Name: La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Impara a coltivare cellule di mammifero utilizzando un bioreattore pneumatico monouso. Questo metodo include la calibrazione dei sensori, l'assemblaggio asettico e il controllo dei parametri di crescita per ottenere alte densità cellulari.

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Questo progetto è stato supportato in parte dalla Johns Hopkins University, Office of the Provost attraverso la Gateway Science Initiative.

1 Accesso <ol><li> Accendere il bioreattore. Fare clic su un punto qualsiasi per aprire la pagina di login. Selezionare il nome utente e inserire la password e clicca su &quot;Accedi&quot;. </li></ol> 2 Calibrazione <ol><li> Calibrare sensore di pH (2 punti prima di autoclave). </li><li> Controllare il sensore di pH e confermare punta del sensore è piena di soluzione elettrolitica. Preparare due bicchieri con soluzioni di calibrazione pH (elettrolito) pH 4 e pH 7 e hanno a disposizione un flacone di lavaggio con acqua distillata. </li><li> Collegare il cavo pH al sensore di pH. Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; sull&#39;interfaccia Ciao e fare clic su &quot;calibrazione&quot;. Inserisci temperatura del tampone nel campo Temp soluzione di calibrazione. </li><li> Inserire sensore pH in tampone 1 (pH 4) e inserire il valore nel campo &quot;zero&quot;. Attendere che il grafico per stabilizzare e il tasto &quot;1 calibrare&quot; fare clic su. Sciacquare il sensore di pH con acqua distillata. </li><li> Sensore nel buffer di 2 (pH 7). Inserisci tampone2 valore nel campo &quot;span&quot;. Attendere grafico per stabilizzare e fare clic su Calibra pulsante 2. </li><li> Fare clic su &quot;Salva&quot;, quindi fare clic su &quot;Chiudi&quot;. </li><li> Calibrare il sensore dell&#39;ossigeno disciolto (DO). </li><li> Assicurarsi che il sensore DO è stato polarizzato essendo collegato al sistema per diverse ore. Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; sull&#39;interfaccia Ciao e fare clic su Calibra. Fare clic sul pulsante &quot;DO A&quot;. </li><li> Scollegare il sensore DO e inserire 0 nel campo &quot;zero&quot;. Attendere che il grafico per stabilizzare e il pulsante &quot;Calibrate 1&quot; fare clic su. </li><li> Ricollegare il sensore DO e immettere 100 nel campo &quot;Span&quot;. Attendere che il grafico per stabilizzare e il pulsante &quot;Calibrate 2&quot; fare clic su. </li><li> Fare clic su &quot;Salva&quot;, quindi fare clic su &quot;Chiudi&quot;. </li></ol> 3. Autoclave ed installare i sensori e navi reagenti <ol><li> Dopo la calibrazione, sensori posto e ben termico in AUTOCsacchetti Lave e autoclave per 30 minuti a 121 ° C, 15 psi. </li><li> Sterilizzare sacchetti autoclave con il 70% alcol isopropilico (IPA) e di trasferimento sacchetti di cappa di sicurezza biologica (BSC). Rimuovere imballaggio esterno della nave. </li><li> Sterilizzare imballaggio interno con il 70% di IPA e trasferire nave cappa di sicurezza biologica (BSC). Rimuovere imballaggio interno e ispezionare la nave e il tubo per i danni inflitti durante il trasporto. </li><li> Installare il pH e DO sensori delle due porte anteriori. Installare il pozzo termico alla porta posteriore sinistra. Aprire il tappo del sensore. </li><li> Guida sensore attraverso la porta del sensore. Infilare il sensore saldamente nella porta. </li><li> Trasferimento nave fuori BSC. </li><li> Appendere la cavi dei sensori di pH DO e fuori il manicotto nave e verificare che nulla è nel manicotto. Far scorrere la nave nella manica, i piedi prima. </li><li> Inserire con cautela il sensore di temperatura nel pozzo termico nave. Assicurarsi che il fondo del recipiente poggia contro i riscaldatori. </li><li> Rimuovereil tubo imposta dalle loro borse. Codice colore Corrispondenza sulla tubazione ai connettori corrispondenti e pompe sulla centralina bioreattore. </li><li> Installare la linea principale del gas premendo il connettore nella sua presa