS037402 (JMH) e NS083373 (JMH), e del Comitato Grants Università di Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang è un Shurl e Kay Curci Foundation Fellow della Research Foundation Life Sciences.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Anastasis si riferisce al fenomeno in cui le cellule che hanno attivato cellule morte percorso successivamente invertire il processo di morte e sopravvivere. Qui, abbiamo dimostrato che l&#39;imaging cellulare dal vivo può essere utilizzata per confermare che le stesse cellule singole, infatti, possono invertire apoptotica processo di morte cellulare in una fase avanzata, e poi continuare a sopravvivere e riprodursi. I nostri protocolli descrivono diversi cellulari ottimizzati condizioni trattamento specifico tipo di in...

Apoptosis (greco per &quot;cadere a morte&quot;) è generalmente accettato di essere un processo a senso unico che termina nella cella suicidio 1-7. L&#39;alterazione del gene pro-morte geni risultati nella sopravvivenza delle cellule in più che altrimenti morirebbero in animali interi, comprese le cellule che hanno già avviato il 8,9 apoptosi percorso. Allo stesso modo, le manipolazioni genetiche consentono alle cellule di mammifero sane che artificialmente DISPLAY &quot;eat me&quot; segnali o che perdono adesività per la loro matrice extracellulare per sfuggire alla morte per fagocitosi delle cellule tutto o entosis, rispettivamente, 10,11. Tuttavia, noi ed altri hanno dimostrato che senza manipolazione genetica normali cellule di mammifero sane e linee cellulari possono anche recuperare dalle prime fasi di apoptosi 12-15. Utilizzo di strumenti per monitorare le singole cellule, abbiamo ulteriormente dimostrato il recupero da stadio avanzato di apoptosi 12,13, dopo che le cellule sono passati importanti posti di blocco che tipicoly segnare il &quot;punto di non ritorno&quot; 2-6. Questi punti di controllo di fase apoptosi tardiva includono rilascio mitocondriale di citocromo c, attivazione delle caspasi, frammentazione nucleare, e la formazione di corpi apoptotici. Abbiamo adottato una parola composta greco &quot;Anastasis&quot;, che significa &quot;in aumento per la vita&quot;, per descrivere questa inversione di apoptosi sull&#39;orlo della morte cellulare 2-6. A meno che l&#39;intero processo di morte-recupero è osservato da imaging cellulare dal vivo, che è difficile da distinguere le cellule che hanno subito anastasis da cellule che non hanno riportato eventi apoptotici. Decenni di lavoro hanno rivelato che le caratteristiche morfologiche del suicidio cellulare per apoptosi sono guidati da eventi biochimici e molecolari evolutivamente conservati 16-19. Questi eventi promuovono autodistruzione delle cellule di regolare i processi di sviluppo e omeostatici di organismi unicellulari e pluricellulari eliminando danneggiato o dcellule angerous 16-19. Mentre le cellule apoptosi possono essere facilmente distinguono per manifestazioni morfologiche, biochimiche e molecolari standardizzate di apoptosi 1,5,6,16,20, attualmente non esiste un marcatore nota specifica per Anastasis 12,13. È importante sottolineare che, le cellule che hanno subito anastasis sembrano essere normali cellule sane e cellule che appena iniziano invertendo apoptosi apparire cellule morenti come apoptotici 12,13. Pertanto, sono necessari nuovi strumenti per concludere con certezza che una data cellula superstite aveva precedentemente sperimentato processi apoptotici attivi. L&#39;apoptosi è generalmente assunto come una cascata irreversibile perché è un processo di distruzione rapida e massiccia. Mentre potrebbe richiedere alcuni minuti a giorni per alcune cellule di avviare apoptosi, una volta che i mitocondri hanno rilasciato fattori citotossici, come il citocromo c nel citosol 21,22, caspasi possono essere attivate entro 5 minuti 23,24, seguito da citoplasmatica econdensazione nucleare entro 10 minuti 25-27, e la morte cellulare poco dopo 25-27. Caspasi attivate orchestrano apoptosi con l&#39;adesione e inattivando componenti strutturali e funzionali chiave al fine di demolizione cellulari 2,28, come l&#39;inibitore endonucleasi DFF45 / ICAD 29,30. Caspases attivano anche i fattori pro-apoptotici, come BID membro BCL-2 famiglia, che trasloca mitocondri per promuovere il rilascio mitocondriale di citocromo c 31,32. Attività di caspasi traduce anche nella cella di esposizione della superficie della fosfatidilserina come un segnale &quot;eat me&quot; per promuovere fagocitazione di morire cellule da parte dei macrofagi o cellule vicine attraverso fagocitosi 33. Inoltre, gli eventi apoptotici rendono mitocondri disfunzionali, che perturbano bioenergetica cellulari e metabolismo 34,35,36. Così, il recupero da tale distruzione sembra intuitivamente improbabile. Contrariamente all&#39;originale aspettarsizioni, le cellule possono invertire il processo di morte cellulare per apoptosi anche in una fase avanzata. Monitorando costantemente il destino di morire le cellule in coltura, abbiamo osservato la reversibilità della fase apoptosi in ritardo in un intervallo di celle primarie e linee cellulari 12,13. La rimozione dello stimolo morte ha permesso il recupero dalle caratteristiche evidenti di apoptosi, come la frammentazione mitocondriale, la condensazione della cromatina, il danno al DNA, membrana plasmatica blebbing, l&#39;esposizione della superficie delle cellule della fosfatidilserina, rilascio di mitocondriale citocromo c, attivazione delle caspasi, la frammentazione nucleare, restringimento delle cellule, e la formazione di corpi apoptotici. Queste osservazioni sollevano domande senza risposta per quanto riguarda le funzioni, conseguenze, e meccanismi di Anastasis. Per rispondere a queste domande, un prerequisito è quello di identificare in modo affidabile le cellule che hanno subito Anastasis. Qui, descriviamo i metodi di microscopia dal vivo e un biosensore caspasi per rilevare le cellule che hanno già invertito apoptosi fase tardiva e then sopravvissuto.

