Name: In vitro metilazione Assay per studiare proteine Arginina Metilazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Impara l'assaggio di metilazione in vitro per studiare la metilazione dell'arginina proteica utilizzando PRMTs marcate con epitopi. Questo metodo consente di determinare lo stato di metilazione dei substrati tramite SDS-PAGE e autoradiografia.

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Questo studio è stato sostenuto da un Merit Award dalla US Department of Veterans Affairs, e un NIH concedere R01CA138528 a RW.

1 Preparazione di costrutti di espressione <ol><li> Prima di iniziare il protocollo, PRMTs clone in vettori di espressione di mammifero con un epitopo tag N-terminale (Myc o HA), e il substrato in-frame con glutatione-S-transferasi (GST) per l&#39;espressione di proteine ​​di alto livello e la purificazione da cellule batteriche lisati, utilizzando tecniche di biologia molecolare standard. </li></ol> 2 Purificazione di PRMTs <ol><li> Usare piatti 100 mm di coltura per mantenere le cellule umane epiteliali bronchiali (Beas2B). Passage le cellule ogni 3 giorni e non lasciarli crescere a confluenza. </li><li> Il giorno prima della trasfezione, seminare 7.5 x 10 5 cellule in 10 ml di terreno di coltura in un piatto di cultura a 100 mm. Agitare per disperdere uniformemente le cellule, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5%. </li><li> Il giorno successivo, aspirare i media e aggiungere 5 ml di coltura senza siero e antibiotici. Agitare e aspirare il terreno. Ripetere questo passo sipiù tempo, e, infine, aggiungere 5 ml di siero / terreno privo di antibiotici e procedere alla trasfezione. </li><li> Diluire 6 mg di DNA plasmidico in 750 ml di mezzo privo di siero in una sterile da 1,5 ml di tubo di plastica da centrifuga. </li><li> In un altro 1,5 ml tubo da centrifuga di plastica, diluire 30 ml di reagente di trasfezione in 750 ml di mezzo privo di siero. </li><li> Trasferire la soluzione reagente di trasfezione diluito (punto 2.5) alla provetta contenente DNA diluito (punto 2.4). Mescolare delicatamente pipettando su e giù parecchie volte. </li><li> Incubare la miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Dopo 15 minuti, pipettare la miscela di trasfezione delicatamente sulle celle, agitare per mescolare in modo uniforme, e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato CO 2 5%. </li><li> Dopo 3 ore, aspirare il terreno contenente miscele di trasfezione delle cellule. Aggiungere fresco terreno di coltura cellulare integrato con siero e antibiotici. </li><li> Incubare a 37 ° C in un umidificata al 5% di CO 2incubatore per 48 ore. </li><li> Dopo 48 ore, lisare le cellule in 1 ml di tampone di lisi (1x tampone fosfato salino, 1% Nonidet P-40, 0,5% desossicolato di sodio, 0,1% di sodio dodecil solfato, e 1 mg / ml phenlymethyl sulfonil fluoruro). Raccogliere i lisati in un tubo da centrifuga di plastica con un sollevatore cellulare e incubare i lisati in ghiaccio per 30 min. </li><li> Centrifugare i lisati a 15.000 xg per 10 minuti su una centrifuga da banco per cancellare i lisati da detriti cellulari. [* Si consiglia vivamente di confermare l&#39;espressione di HA-PRMT1 tramite immunoblotting di una aliquota dei lisati con anticorpi anti-HA, prima di procedere alla purificazione degli enzimi per l&#39;analisi di metilazione.] </li><li> Per la purificazione di PRMTs, incubare 3 mg di lisati cellulari con 30 ml di sospensione 50:50 di anti-HA matrice di affinità in tampone fosfato salino (PBS), e ruotare notte a 4 ° C in un rotatore tubo. </li><li> Il giorno dopo, girare le provette a 14000 g in una centrifuga da banco per 2 minuti per raccoglierele perline. Eliminare il surnatante e lavare le perline 3x con 1 ml di tampone RIPA [20 mM Tris (pH 8.0), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA e 1% Triton-X-100] in ogni lavaggio seguito da centrifugazione a 14000 g per 2 min. Dopo il terzo lavaggio, lavare le perle di una volta con 100 ml di buffer di metilazione (50 mM Tris pH 8.5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 1 mM β-mercaptoetanolo, saccarosio 100 mm). Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante. Le perle contenenti i PRMTs immobilizzati sono pronti per essere utilizzati nel test di metilazione. [* Si consiglia vivamente di utilizzare i PRMTs immobilizzati immediatamente nel test di metilazione.] </li></ol> 3. Purificazione di substrato <ol><li> Inoculare una singola colonia di GST-G3BP1 trasformato BL21 in 5 ml di Luria-Bertani (LB) medium contenenti 100 mg / ml di ampicillina. Far crescere le culture per una notte a 37 ° C con agitazione a 250 rpm. </li><li> Il giorno dopo, trasferire la cultura durante la notte a 50 ml di terreno LB fresco e continue a crescere ad un OD 600 di 0,5-0,7 (Ci vogliono circa 2 ore). </li><li> Quando il diametro esterno 600 raggiunge 0,5-0,7, aggiungere isopropil-β-D-thiogalactoside (IPTG) ad una concentrazione finale di 1 mM e continuare a cultura per ulteriori 4 ore a 37 ° C con agitazione a 250 rpm. