La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di far crescere grandi quantità di cellule di mammifero. Ciò si ottiene calibrando prima il pH e l'ossigeno disciolto o le sonde do, quindi sterilizzando in autoclave le sonde di pH, do e il manicotto della sonda di temperatura. Il secondo passo consiste nell'inserire le sonde e il manicotto nel recipiente e posizionare il recipiente sul bioreattore e collegare lo scarico, il filtro, le linee del gas e la sonda di temperatura.

Il passo successivo consiste nel collegare i cavi DO e pH e nel collegare in modo asettico i supporti del terreno e del micro che vengono pompati nel bioreattore. Il passaggio finale consiste nell'avviare i controller per garantire che il bioreattore raggiunga la velocità, la temperatura e la saturazione di ossigeno desiderate. Infine, dopo l'inoculazione e il monitoraggio computerizzato, la coltura può essere elaborata per l'estrazione e la purificazione del prodotto desiderato.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il bioreattore con serbatoio di agitazione riutilizzabile, è che il bioreattore a ruota d'aria è facile da usare e riduce al minimo le possibilità di contaminazione microbica. Iniziamo. Per iniziare il protocollo, accedi alla schermata hello.

Quindi, ispezionare il sensore di pH e verificare che la punta del sensore sia riempita con una soluzione elettrolitica. Procurarsi un becher con una soluzione a pH quattro, un altro becher con una soluzione a pH sette e un flacone di lavaggio con acqua distillata. Quindi collegare il cavo di pH al sensore di pH.

Passare alla scheda delle azioni nell'interfaccia hello, selezionare calibra. Quindi selezionare la scheda PHA e la calibrazione a due punti. Inserire la temperatura del tampone nel campo della temperatura della soluzione di calibrazione.

Posizionare il sensore nella soluzione pH quattro per la calibrazione Inserire il valore nel campo zero. Una volta che il grafico si è stabilizzato, premere, tarare e sciacquare il sensore di pH con acqua distillata. Ripetere la calibrazione per pH sette e salvare le impostazioni.

Inserire il valore del buffer nel campo span e attendere che l'innesto si stabilizzi. Per iniziare l'ossigeno disciolto o eseguire la calibrazione. Assicurarsi che il sensore di ossigeno disciolto sia stato collegato al sistema per diverse ore e sia stato polarizzato all'interno della scheda di calibrazione, selezionare DOA e calibrazione a due punti.

Scollegare il sensore di OD. Immettere zero nella scheda zero e attendere che il grafico si stabilizzi. Prima di selezionare la calibrazione, ricollegare il sensore do e inserire 100 nel campo span.

Quando il grafico si stabilizza, fare clic su Calibra due. Quindi salva le impostazioni e chiudi il programma. Dopo la calibrazione, posizionare i sensori e il pozzetto termico nelle buste dell'autoclave e sterilizzarli in autoclave per 30 minuti a 121 gradi Celsius e 15 PSI.

Al termine dell'autoclave, disinfettare le buste dell'autoclave con alcol isopropilico al 70% e trasferire le buste in una cabina di sicurezza biologica o BSC. Sanificare e introdurre il recipiente del reagente nel BSC. Rimuovere l'imballaggio interno e ispezionare il recipiente e il tubo per verificare che non siano danneggiati.

Quindi, installare il sensore di OD nella porta anteriore sinistra del recipiente del reagente e il pozzetto termico nella porta posteriore sinistra. Installare il sensore di pH nella porta anteriore destra per l'installazione. Aprire il cappuccio del sensore e infilarlo leggermente nella porta sulla parte superiore del recipiente.

Quindi trasferire il recipiente fuori dalla BSC. Assicurarsi che i cavi dei sensori di pH e OD si trovino all'esterno del manicotto del recipiente e che nulla si trovi all'interno del manicotto. Tenere il recipiente in modo da essere rivolto in avanti e far scorrere prima i piedini del recipiente nel manicotto.

Assicurarsi che il fondo del recipiente sia appoggiato sui riscaldatori. Quindi inserire con cura il sensore di temperatura nella vasca termica. Bene. Quindi, rimuovere i set di tubi dalla borsa.

Abbinare il codice colore sul tubo ai connettori e alle pompe corrispondenti sull'unità di controllo del bioreattore. Instradare le linee di aggiunta e campionamento dei fluidi dietro il sensore di ossigeno disciolto e la termica. Inserire bene il tubo nella pompa con codice colore sul lato sinistro del bioreattore.

