Il saggio Formazione morbida Agar Colony

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare la crescita indipendente dall'ancoraggio cellulare. Ciò si ottiene placcando prima uno strato di agar sulla piastra di coltura cellulare e lasciandolo indurire. Il secondo passo consiste nell'impiattare una miscela di cellule in agar sopra lo strato di agar precedente.

Successivamente, le cellule possono formare colonie per un periodo di alcune settimane. Il passaggio finale consiste nella colorazione delle colonie per la visualizzazione e la quantificazione. In definitiva, il saggio di formazione di colonie di agar morbido viene utilizzato per mostrare la crescita indipendente di Anchorage come indicazione della trasformazione cellulare.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come il saggio Clon genico, è che il saggio di formazione di colonie di agar morbido richiede che le cellule formino colonie in modo indipendente da Anchorage. Iniziare la procedura etichettando ogni pozzetto di una coltura tissutale trattata. Piastra a sei pozzetti in modo appropriato per ogni linea cellulare o condizione oggetto di indagine.

Successivamente, preparare due terreni di coltura Xcel sciogliendo un grammo di terreno in polvere e 0,2 grammi di bicarbonato di sodio nell'acqua deionizzata fino a un volume finale di 50 millilitri. Passare questo mezzo attraverso un filtro da 0,2 micron. Aggiungere ulteriori componenti necessari per la normale coltura della linea cellulare di interesse.

Ad esempio, coltivare la linea cellulare CMT 1 67 in terreno RPMI 1640 integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina streptomicina. Riscaldare a una temperatura media di 37 gradi Celsius in bagnomaria prima dell'uso. Ora prepara un terreno di coltura Xcel.

Quindi preparare l'1% di agar nobile aggiungendo un grammo di agar nobile a 100 millilitri di acqua deionizzata. Dopodiché preparare lo 0,6% di agar nobile aggiungendo 0,6 grammi di agar nobile a 100 millilitri di acqua deionizzata. Successivamente autoclavare le miscele di agar nobile.

Successivamente preparare una soluzione madre di cloruro di nitro oleum blu da un milligrammo per millilitro in un XPBS allo scopo di colorare le colonie. In questa procedura, cuocere nel microonde la bottiglia di agar nobile all'1% per circa uno o due minuti mentre si riscalda in un forno a microonde. Monitorare attentamente la soluzione per evitare che trabocchi.

Quindi continuare a riscaldare e mescolare a intermittenza fino a quando l'agar non è completamente sciolto e la soluzione è limpida. Successivamente, posizionare la soluzione di agar sciolta e il terreno di coltura Prewarm two x in un secchiello del ghiaccio riempito a 42 gradi Celsius. Acqua del rubinetto.

Inoltre, posizionare un tubo conico da 50 millilitri in un portatubo nel secchiello del ghiaccio con acqua calda. Quindi, trasferire il secchio nella cappa per colture cellulari. Quindi aggiungere sei millilitri di terreno di coltura e sei millilitri della soluzione di agar nobile all'1% alla provetta conica da 50 millilitri.

Pipettare su e giù più volte per mescolare. Lavorare a ritmo sostenuto eviterà l'indurimento prematuro dell'agar morbido. Successivamente, aspirare circa 5,5 millilitri di miscela con una pipetta sierologica da cinque millilitri.

Lasciare che le bolle d'aria salgano verso la parte superiore della colonna della pipetta. Depositare quindi 1,5 millilitri di miscela in ogni pozzetto ed evitare la deposizione di eventuali bolle d'aria. Coprire la piastra e lasciare solidificare la miscela di agar nella cappa di coltura cellulare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Innanzitutto, raccogliere le cellule mediante tripsina e diluirle da una a cinque in coltura, in un tubo conico da 15 millilitri. Contare le cellule e calcolare il numero di cellule necessarie per pozzetto per preparare una sospensione cellulare finale in questo momento. Successivamente, sciogliere la soluzione di agar allo 0,6% in un forno a microonde.

Mettilo in un secchiello del ghiaccio contenente acqua calda insieme a un tubo conico da 50 millilitri in un supporto per tubi e la sospensione cellulare finale. Quindi trasferire il secchiello del ghiaccio con l'agar sciolto allo 0,6% nella cappa di coltura cellulare per le fasi successive. Per preparare un volume totale di 12 millilitri di sospensione cellulare per una piastra a sei pozzetti, prima pipettare sei millilitri di sospensione cellulare nella provetta conica da 50 millilitri.

Quindi aggiungere sei millilitri di agar allo 0,6% al tubo. Mantenere la miscela a 42 gradi Celsius per evitare l'indurimento prematuro e massimizzare la sopravvivenza delle celle. Successivamente, pipettare rapidamente la miscela, due o tre volte per distribuire le cellule.

Aspirare 5,5 millilitri di miscela con una pipetta sierologica da cinque millilitri e lasciare che le bolle d'aria salgono verso la parte superiore della colonna della pipetta. Quindi depositare 1,5 millilitri di miscela in ciascuno. Lasciare solidificare la miscela di agar cellulare a temperatura ambiente nella cappa di coltura cellulare per 30 minuti prima di metterla in un incubatore per colture cellulari umidificato a 37 gradi Celsius.

Aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura sullo strato superiore di agar due volte a settimana per prevenire l'essiccazione e attendere circa 21 giorni per un'adeguata formazione di colonie. Per colorare le cellule, aggiungere 200 microlitri di soluzione di cloruro di tetra oleum nitro blue a ciascun pozzetto e incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius. Una volta che le colonie sono state colorate, scatta fotografie dei pozzetti utilizzando l'imager e conta le colonie utilizzando il software di analisi delle immagini.

Qui è mostrato il saggio di formazione di colonie di agar morbido di vettori che esprimono CMT 1 67 cellule LPC X e CMT 1 67 LL sono andate sette a nove crespi sopra le cellule esprimenti. Il vettore che esprime le cellule CMT 1 67 L e CXL PC X e CMT 1 67 LL è diventato sette a f crespo. Nove cellule sovraesprimenti sono state piastrate in un test di formazione di colonie di agar morbido CMT 1 67 LL è andato sette cellule crespi nove hanno mostrato una marcata diminuzione della formazione di colonie Dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della ricerca sul cancro per esplorare la trasformazione cellulare in vitro. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare le cellule per la crescita indipendente di Anchorage.