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1500 xg per 10 minuti, ed elaborare il pellet per la purificazione GST o conservare a -80 ° C. </li><li> Risospendere il pellet batterico in 5 ml di tampone di lisi (PBS 1x con inibitori della proteasi, 100 ug / ml di lisozima e 0,1% Triton-X-100) e incubare i lisati a 37 ° C per 30 min. In questo momento i lisati appariranno torbido e viscoso a causa del rilascio di DNA genomico batterico. </li><li> Shear il DNA genomico mediante sonicazione (10 impulsi di 1 secondo ciascuno con un&#39;ampiezza di 30%). </li><li> Cancellare i lisati di centrifugazione a 15.000 xg per 10 minuti e trasferire il surnatante limpido in una provetta da 15 ml. Se il surnatante è chiaro non ripetere l&#39;centrifugogazione processo ancora una volta. </li><li> Nel frattempo, lavare le perle GST-sefarosio due volte con PBS freddo ghiaccio e fare una sospensione di 50:50 GST-sefarosio in PBS. Aggiungere 200 microlitri della sospensione GST-sefarosio al lisato cellulare batterica eliminato e ruotare a 4 ° C per 1 ora. </li><li> Dopo 1 ora, centrifugare le provette a 500 xg per 3 minuti per raccogliere le perline. Lavare le perline 3x con ghiaccio freddo PBS. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, risospendere le sfere in 100 ml di tampone di eluizione (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 30 mM glutatione) e ruotare a 4 ° C per 10 min. </li><li> Centrifugare le provette a 15.000 xg per 2 minuti e trasferire il surnatante contenente la proteina purificata in un&#39;altra provetta da centrifuga di plastica. Effettuare SDS elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) analisi su 5 microlitri della proteina purificata insieme con quantità note di albumina di siero bovino (BSA) per stimare la concentrazione della proteina purificata. </li></ol> 4. Metilazione Assay NOTA: Effettuare operazioni seguenti in una zona separata designata per il lavoro radioisotopo e in conformità con i protocolli delle istituzioni su come eseguire gli esperimenti con isotopi radioattivi. <ol><li> Aggiungere 2 mg di purificato GST-substrato e una master mix contenente tampone metilazione 1x (50 mM Tris pH 8.5, 20 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 1 mM β-mercaptoetanolo, saccarosio 100 mm), 1 μCi di S-adenosyl- L- [metil-3H] metionina e acqua ad un volume finale di 10 pl alle PRMTs immobilizzati (passo 2.13) e incubare la reazione a 30 ° C per 1 ora. </li><li> Dopo 1 ora, fermare la reazione aggiungendo 10 ml di tampone campione 2x SDS. Dopo denaturazione dei campioni a 95 ° C per 10 min, separare i campioni su un gel SDS-PAGE. </li><li> Più tardi, trasferire le proteine ​​separate dal gel SDS su membrana di nitrocellulosa mediante un trasferimento elettroforetico semi-secco. </li><li> Dopo il trasferimento, coprire la membrana con unutofluor (un intensificatore di immagine autoradiografica), e delicatamente roccia per 2 ore a temperatura ambiente. Dopo 2 ore, versare fuori il autofluor e conservare per un uso successivo. [* Etichettare la provetta come materiale radioattivo] </li><li> Aria rapidamente asciugare la membrana su una carta da filtro, sigillarlo in un sacchetto di plastica e di esporre la membrana di una pellicola a raggi X a -20 ° C. Tempo di esposizione sufficiente varia tra 5-30 giorni. </li></ol> 5 Conferma di PRMT espressione e Pari carico di substrato <ol><li> Dopo aver raggiunto le esposizioni sufficienti, trasferire la membrana di una scatola di plastica contenente tampone bloccante [salina tamponata con Tris con Tween-20 (TBST + latte scremato 3%)] e scuoterla delicatamente per 1 ora. </li><li> Scartare il tampone bloccante come rifiuti radioattivi. Incubare la membrana con anticorpi anti-HA (1: 1.000 diluizione) in TBST notte a 4 ° C, con dolce dondolio. </li><li> Lavare la membrana con TBST 3x e incubare la membrana con l&#39;anticorpo secondario HRP-marcato anti-topo(1: 5.000 diluizione) in TBST a temperatura ambiente per 1 ora con dolce dondolio. </li><li> Dopo 1 ora, lavare la membrana con TBST 3x, ed eseguire il rilevamento chemiluminescenza di proteine ​​con un substrato HRP. </li><li> Dopo la rilevazione dei PRMTs HA-tag, incubare la membrana con soluzione colorante Ponseau-S per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare rapidamente le 3x membrana con acqua per rilevare i substrati GST-tagged. Eseguire la scansione dell&#39;immagine. </li></ol>