<table><tbody><tr><td>Microscopia confocale LSM780</td><td>Carl Zeiss Piatto di</td><td></td><td></td></tr><tr><td>coltura con fondo in vetro</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>CultFoi</td><td>trasparente Carl Zeiss</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo indipendente CO2</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Rosso CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Annessina V marcata fluorescente</td><td>Biovision</td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

strategie per l&#39;inseguimento anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che inverte apoptosis

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (greco per &quot;l&#39;aumento per la vita&quot;) si riferisce al recupero delle cellule morenti. Prima di queste cellule recuperare, hanno attraversato importanti posti di blocco di apoptosi, tra cui la frammentazione mitocondriale, il rilascio di mitocondriale citocromo c nel citosol, attivazione delle caspasi, condensazione della cromatina, il danno al DNA, la frammentazione nucleare, membrana plasmatica blebbing, restringimento delle cellule, l&#39;esposizione della superficie cellulare di fosfatidilserina, e la formazione di corpi apoptotici. Anastasis può verificarsi quando stimoli apoptotici vengono rimossi prima della morte, consentendo in tal modo le cellule che muoiono per invertire l&#39;apoptosi e potenzialmente di altri meccanismi di morte. Pertanto, Anastasis sembra coinvolgere i processi di guarigione fisiologici che potrebbe anche sostenere le cellule danneggiate in modo inappropriato. Le funzioni ei meccanismi di Anastasis non sono ancora chiare, ostacolato in parte dagli strumenti limitati per rilevare eventi passati dopo il recupero di cellule apparentemente sani. Strategie per l&#39;individuazione Anastasis consentirà studi dei meccanismi fisiologici, i rischi di cellule non-morti in patologia della malattia, e potenziali terapie per modulare Anastasis. Qui, descriviamo strategie efficaci utilizzando la microscopia cellulare dal vivo e un biosensore caspasi mammiferi per l&#39;identificazione e il monitoraggio Anastasis in cellule di mammifero.

Per studiare l'inversione di apoptosi, le cellule di coltura di tessuti vengono prima esposti ad uno stimolo morte per innescare l'apoptosi. Quando le cellule mostrano caratteristiche di apoptosi, terreno di coltura fresco viene poi applicato per lavare via stimolo e poi incubare le cellule morenti per consentire il recupero (Figura 1A). Qui, la questione chiave affrontata è fino a che punto le singole cellule in coltura morenti possono progredire verso l'apoptosi e ancora subire Anastasis. Questa doman...

Il termine anastasi si riferisce al fenomeno in cui le cellule morenti invertono un processo di suicidio cellulare in una fase avanzata, si riparano e infine sopravvivono. Qui dimostriamo i protocolli per rilevare e tracciare le cellule sottoposte ad anastasi.

Strategie per l&#39;inseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare e tracciare l'inversione del processo di morte cellulare apoptotica e delle cellule in coltura mediante microscopia cellulare viva. Le cellule sane si diffondono sul substrato e contengono mitocondri filamentosi tubulari attorno al nucleo. Tuttavia, quando le cellule si suicidano attraverso l'apoptosi, le cellule morenti mostrano caratteristiche morfologiche uniche per rilevare e tracciare l'inversione dell'apoptosi.Le cellule vengono piastrate in piastre di coltura cellulare con fondo di vetro. Il passo successivo consiste nell'eseguire la colorazione delle cellule vive per marcare i mitocondri e i nuclei. Ciò consente di rilevare le caratteristiche morfologiche delle cellule sane e apoptotiche.Mediante microscopia su cellule vive, le cellule sane marcate vengono quindi esposte a uno stimolo di morte per indurre l'apoptosi. Quando viene rilevata l'apoptosi, le cellule morenti vengono lavate e quindi incubate con terreno di coltura cellulare fresco per consentire il recupero cellulare, l'imaging di cellule vive viene utilizzato per rilevare e monitorare l'inversione dell'apoptosi e le sue conseguenze come la riparazione

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Vi presentiamo un protocollo semplice per visualizzare le regioni di morte cellulare programmata (PCD) in embrioni di topo e di differenziazione staminali embrionali (ES) colture cellulari utilizzando un colorante chiamato LysoTracker altamente solubile.