di gas. Installare la linea del gas micro ruotando in senso orario il connettore nella presa del gas. Installare il tubo di scarico del filtro: </li><li> Aprire il forno del filtro. Fissare il filtro di scarico sul canale U per cui il suo tubo passa attraverso i due ganci al filtro e fuori del forno. </li><li> Installare il tubo dal sacchetto condensatore nel supporto tubo. Chiudere la porta. </li><li> Itinerario linee di addizione A e B, entrambe le linee di media, e la linea raccolto dietro il sensore DO e sulla panca accanto alla centralina bioreattore. </li><li> Collegare i cavi ai sensori DO e pH. </li></ol> 4. Aggiunta Medie e Micro-vettori <ol><li> Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; e cliccare su &quot;Controllo Pompe&quot; sull&#39;interfaccia computer. </li><li> Formare una Stericollegamento tra le linea inutilizzato mezzo oltre (1 banda arancione) e il supporto di origine flacone / sacca saldando il tubo o con raccordi Luer. </li><li> Fare clic sul dispositivo di scorrimento per attivare la pompa media su. Fare clic sul dispositivo di scorrimento per attivare il supporto pompa spenta dopo l&#39;aggiunta desiderata quantità di mezzo. </li><li> Mettere microcarrier perline in Ca 2 +, Mg 2 + libero PBS per 3 ore a temperatura ambiente. </li><li> Lavare più volte con perline Ca 2 +, Mg 2 + libero PBS. </li><li> Autoclave per 15 minuti a 115 ° C, 15 psi. NOTA: Aggiungere 3 g / L (peso a secco) in questo esperimento. </li><li> Pompa a micro-vettori che sono stati idratati, lavati e sterilizzati in autoclave nel reattore nello stesso modo è stato aggiunto il mezzo nel passaggio 4.1. </li></ol> 5. equilibrazione e One-punto di calibrazione DO <ol><li> Impostare i controller per Auto e immettere i valori di riferimento desiderati. Qui, utilizzare Agitazione Set Point (SP) = 15 rpm, temperatura SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Attendere il parametri equilibrare. </li><li> Confermare sensore è completamente polarizzata. Confermare il valore attuale DO si è stabilizzato. </li><li> Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; e cliccare su &quot;calibrazione&quot;. Fare clic su &quot;DO A&quot;, fare clic su &quot;One-point&quot;. </li><li> Immettere &#39;100&#39; nel campo &quot;Span&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;Calibra 1&quot;, cliccare su &quot;Salva&quot; e cliccare su &quot;close&quot;: </li></ol> 6 Avvio di una corsa <ol><li> Passare alla scheda Azioni. Fare clic su &quot;Batch&quot;. Utilizzare la tastiera su schermo o una tastiera esterna per immettere un nome lotto di 16 caratteri o meno. </li><li> Fare clic sul pulsante &quot;Nascondi&quot; della tastiera su schermo. Fare clic su &quot;Avvia partita&quot; confermare facendo clic su &quot;Start&quot; nella sovrapposizione. </li></ol> 7 Inoculare con celle <ol><li> Formare una connessione sterile tra una linea non utilizzata Oltre media (1 banda arancione) e la bottiglia di cellule / fonte bag mediante saldaturail tubo o utilizzando i raccordi Luer. </li><li> Installare la sezione in silicone del tubo nella pompa media in modo che la freccia verso il tubo tra la pompa e serbatoio. </li><li> Controllare morsetto tubo è aperto e la sua fascetta tubi ramificati è chiuso. Fare clic sul dispositivo di scorrimento per attivare la pompa dei media e cliccare su &quot;Off&quot;, dopo l&#39;aggiunta di cellule. </li><li> Passare alla scheda &quot;Azioni&quot; e cliccare su &quot;Pompe di controllo&quot;. </li></ol> 8 Campionamento <ol><li> Dopo inoculazione e la frequenza che desidera monitorare la cultura, estrarre un campione dalla cultura nel modo seguente: </li><li> Passare alla scheda &quot;azioni&quot; e fare clic su &quot;prendere esempio&quot;. Posizionare il tubo di campionamento nella pompa di campionamento e manipolare il rubinetto di campionamento in base alle istruzioni visualizzate sullo schermo. </li><li> Eseguire almeno una osservazione al microscopio ogni giorno e conta delle cellule su questi campioni. </li><li> Quando le cellule hanno raggiunto la densità desiderata, in questo case 1,2 x 10 6 cellule / ml, di infettare le cellule con l&#39;aggiunta di un inoculo del virus. </li><li> Aggiungere asetticamente l&#39;inoculo di una siringa da 20 ml, e collegare la siringa ad una delle porte di addizione pezzi sul reattore. Introdurre l&#39;inoculo al reattore premendo sullo stantuffo della siringa. </li><li> Continuare campionamento e l&#39;analisi della cultura per il adenovirus concentrazione di particelle intracellulare. </li></ol>