<ol><li>Paik, W. K., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+methylase+I.+Purification+and+properties+of+the+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme.</a> J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).</li>
<li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).</li>
<li>Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+NG%2C+NG%2C-dimethylarginine+in+nuclear+protein+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).</li>
<li>Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation at a glance.</a> J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).</li>
<li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Mol Cell. 33, 1-13 (2009).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled3+is+a+novel+arginine+methyl+transferase+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate.</a> Scientific reports. 2, 805(2012).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+of+G3BP1+in+response+to+Wnt3a+regulates+%7Bbeta%7D-catenin+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA.</a> J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).</li>
<li>Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a-stimulated+LRP6+phosphorylation+is+dependent+upon+arginine+methylation+of+G3BP2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2.</a> J Cell Sci. , (2012).</li>
<li>Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+arginine+methylation+in+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of arginine methylation in transcription.</a> Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).</li>
<li>Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques in protein methylation.</a> Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).</li>
<li>Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+applied+to+the+study+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods applied to the study of protein arginine methylation.</a> Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).</li>
<li>Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+protein+arginine+methyltransferase+7+%28PRMT7%29+is+a+type+III+enzyme+forming+omega-NG-monomethylated+arginine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues.</a> J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto è abitualmente utilizzato per stabilire lo stato di metilazione dei substrati PRMT identificati. Questo test robusto e coerente fornirà anche prove definitive sulla specificità del PRMTs per i loro substrati. I componenti chiave per il successo di questo test sono: 1 Espressione di PRMTs in cellule di mammifero, 2 attività di PRMTs purificati, 3 Espressione e purificazione di substrato, e 4 completo trasferimento occidentale delle proteine ​​alla membrana di nitrocellulosa. <p class="jove...

