Un metodo per lo screening e validazione di mutazioni resistenti contro Kinase Inhibitors

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare e convalidare mutazioni resistenti ai farmaci. Ciò si ottiene creando prima una libreria di mutazioni casuali dell'oncogene bersaglio. Il secondo passo consiste nell'eseguire lo screening in vitro per l'emergere di cloni resistenti.

La terza fase della procedura consiste nel sequenziare i cloni resistenti per identificare le mutazioni resistenti. Il passo finale consiste nel convalidare le mutazioni resistenti ricreando le mutazioni utilizzando la mutagenesi sito-diretta, seguita da saggi in vitro e in vivo. In definitiva, mutazioni clinicamente rilevanti resistenti ai farmaci possono essere identificate contro una data coppia di bersagli farmacologici.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i metodi basati su ENU o PCR è che è imparziale e, a differenza della METAGENE sissi basata sulla PCR, questa non è limitata a una dimensione dell'oncogene o al contenuto di GC di qualsiasi gene. In generale, chi è nuovo a questa tecnica avrà difficoltà a causa della mancanza di conoscenze in biologia molecolare e cellulare. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.

Poiché la neogenesi e le fasi di screening sono difficili da imparare. È perché molte persone non hanno esperienza nella produzione virale, nelle colture cellulari e nei terreni semicellulari. Questa procedura inizia con la trasformazione di cellule di e coli rosse XL con un plasmide contenente JAK due V 617 f un'isoforma oncogenica di JAK due cellule di e coli rosse XL e una sono difettose nei meccanismi di riparazione del DNA, consentendo loro di incorporare mutazioni casuali durante la replicazione.

Mescolare da 50 a 100 nanogrammi di DNA plasmidico con 100 microlitri di cellule competenti in una provetta di polipropilene pre-raffreddata. Non utilizzare più di 100 nanogrammi di DNA perché diminuisce l'efficienza di trasformazione. Incubare su ghiaccio per 30 minuti, agitando delicatamente ogni cinque minuti per una buona copertura della libreria.

Utilizzare da quattro a sei provette di cellule competenti. Immergere le provette in polipropilene a bagnomaria a 42 gradi Celsius per uno shock termico di 45 secondi, quindi incubare su ghiaccio per due minuti. Quindi, aggiungere un millilitro di terreno SOC a ciascun tubo.

Incubare le provette a 37 gradi Celsius agitando a 225-250 giri/min per 90 minuti. Piastre su quattro piastre a coclea da 10 centimetri contenenti 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 16-24 ore.

Una volta che le colonie sono visibili, raccoglile raschiando le piastre con un raschietto per piastre sterile. Raggruppa le celle di ogni piastra. Successivamente, il DNA plasmidico viene isolato utilizzando un kit di estrazione plasmidico commerciale e l'eterogeneità delle mutazioni nella libreria viene valutata sequenziando un giorno prima della piastra di trasfezione, da quattro volte 10 al sesto HEK 2 93 cellule T, su piastre da 100 millimetri in DM EM contenenti il 10% di FCS, penicillina, streptomicina e due millimolari di L-glutammina.

Il giorno seguente, preparare i reagenti di trasfezione per ogni piatto da 100 millimetri. Mescolare cinque microgrammi della libreria plasmidica, cinque microgrammi di un plasmide retrovirale e 40 microlitri di gene FU per un volume totale di 400 microlitri utilizzando terreni DM E EM privi di siero. Incubare la miscela di DNA e lipidi per 20 minuti a temperatura ambiente.

Quindi, sostituisci il terreno delle cellule T HEK 2 93 con terreno fresco e aggiungi il complesso lipidico del DNA goccia a goccia sopra le cellule. Incubare a 37 gradi Celsius per sei ore. Dopo sei ore, sostituire il terreno di trasfezione con un terreno nuovo e incubare le piastre per 48 ore a 37 gradi Celsius per produzione di virus.

Dopo 48 ore di incubazione, raccogliere i surnatanti virali filtrati attraverso un filtro a disco acro da 0,45 micrometri per iniziare la procedura di screening e identificazione dei JAK resistenti ai farmaci: due mutanti V 607 F trasducono tre cellule BAF con i surnatanti retrovirali. Miscelare 100 milioni di cellule BAF con 100 millilitri di surnatante virale per un volume totale di 300 millilitri utilizzando terreni RPMI contenenti il 10% di siero e poli cervello. Distribuire questa miscela di cellule e virus supernat in più piastre a sei pozzetti, riempiendo ogni pozzetto con quattro o cinque millilitri.