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells+A+Manual+of+Basic+Techniques+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications</a>. , 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).</li>
<li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+Data+File+18-1140-62%22%5BJournal%5D)">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li>
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<li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Int+Supp%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li>
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<li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSousa%2C+MF+%22Impact+of+Bioreactor+Design+on+the+Performance+of+Microcarrier+Cultures%22">Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures</a>. , 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).</li>
</ol>

Autori D. Giroux e Y. Hashimura sono dipendenti di PBS Biotech che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Questo sistema di bioreattore monouso è relativamente semplice da usare e fornisce analisi in tempo reale per il monitoraggio e l&#39;analisi del reattore. E &#39;estremamente adatto per la coltura di cellule di mammiferi e insetti con densità di cellule che raggiungono oltre 30 milioni di cellule / ml. Oltre cellule A549 descritti in questo rapporto 11, siamo cresciuti SF-9 cellule di insetto nel bioreattore pure. La miscelazione delicata fornito dalla ruota di aria pneumatica riduce il danno cellulare. Diversi passaggi sono fondamentali quando si imposta questo reattore. In primo luogo, la corretta calibrazione del pH e DO sensori è importante per il controllo ottimale della coltura e per l&#39;aggiunta di reagenti per regolare il pH o l&#39;ossigeno nel sistema. In secondo luogo, i flaconi dei reagenti e sementi devono essere riempiti e gli attacchi luer effettuate in ambiente sterile come una BSC. Una volta che i flaconi dei reagenti vengono spostati fuori dell&#39;ambiente sterile, i collegamenti con le linee di alimentazione bioreattore devono essere fatte con cura per evitare la contaminazione microbica. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Anche se questo sistema di bioreattore funziona bene per le linee cellulari di mammiferi e insetti non è progettato per colture batteriche. Il sistema non può fornire la miscelazione rapida e ossigenazione che è necessario per le cellule batteriche. La crescita batterica è meglio realizzato in un bioreattore serbatoio agitato. Rispetto ad altri bioreattori monouso per colture cellulari di mammifero o di insetto, questo sistema è facile da usare, fornisce dati sufficienti per l&#39;analisi di piste, e ha una crescita cellulare simile o migliore rispetto agli altri sistemi monouso abbiamo valutato. Il sistema di bioreattore pneumatico uso singola ha il potenziale per soddisfare molte delle attività di ricerca e applicazioni cliniche nel campo delle bioterapie, vaccini, cellule staminali e medicina personalizzata 4. Inoltre, la flessibilità di questo sistema permette di batch, fed-batch, perfusione, e le applicazioni bioreattore trasfezione basate 5. Infine, i sistemi di bioreattori monouso monouso hanno il potenziale per soddisfare le esigenze di larga scala la produzione industriale e di aderire alle linee guida e raccomandazioni di agenzie di regolamentazione nazionali e internazionali 6-10.