Proteine ​​metilazione è stata descritta per la prima nel 1968 1. Fu solo la prima clonazione di PRMT1 nel 1996, che i ricercatori hanno cominciato ad apprezzare l&#39;importanza di questa modificazione post-traslazionale 2. È interessante notare che circa il 2% dei residui di arginina nelle proteine ​​di estratti nucleari sono metilato 3, che indica l&#39;abbondanza di questa modifica. L&#39;arginina è un aminoacido carico positivamente con una catena laterale di base ei azoto / s all&#39;interno delle catene laterali di arginina può essere post-traduzionali modificato mediante l&#39;aggiunta di un gruppo metile, un processo noto come arginina metilazione 4-6. Metilazione Arginina è catalizzata da una classe di enzimi viz., Transferasi proteine ​​metile arginina (PRMTs). Arginine possono sia essere monometilato o dimethylated la quale può essere sia simmetrica o asimmetrica a seconda del tipo di PRMTs catalizzano il processo 4-6. Le proteine ​​che visualizzano argininaricchi di motivi e-glicina sono potenziali bersagli per la catalisi PRMT-mediata. PRMT mediata da metilazione dei substrati è stato dimostrato di modulare l&#39;interazione proteina-proteina, l&#39;interazione proteina-acido nucleico, la funzione della proteina, l&#39;espressione genica, e / o di segnalazione cellulare, che sono tutti critici per la normale omeostasi cellulare 7-9. Al fine di comprendere il ruolo biologico delle proteine ​​arginina metilazione, precisi, efficienti e riproducibili test sono necessari per stabilire lo stato di metilazione dei substrati PRMT identificati. In vitro la metilazione, che valuta le capacità di PRMTs purificati per catalizzare metilazione dei loro substrati, è un saggio ben accettato per lo studio metilazione arginina 10-12. Il successo complessivo di questo test dipende in gran parte l&#39;attività dei PRMTs purificati. PRMTs possono essere espressi e purificati da batteri o cellule di mammifero 10,11. Questa metilazione test in vitro, come dNell&#39;odontoiatria nella sezione del protocollo, si basa su un metodo originariamente descritto da Tini e colleghi 10. In questo protocollo, vi mostriamo nel dettaglio i passaggi necessari per l&#39;espressione e la purificazione di PRMT1 in cellule di mammifero. La capacità del PRMT1 purificato per catalizzare metilazione su Ras-GTPasi attivando la proteina binding protein 1 (G3BP1), un noto substrato PRMT 8, è stato poi valutato in presenza di S-adenosil-L-[metil-3 H] metionina come donatore di metile. Usando questo test, possiamo definire in modo affidabile le capacità dei PRMTs di romanzo metilato o substrati noti, che è un passo fondamentale nello studio della proteina arginina metilazione.

<table><tbody><tr><td>S-adenosil-L-[metil-3H] metionina</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ecoscint ultra&nbsp;</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-270</td><td></td></tr><tr><td>Dispenser per flaconi</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-900</td><td></td></tr><tr><td>AutoFluor</td><td>National Diagnostics</td><td>LS-315</td><td></td></tr><tr><td>Fiale a scintillazione da 6 ml</td> National <td>Diagnostics</td><td>SKU:SVC-06</td><td></td></tr><tr><td>GST-sepharose</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutatione ridotto</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Reagente di trasfezione</td></tr><tr><td>Beas2B</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>US-Biologicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodio desossicolato</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>matrice di affinità anti-HA</td><td>Roche Tris</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nacl Sigma</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-rad gel doc</td><td>Bio Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-HA anticorpo</td><td>roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ponseau S</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro metilazione assay per studiare proteine ​​arginina metilazione

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Proteina arginina metilazione è una delle più abbondanti modificazioni post-traduzionali nel nucleo. Proteine ​​arginina metilazione può essere identificato e / o determinato mediante approcci di proteomica, e / o immunoblotting con anticorpi specifici metil-arginina. Tuttavia, queste tecniche a volte possono essere fuorvianti e spesso fornire risultati falsi positivi. Soprattutto, queste tecniche non possono fornire prove dirette a sostegno della specificità di substrato PRMT. In vitro test di metilazione, d&#39;altra parte, sono saggi biochimici utili, che sono sensibili, e costantemente rivelano se le proteine ​​identificate sono davvero substrati PRMT. Un tipico test di metilazione in vitro comprende purificati, PRMTs attivi, substrato purificato e un radioisotopo marcato donatore di metile (S-adenosil-L-[metil-3 H] metionina). Qui si descrive un protocollo step-by-step per isolare PRMT1 cataliticamente attivo, un membro della famiglia PRMT ubiquitariamente espresso. Il meThyl attività transferasi del PRMT1 purificato sono stati successivamente testati su Ras-GTPasi attivando binding protein 1 (G3BP1) proteina, un substrato PRMT noto, in presenza di S-adenosil-L-[metil-3H] metionina come donatore di metile. Questo protocollo può essere impiegato non solo per stabilire lo stato di metilazione di nuovi substrati PRMT1 fisiologici, ma anche per comprendere il meccanismo di base della proteina arginina metilazione.