Collegare la linea principale e la micro linea del gas. Premere il connettore della linea principale del gas nella sua uscita del gas per installare la linea principale del gas. Quindi ruotare il connettore della micro linea del gas in senso orario nella sua uscita del gas Per installare la micro linea del gas.

Per installare il tubo del forno del filtro, aprire il forno del filtro e fissare il tubo del filtro di scarico all'uan. Assicurarsi che il tubo passi attraverso i due ganci fino al filtro e fuori dal forno. Instradare la linea inferiore attraverso il gancio nella parte inferiore del forno con filtro e chiudere lo sportello.

Quindi collegare i cavi ai sensori di ossigeno disciolto e pH. Al termine dell'installazione, formare un collegamento sterile utilizzando raccordi per esche tra una linea di edizione media inutilizzata e la fonte del sacchetto di bottiglia medio. Vai alla scheda delle azioni nell'interfaccia di Hello.

Fare clic su pompe di controllo, selezionare pompa per fluidi e fare clic sul dispositivo di scorrimento per accendere la pompa per fluidi. Quindi aggiungere da 1,5 a 3,0 litri di supporto e fare clic sul cursore per spegnere la pompa. Il sistema è ora pronto per pompare nel reattore micro carrier precedentemente preparati.

Questi possono essere aggiunti utilizzando una riga di addizione. Fissare la bottiglia MICROCAR alla linea di aggiunta appropriata utilizzando un blocco esca sterile. Accendere la pompa di addizione all'interno della schermata della pompa di controllo.

Dopo l'aggiunta dei micro vettori, spegnere la pompa utilizzando il cursore, tornare alla schermata principale dell'interfaccia hello, selezionare le azioni e quindi le avanzate. Selezionare il controller appropriato per modificare le impostazioni. Impostare i controller su auto e inserire i set point.

Dopo aver impostato i controller, accendere la pompa dell'aria. Guardare all'interno del recipiente del reagente per assicurarsi che la ruota pneumatica stia ruotando. Assicurarsi che il sensore di ossigeno disciolto sia completamente polarizzato e che il valore di ossigeno disciolto si sia stabilizzato.

Quindi calibrare la forma del sensore di do, una connessione sterile tra una linea di aggiunta del mezzo inutilizzata identificata da una banda arancione e la fonte della sacca della bottiglia di celle utilizzando raccordi per esche. Quindi, installare la sezione in silicone del tubo nella pompa del fluido. Assicurarsi che il tubo clamp è aperto e che il tubo ramificato clamp è chiuso.

Passare alla scheda della pompa di controllo, quindi accendere la pompa del fluido. Aggiungere le celle e spegnere la pompa del supporto. Dopo l'inoculazione, accedere alla scheda delle azioni e selezionare Preleva campione.

Assicurarsi che il tubo di campionamento sia nella pompa di campionamento e manipolare il rubinetto di arresto del campionamento secondo le istruzioni sullo schermo. Rimuovere la siringa con il campione per la conta delle cellule e altre applicazioni a valle per eseguire la conta delle cellule. Infine, quando le cellule hanno raggiunto la densità desiderata di 1,2 volte 10 per le sei cellule per millilitro, si aggiunge setticamente l'inoculo virale a una siringa da 20 millilitri.

Collegare la siringa a una porta di aggiunta di riserva sul reattore. Utilizzare lo schermo della pompa di controllo per accendere la pompa di addizione e aggiungere l'inoculo virale. La maggior parte delle celle A 5 49 ha aderito ai micro carrier entro due ore.

Dopo 12 ore, le cellule hanno mostrato segni di appiattimento e diffusione sulla superficie della microcar. Entro 24 ore, i micro portatori hanno mostrato una distribuzione uniforme delle cellule. La colonizzazione delle microcar avviene rapidamente, come dimostrato qui.

La percentuale di colonizzazione di microcar da parte di 54 9 cellule è del 75% entro 24 ore. Questo grafico mostra il numero di cellule vitali in coltura 54 9 in coltura pre e post infezione da adenovirus. Le cellule continuano a crescere in modo esponenziale fino a 1 milione di cellule per millilitro dopo 48 ore.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare e far funzionare un bioreattore a ruota d'aria per far crescere cellule di mammifero ad alta densità per la produzione cellulare o proteica. Grazie per aver guardato e in bocca al lupo per i vostri esperimenti.