Linee di cellule di mammifero possono essere classificati in una delle tre categorie in base alle loro caratteristiche di crescita: le cellule che crescono in sospensione, le cellule che crescono come aggregati, e le cellule che crescono ancorate ad un substrato. Anche se il bioreattore aria-wheel dimostrato in questo video è in grado di crescere tutti e tre i tipi di cellule, questo video dimostra l&#39;uso del bioreattore a crescere celle dipendenti di ancoraggio sul micro-portanti. Cellule di mammifero dipendenti di ancoraggio possono essere coltivate per lo scopo di produrre più cellule - in cui le cellule stesse sono il prodotto. Ad esempio, osseo derivate cellule staminali mesenchimali osseo umano sono attualmente coltivati ​​con lo scopo di raccolta delle cellule e parenterale in tessuto malato. Il bioreattore pneumatico dimostrato in questo video è dimostrata adatta alla realizzazione di tali cellule staminali mesenchimali per questa applicazione (Serra et al., Comunicazione personale, 2013). Anchorage depcellule di mammifero Endentski sono tipicamente coltivate su piccola scala in recipienti di coltura 2D come piastre di coltura cellulare, fiasche di coltura cellulare, o bottiglie a rulli, dove aderiscono ad una superficie di crescita specialmente trattata 1. Quando più celle sono desiderati, le piastre o flaconi possono essere espansi utilizzando più o grandi vasi. Tuttavia, per più conveniente coltivazione di grandi quantità di celle dipendenti ancoraggio, aumentando la superficie per l&#39;adesione delle cellule può essere realizzato utilizzando piccole perle solidi chiamati micro-portanti. A seconda delle caratteristiche di fissaggio della cella, diversi tipi di micro-portanti sono disponibili in commercio, come il destrano, peptide, o collagene rivestito. Micro-vettori hanno una grande superficie in rapporto al volume che fornisce una superficie maggiore per la crescita cellulare; e le micro-vettori possono essere mantenuti in sospensione con agitazione, che permette alle cellule di essere coltivati ​​a alta densità nei sistemi di bioreattori 2. Attualmente, i tipi di bioreactors dove cellule aderenti sono coltivate su micro-vettori comprendono fiaschi filatore e sistemi di serbatoi agitati, che utilizzano giranti assiali per mantenere in sospensione le cellule rivestite con micro-portanti. Diversi fattori sono importanti per la coltivazione di successo di cellule, tra cui tensione di ossigeno, sforzo di taglio, matrici di superficie, e di nutrienti e le concentrazioni del metabolita. L&#39;uso di bioreattori consente il monitoraggio in tempo reale delle condizioni di crescita e il potenziale di costi di produzione notevolmente inferiori 1. Ci sono parecchi disegni bioreattore comune per la coltivazione in vitro di cellule tra cui, sospensione agitata, ruotando vaso a parete, a fibre cave, borsa bioreattore su una piattaforma rocker, e sistemi a letto fluido 3. Molti di questi sistemi presentano problemi particolari per la coltivazione delle cellule e la scala -up, come il costo elevato, gradienti di concentrazione di nutrienti, taglio idrodinamico, l&#39;aggregazione delle cellule, e la difficoltà di campionamento, il monitoraggio, il controllo e cell scale-up. Varie linee cellulari aderenti sono usati nella produzione di virus, sia nella produzione di vaccini virali o per la produzione di vettori virali per applicazioni in terapia genica. In questo video, utilizzando l&#39;unico uso pneumatico sistema di bioreattore (Air-Wheel), dimostriamo la coltura delle cellule di carcinoma polmonare umano (A549), le cellule di micro-vettori per la produzione di un adenovirus oncolitici. Il disegno bioreattore pneumatico utilizza una ruota agitazione verticale che è alimentato dalla galleggiabilità di gas strippata nel fondo del bioreattore. Questo metodo agitazione delicato limita le forze di taglio idrodinamiche, ma assicura comunque di medie e cellulare ottimale miscelazione 4. Rispetto al reattore serbatoio agitato, il reattore pneumatico ha una bassa sforzi di taglio anche con sistemi di bioreattori Air-Wheel grande disponibilità (Figura 1). In contrasto bioreattori agitati cisterna, la girante verticale di questo unico reattore uso è attivata da un flusso di bolle di gas all&#39;internoil vaso, che consente delicata ed uniforme miscelazione medio (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>PBS 3&nbsp;</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Use Assembly</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellule di carcinoma polmonare umano (A549)</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Tripsina fetale fetale sierica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>bovina</td></tr><tr><td>media ad alto glucosio EDTA, 0,25%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 1 Microcarrier</td><td>GE</td><td>3781</td><td></td></tr><tr><td>Antischiuma C</td><td>Sigma</td><td>A8011</td><td></td></tr></tbody></table>

la coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico bioreattore

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

I recenti progressi nella coltivazione e nell'aumento di cellule staminali di mammiferi, insetti e cellule staminali hanno creato enormi opportunità per nuove terapie e innovazioni di medicina personalizzata. Tuttavia, la traduzione di questi progressi in applicazioni terapeutiche richiederà sistemi in vitro che consentano sistemi di bioreattori robusti, flessibili ed economici. Esistono diversi sistemi di bioreattori attualmente utilizzati in ambito di ricerca e commerciale; Tuttavia, molti di questi sistemi non sono ottimali per stabilire, espandere e monitorare la crescita di diversi tipi di cellule. I parametri di coltura più difficili da controllare in questi sistemi includono la riduzione al minimo del taglio idrodinamico, la prevenzione della formazione di gradienti di nutrienti, la creazione di un'aerazione uniforme del terreno di coltura, la prevenzione della contaminazione microbica e il monitoraggio e la regolazione delle condizioni di coltura in tempo reale. Utilizzando un sistema di bioreattore pneumatico monouso, dimostriamo l'assemblaggio e il funzionamento di questo nuovo bioreattore per cellule di mammifero coltivate su micro-carrier. Questo sistema di bioreattori elimina molte delle sfide associate ai sistemi attualmente disponibili, riducendo al minimo il taglio idrodinamico e la formazione di gradienti di nutrienti e consentendo un'aerazione uniforme del terreno di coltura. Inoltre, il software del bioreattore consente il monitoraggio remoto in tempo reale e la regolazione dei parametri di funzionamento del bioreattore. Questo sistema di bioreattori ha anche un enorme potenziale per lo scale-up di cellule di mammifero aderenti e in sospensione per la produzione di una varietà di proteine terapeutiche, anticorpi monoclonali, cellule staminali, biosimilari e vaccini.

Nella Figura 3, sono indicati i parametri per l'inizio della corsa bioreattore. Questa figura mostra la schermata prima di impostare i parametri di temperatura, ossigeno disciolto, pH e agitazione. Una volta che i parametri sono impostati, i parametri della corsa vengono continuamente monitorati e le regolazioni possono essere fatte per mantenere le condizioni richieste. Il software produce una lettura continua che permette una facile identificazione dei problemi. In questo esperimento utilizzando 2,5 L di DMEM contenente 10% FBS, 250 ppm di SAFC antischiuma C, 2 mm L-glutammina e 3 g / L di micro-portanti, il sistema è stabilizzato in modo che la percentuale di ossigeno è del 50%, la temperatura è di 37 ° C, e il pH è 7,2. Il reattore viene inoculato con cellule A549 ad una concentrazione di 7 x 10 4 cellule / ml (o 10 cellule / micro-carrier). I parametri scelti per questa esecuzione comportato la maggior parte delle cellule aderenti alle micro-vettori in 2 ore (Figura 4). Dopo 12 ore, le cellule sono demonitrarsi segni di appiattimento e diffusione sulla superficie micro-portante (Figura 5). Entro 24 ore, micro-vettori hanno una distribuzione abbastanza uniforme della cellule, senza micro-vettori senza cellule e senza grandi ciuffi di celle micro-portanti (Figura 6). La percentuale di colonizzazione micro-carrier dalle cellule A549 è del 75% in 24 ore e 90% successivamente (Figura 7). Le cellule hanno continuato a crescere in modo esponenziale a ~ 1 milione di cellule / ml dopo 48 ore (Figura 8). Dopo l'infezione da una dose di adenovirus oncolitici (2 x 10 8 virioni / ml) a 50 ore, la densità è aumentato a 1,2 milioni di cellule / ml e poi ha cominciato a diminuire, come l'infezione litica progredito. C'era ~ 10.000 volte amplificazione del inoculo virale. In esperimenti precedenti, abbiamo trovato che il monitoraggio e la regolazione del flusso di gas è fondamentale per massimizzare la crescita delle cellule (dati non pubblicati). Rapidamente cellule in crescita possono esaurire il sistema di ossigeno con il livello DO cadere a zero. Mentre le cellule hanno continuato a crescere, era a un ritmo molto più lento. E 'fondamentale per controllare e regolare il flusso di ossigeno per soddisfare le esigenze di cella durante la fase di crescita logaritmica. Ogni corsa può essere analizzato per una crescita ottimale confrontando il pH, DO, e la temperatura con conta delle cellule quotidiane. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg"> Figura 1. Fluidodinamica del pneumatico bioreattore System (PBS), rispetto a un serbatoio bioreattore agitatore misura parete forze di taglio in vari volumi reattori. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg"> Figura 2 girante reattore Pneumatic Air-Wheel. 52008 / 52008fig3highres.jpg "/&gt; Figura 3 Pneumatic Air Wheel software schermata di parametri di avviare la corsa bioreattore. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg"> Figura 4 colonizzazione Micro-carrier con le cellule A549 2 ore dopo l'inoculazione. (Diametro medio di micro-carrier ~ 180 micron.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg"> Figura 5 12 ore dopo l'inizio della cultura, le cellule A549 attribuiscono, appiattimento, e diffondendo sui micro-portanti.5highres.jpg "target =" _blank "&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg"> Figura 6. Micro-portanti rivestiti con cellule dopo 24 ore di coltura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg"> Figura 7 Percentuale di colonizzazione micro-carrier da parte delle cellule A549 post-inoculazione. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg"> Figura 8 Il numero di cellule vitali A549 in coltura prima e dopo l'infezione con adenovirnoi. Notare che il punto infezione virale si è verificato a 50 ore.

Utilizzando un bioreattore pneumatico, dimostriamo l'assemblaggio, il funzionamento e le prestazioni di questo sistema di bioreattore monouso per la crescita di cellule di mammifero.

La coltivazione di cellule di mammifero utilizzando un singolo-uso del sistema pneumatico Bioreattore

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di far crescere grandi quantità di cellule di mammifero. Ciò si ottiene calibrando prima il pH e l'ossigeno disciolto o le sonde do, quindi sterilizzando in autoclave le sonde di pH, do e il manicotto della sonda di temperatura. Il secondo passo consiste nell'inserire le sonde e il manicotto nel recipiente e posizionare il recipiente sul bioreattore e collegare lo scarico, il filtro, le linee del gas e la sonda di temperatura.Il passo successivo consiste nel collegare i cavi DO e pH e nel collegare in modo asettico i supporti del terreno e del micro che vengono pompati nel bioreattore. Il passaggio finale consiste nell'avviare i controller per garantire che il bioreattore raggiunga la velocità, la temperatura e la saturazione di ossigeno desiderate. Infine, dopo l'inoculazione e il monitoraggio computerizzato, la coltura può essere elaborata per l'estrazione e la purificazione del prodotto desiderato.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il bioreattore con serbatoio di agitazione riutilizzabile, è che il bioreattore a ruota d'aria è facile da usare e riduce al minimo le possibilità di contaminazione microbica. Iniziamo. Per iniziare il protocollo, accedi alla schermata hello.Quindi, ispezionare il sensore di pH e verificare che la punta del sensore sia riempita con una soluzione elettrolitica. Procurarsi un becher con una soluzione a pH quattro, un altro becher con una soluzione a pH sette e un flacone di lavaggio con acqua distillata. Quindi collegare il cavo di pH al sensore di pH.Passare alla scheda delle azioni nell'interfaccia hello, selezionare calibra. Quindi selezionare la scheda PHA e la calibrazione a due punti. Inserire la temperatura del tampone nel campo della temperatura della soluzione di calibrazione.Posizionare il sensore nella soluzione pH quattro per la calibrazione Inserire il valore nel campo zero. Una volta che il grafico si è stabilizzato, premere, tarare e sciacquare il sensore di pH con acqua distillata. Ripetere la calibrazione per pH sette e salvare le impostazioni.Inserire il valore del buffer nel campo span e attendere che