<html> Le capacità di HA-PRMT1 a metilato GST-G3BP1 sono stati determinati da un test in vitro metilazione in. PRMT1 HA-tag purificata da lisati cellulari Beas2B è stato impiegato in una reazione di metilazione contenente GST-G3BP1, e 1 μCi di S-adenosil-L-[metil-3 H] metionina, come donatore di metile. PRMT1 potrebbe efficacemente catalizzare la metilazione di GST-G3BP1 (Figura 1, pannello superiore). Reazioni di metilazione mediante pull-down eseguite su lisati di vuoto vet...

Proteine ​​arginina metilazione, catalizzata da una classe di enzimi viz., Proteina arginina metil transferasi (PRMTs), è il processo di aggiunta enzimatica di gruppi metile (s) per arginines all&#39;interno di proteine. Il test in vitro metilazione è lo strumento più affidabile per valutare lo stato di metilazione di substrati PRMT noti o nuovi.

In vitro metilazione Assay per studiare proteine ​​Arginina Metilazione

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

L'obiettivo generale di questa procedura è stabilire lo stato di metilazione della proteina arginina metil transferasi o substrati PRMT. Ciò si ottiene esprimendo prima i PRT marcati con epitopi nelle cellule di mammifero. I P RMT vengono quindi immunoprecipitati dai lisati cellulari utilizzando velocità SRO anti emoagglutinina o anti HA, seguite da un lavaggio esteso per rimuovere le proteine non specificamente legate.Successivamente, le perle lavate vengono incubate con la proteina del substrato purificata dai batteri e dalla lumaca L metionina marcata con trizio, o sam. Infine, la reazione viene interrotta e lo stato di metilazione del substrato viene determinato tramite sodio silsolfato, elettroforesi su gel di poliacrilammide o analisi della pagina SDS seguita da autoradiografia. In definitiva, la capacità dei p RMT di metilare il substrato è determinata confrontando le reazioni di metilazione mediante immunoprecipitazione eseguite sui lisati di vettore vuoto e cellule trasfettate BRMT.Gli approcci proteomici o l'immunoblotting con anticorpi specifici per la metilarginina possono talvolta essere fuorvianti, spesso fornendo risultati postali falsi. Soprattutto, non possono fornire un'evidenza diretta a sostegno della specificità del substrato PRMT. Il vantaggio principale del test di metilazione in vitro che dimostrerò in questo video è che è sensibile e rivela costantemente se le proteine identificate dove PRMT subsubisce Il giorno prima della trasfezione seminano 750.000 cellule epiteliali bronchiali umane in 10 millilitri di terreno di coltura.In una piastra di coltura da 100 millimetri, agitare la piastra per disperdere uniformemente le cellule e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore a CO2 umidificato al 5%. Il giorno successivo, aspirare il terreno e aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura senza siero e antibiotici, agitare e aspirare il terreno. Ripetere questo passaggio ancora una volta e infine aggiungere cinque millilitri di siero privo di antibiotici e procedere alla trasfezione.Per eseguire la trasfezione, diluire prima sei microgrammi di DNA plasmidico PRMT in 750 microlitri di terreno privo di siero in una provetta da centrifuga di plastica sterile da 1,5 millilitri in un'altra provetta da centrifuga di plastica da 1,5 millilitri. Diluire 30 microlitri di reagente di trasfezione in 750 microlitri di terreno privo di siero. Quindi trasferire la soluzione di reagente di trasfezione diluita nella provetta contenente DNA diluito miscelato delicatamente pipettando su e giù più volte.Incubare la miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi, pipettare delicatamente la miscela di trasfezione sulle cellule e agitare per miscelare uniformemente. Dopo un'incubazione di tre ore a 37 gradi Celsius, aspirare il terreno contenente le miscele di trasfezione dalle cellule.Quindi aggiungere un terreno di coltura cellulare fresco integrato con siero e antibiotici. Dopo un'incubazione di 48 ore a 37 gradi Celsius cellule di liceo in un millilitro di tampone di lisi. Raccogli i lisati su una provetta da centrifuga di plastica con un sollevatore di cellule.Quindi incubare i lisati su ghiaccio per 30 minuti. Quindi, centrifugare. I