Centrifugare le piastre a 1,250 GS per 90 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore il giorno successivo, raggruppare le cellule trasdotte per ogni concentrazione di farmaco. Mescolare 10 millilitri di cellule con ruxolitinib in una provetta da 50 millilitri.

Le concentrazioni di ruxolitinib testate in questo esempio sono 1, 5, 2, 0,5 e 10 micromolari. Portare il volume a 40 millilitri utilizzando RPMI contenente il 20% di siero. Aggiungere 10 millilitri di coclea all'1,2% alle cellule e mescolare accuratamente in piastre a sei pozzetti.

Erogazione di quattro millilitri per pozzetto. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per due settimane. Una volta che le colonie resistenti sono visibili, utilizzare puntali per pipette da 0,2 millilitri per raccogliere le colonie e sottocoltivarle singolarmente.

In piastre a 24 pozzetti per tre o quattro giorni, raccogliere le tre celle BAF resistenti mediante centrifugazione a 450 GS per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo aver isolato il DNA genomico utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico commerciale, amplificare i due CDNA JAK a lunghezza intera dal DNA genomico mediante PCR. I prodotti della PCR vengono quindi separati mediante elettroforesi su gel di Agar Rose e la banda di DNA 3,4 KILOBASE.

Rappresentando il telaio JAK a due rivestimenti è isolato utilizzando un kit di estrazione del gel commerciale. Infine, sequenziare l'intero CDNA utilizzando otto primer interni che coprono la sequenza codificante e analizzare le sequenze utilizzando software commerciali per convalidare le mutazioni resistenti ai farmaci. Le varianti selezionate in vitro sono generate mediante mutagenesi sito-specifica della sequenza JAK two V 617 F e reintrodotte in tre cellule BAF.

Aggiungere separatamente 50 microlitri di terreno contenente varie concentrazioni di ruxolitinib ai pozzetti della piastra, la piastra 10 al quarto del BAF, tre JAK, due cellule V 617 F in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 60 ore Per valutare la vitalità cellulare, aggiungere 10 microlitri di WST un reagente a ciascun pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius per due o quattro ore. Registrare l'assorbanza a 450 utilizzando un lettore di piastre. Eseguire tutti i saggi in triplicato e tracciare l'assorbanza media rispetto alle concentrazioni di ruxolitinib.

Esegui una curva sigmoidale di adattamento ottimale utilizzando un punteggio dell'algoritmo di adattamento della curva non lineare. La concentrazione del farmaco che determina il 50% di vitalità cellulare come IC 50 cellulare successivamente convalida in vivo delle mutazioni resistenti viene eseguita come descritto nel protocollo di testo allegato. Poiché i cloni cellulari resistenti generati dalla mutagenesi casuale possono essere portatori di più di una mutazione, queste mutazioni devono essere convalidate in isolamento mediante saggi sia in vitro che in vivo.

Nel test in vitro, le varianti selezionate sono state generate mediante mutagenesi site site della sequenza JAK two V 607 F e reintrodotte in tre cellule BAF, che sono state poi misurate per la capacità di proliferazione cellulare a diversi dosaggi di ruxolitinib per valutare i valori di IC 50. Inoltre, l'immunoblotting per fosfotirosina o fosfofarmaco STAT cinque è stato eseguito su lisati proteici di cellule BF tre che sono state incubate con dosi crescenti di ruxolitinib per escludere qualsiasi resistenza mediata fuori bersaglio. I mutanti che presentano valori di IC 50 aumentati e autofosforilazione persistente a concentrazioni più elevate di ruxolitinib sono quindi confermati varianti resistenti ai farmaci per convalidare la resistenza in vivo.

BF, tre cellule ingegnerizzate per esprimere JAK, due varianti V, sei 17 F e luciferasi ciliegia sono state iniettate nei topi, che sono stati successivamente iniettati con ruxolitinib per due settimane. Dopo due settimane. I topi sono stati sottoposti a imaging per la bioluminescenza catalizzata dalla luciferasi, il chimerismo BAF 3 nel midollo osseo e il flusso sanguigno periferico è stato valutato misurando la fluorescenza delle cellule positive alla ciliegia.

I risultati mostrano che i topi che esprimono JAK due V 607 F sono a ruxolitinib, mentre le varianti resistenti mostrano incrementi progressivi della bioluminescenza durante il periodo di trattamento. Una volta padroneggiata, la neogenesi casuale può essere eseguita in quattro o cinque giorni se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare un plasmide randomizzato, una libreria di DNA per lo screening in vitro contro qualsiasi coppia di bersagli farmacologici.

Non dimenticare che lavorare con i retrovirus può essere estremamente pericoloso. Durante l'esecuzione di questa procedura devono essere sempre prese precauzioni.