L&#39;uso di LysoTracker per rilevare la morte cellulare programmata in embrioni e differenziazione delle cellule staminali embrionali

Contributo del fattore ACF rimodellamento della cromatina per E4orf4 morte cellulare indotta è stata misurata. Il protocollo include la selezione di cloni di cellule in cui il trattamento doxiciclina induce knockdown condizionale della subunità ACF ACF1 e SNF2h, e l'uso del test per misurare DAPI E4orf4 morte cellulare indotta in linee cellulari inducibili.

Preparazione di linee cellulari per Knockdown condizionale dell&#39;espressione genica e valutazione degli effetti sulla Knockdown E4orf4 morte cellulare indotta

Questo protocollo descrive l'uso di bromodeossiuridina (BrdU) uptake per consentire il monitoraggio temporale di cellule che erano in fase S in un determinato momento. L'aggiunta di coloranti DNA e l'etichettatura degli anticorpi facilita l'analisi dettagliata del destino delle cellule in fase S in tempi successivi.

Monitoraggio temporale del ciclo cellulare progressione citometria a flusso, senza la necessità di sincronizzazione

Anastasis è tecnicamente difficile da rilevare in vivo perché le cellule che hanno invertito il processo di morte cellulare possono essere morfologicamente indistinguibili dalle cellule sane normali. Qui descriviamo i protocolli per il rilevamento e il monitoraggio delle cellule che subiscono anastasis animali vivi utilizzando il nostro sistema di biosensore del CaspaseTracker recente sviluppato in vivo .

Rilevazione di Anastasis In Vivo di biosensore CaspaseTracker

Qui, presentiamo un protocollo per la determinazione degli eventi di segnalazione intracellulare indotti in cellule vitali dall'interazione fisica con cellule morte o morenti adiacenti. Il protocollo si concentra sugli eventi di segnalazione indotti dal riconoscimento mediato dal recettore delle cellule morte, in contrapposizione al loro assorbimento fagocitario o al rilascio di mediatori solubili.

Identificazione di segnale intracellulare eventi indotta in cellule vitali per interazione con le cellule vicine sottoposti apoptotica delle cellule morte

Formazione immagine della vivere-cella fornisce una ricchezza di informazioni su singole cellule o di intere popolazioni che è irraggiungibile da cella fissa imaging da solo. Qui, i protocolli di imaging di cellule vive per valutare le decisioni di destino delle cellule dopo il trattamento con il paclitaxel della droga anti-mitotico sono descritti.

A lungo termine Live cell Imaging per valutare il destino delle cellule in risposta a Paclitaxel

Qui, presentiamo un protocollo per isolare cellule di carcinoma mammario apoptotica ordinando di fluorescenza-attivato delle cellule e ulteriormente rilevare la transizione delle cellule staminali non cancro al seno al seno cancro cellule staminali-come le cellule dopo inversione di apoptosi mediante citometria a flusso.

Flusso Cytometric Detection neonata al seno cancro cellule staminali-come delle cellule dopo l'inversione di apoptosi

Il metodo presentato combina l'analisi quantitativa delle interruzioni del DNA a doppio filamento (DSB), la distribuzione del ciclo cellulare e l'apoptosi per consentire la valutazione specifica del ciclo cellulare dell'induzione e della riparazione di DSB, nonché le conseguenze del fallimento della riparazione.

Misurazione specifica del ciclo cellulare di zH2AX e Apoptosis Dopo lo stress genotossico da citometria di flusso

Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale di imaging fluorescente. Il metodo si avvale di una circolare permutated YFP a base di sensori di calcio dual-eccitazione raziometrico (raziometrico pericam-mt) l'indicazione espressa nei mitocondri.

Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Un metodo accurato per la valutazione della morte cellulare è descritto. Il protocollo migliora convenzionale annessina V / propidio ioduro (PI), i protocolli, che mostra fino al 40% di falsi positivi eventi in linee cellulari e cellule primarie da una vasta gamma di modelli animali.

Modificato annessina V / propidio ioduro Apoptosis analisi di valutazione accurata di morte cellulare

Scopri come rilevare e tracciare l'anastasi, il processo di inversione dell'apoptosi nelle cellule mammifero, utilizzando microscopia a cellule vive e biosensori. Questo metodo permette di osservare il recupero cellulare.

Strategie per l'inseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis

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