lisati a 15.000 GS per 10 minuti su una centrifuga da banco.Incubare tre milligrammi di lisati cellulari con 30 microlitri di una sospensione da 50 a 50 di matrice di affinità anti HA in soluzione salina tamponata con fosfato. Oppure i PBS ruotano durante la notte a quattro gradi Celsius in un rotatore di tubi.Il giorno successivo, centrifugare le provette a 14.000 GS su una centrifuga da banco per due minuti per raccogliere le perle. Dopo aver scartato lo snat, lavare le perle con un millilitro di tampone RIPA seguito da centrifugazione come prima. Dopo aver lavato le perle tre volte con il tampone RIPA, lavare le perle una volta con 100 microlitri di tampone di metilazione.Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante. Le microsfere contenenti gli RMT p immobilizzati sono pronte per essere utilizzate nel saggio di metilazione. Eseguire il saggio di metilazione in un'area separata designata per il radioisotopo.Lavorare in conformità con i protocolli dell'istituzione per il lavoro con gli isotopi radioattivi. Preparare il substrato purificato di glutatione, s transferasi o GST come descritto nel protocollo di testo. Combinare due microgrammi con una miscela master contenente un tampone di metilazione x e micro curie di tridio marcato lumaca L metionina.Aggiungere la miscela agli RMT immobilizzati e incubare a 30 gradi Celsius per un'ora. Dopo un'ora, interrompere la reazione aggiungendo 10 microlitri di due XSDS. Tampone del campione dopo la denaturazione dei campioni a 95 gradi Celsius per 10 minuti.Separare gli esempi in base alla pagina SDS in un secondo momento. Trasferire le proteine separate dal gel SDS su una membrana di nitrocellulosa utilizzando un trasferimento elettroforetico semi-secco. Dopo il trasferimento, coprire la membrana con un'immagine autoradiografica.Intensificare e agitare delicatamente per due ore a temperatura ambiente Dopo due ore, versare l'intensificatore e conservare per un uso successivo. Asciugare rapidamente la membrana all'aria su una carta da filtro, sigillarla in un sacchetto di plastica ed esporre la membrana a una pellicola a raggi X a meno 20 gradi Celsius. I tempi di esposizione sufficienti variano tra i cinque e i 30 giorni.Dopo aver raggiunto esposizioni sufficienti, trasferire la membrana in una scatola di plastica contenente un tampone di blocco e oscillare delicatamente per un'ora. Smaltire il tampone di blocco come scorie radioattive. Quindi incubare la membrana con l'anticorpo anti HA in T tris, soluzione salina tamponata con tween 20, abbreviato TBST durante la notte a quattro gradi Celsius con un leggero dondolio il giorno successivo.Lavare la membrana con TBST tre volte. Quindi incubare la membrana con anticorpo secondario anti-topo marcato con perossidasi di rafano in TBST a temperatura ambiente per un'ora con un leggero dondolio. Dopo aver lavato la membrana con TBST tre volte, eseguire la rilevazione in chemiluminescenza delle proteine con substrato di perossidasi di rafano dopo la rilevazione di RMT HA tag P.Incubare la membrana con la soluzione colorante poncho S per cinque minuti. A temperatura ambiente, lavare rapidamente la membrana tre volte con acqua prima di scansionare l'immagine. Per rilevare i substrati marcati GST, le capacità del tag HA PMT uno di metilare il tag GST G tre PP uno sono state determinate mediante un saggio di metilazione in vitro.HA TAG prm T uno purificato da cellula B2B. I lisati sono stati impiegati in una reazione di metilazione contenente GSTG tre, BP uno e un micro curry di lumaca L metionina marcata con trizio. Come donatore di metile, p MT si potrebbe catalizzare efficacemente la metilazione di GS TG tre BP one reazioni di metilazione utilizzando pull down eseguiti su lisati di vettore vuoto.Le cellule B2B trasfettate fungevano da controllo negativo. L'immuno blotting con anticorpi anti HA ha confermato l'espressione di p rmt. Una colorazione del poncho è stata quindi utilizzata per dimostrare un carico uguale di GSTG tre BP uno in entrambe le reazioni.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un saggio di metilazione in vitro.

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