l'innesto si stabilizzi. Per iniziare l'ossigeno disciolto o eseguire la calibrazione. Assicurarsi che il sensore di ossigeno disciolto sia stato collegato al sistema per diverse ore e sia stato polarizzato all'interno della scheda di calibrazione, selezionare DOA e calibrazione a due punti.Scollegare il sensore di OD. Immettere zero nella scheda zero e attendere che il grafico si stabilizzi. Prima di selezionare la calibrazione, ricollegare il sensore do e inserire 100 nel campo span.Quando il grafico si stabilizza, fare clic su Calibra due. Quindi salva le impostazioni e chiudi il programma. Dopo la calibrazione, posizionare i sensori e il pozzetto termico nelle buste dell'autoclave e sterilizzarli in autoclave per 30 minuti a 121 gradi Celsius e 15 PSI.Al termine dell'autoclave, disinfettare le buste dell'autoclave con alcol isopropilico al 70% e trasferire le buste in una cabina di sicurezza biologica o BSC. Sanificare e introdurre il recipiente del reagente nel BSC. Rimuovere l'imballaggio interno e ispezionare il recipiente e il tubo per verificare che non siano danneggiati.Quindi, installare il sensore di OD nella porta anteriore sinistra del recipiente del reagente e il pozzetto termico nella porta posteriore sinistra. Installare il sensore di pH nella porta anteriore destra per l'installazione. Aprire il cappuccio del sensore e infilarlo leggermente nella porta sulla parte superiore del recipiente.Quindi trasferire il recipiente fuori dalla BSC. Assicurarsi che i cavi dei sensori di pH e OD si trovino all'esterno del manicotto del recipiente e che nulla si trovi all'interno del manicotto. Tenere il recipiente in modo da essere rivolto in avanti e far scorrere prima i piedini del recipiente nel manicotto.Assicurarsi che il fondo del recipiente sia appoggiato sui riscaldatori. Quindi inserire con cura il sensore di temperatura nella vasca termica. Bene. Quindi, rimuovere i set di tubi dalla borsa.Abbinare il codice colore sul tubo ai connettori e alle pompe corrispondenti sull'unità di controllo del bioreattore. Instradare le linee di aggiunta e campionamento dei fluidi dietro il sensore di ossigeno disciolto e la termica. Inserire bene il tubo nella pompa con codice colore sul lato sinistro del bioreattore.Collegare la linea principale e la micro linea del gas. Premere il connettore della linea principale del gas nella sua uscita del gas per installare la linea principale del gas. Quindi ruotare il connettore della micro linea del gas in senso orario nella sua uscita del gas Per installare la micro linea del gas.Per installare il tubo del forno del filtro, aprire il forno del filtro e fissare il tubo del filtro di scarico all'uan. Assicurarsi che il tubo passi attraverso i due ganci fino al filtro e fuori dal forno. Instradare la linea inferiore attraverso il gancio nella parte inferiore del forno con filtro e chiudere lo sportello.Quindi collegare i cavi ai sensori di ossigeno disciolto e pH. Al termine dell'installazione, formare un collegamento sterile utilizzando raccordi per esche tra una linea di edizione media inutilizzata e la fonte del sacchetto di bottiglia medio. Vai alla scheda delle azioni nell'interfaccia di Hello.Fare clic su pompe di controllo, selezionare pompa per fluidi e fare clic sul dispositivo di scorrimento per accendere la pompa per fluidi. Quindi aggiungere da 1,5 a 3,0 litri di supporto e fare clic sul cursore per spegnere la pompa. Il sistema è ora pronto per pompare nel reattore micro carrier precedentemente preparati.Questi possono essere aggiunti utilizzando una riga di addizione. Fissare la bottiglia MICROCAR alla linea di aggiunta appropriata utilizzando un blocco esca sterile. Accendere la pompa di addizione all'interno della schermata della pompa di controllo.Dopo l'aggiunta dei micro vettori, spegnere la pompa utilizzando il cursore, tornare alla schermata principale dell'interfaccia hello, selezionare le azioni e quindi le avanzate. Selezionare il controller appropriato per modificare le impostazioni. Impostare i controller su auto e inserire i set point.Dopo aver impostato i controller, accendere la pompa dell'aria. Guardare all'interno del recipiente del reagente per assicurarsi che la ruota pneumatica stia ruotando. Assicurarsi che il sensore di ossigeno disciolto sia completamente polarizzato e che il valore di ossigeno disciolto si sia stabilizzato.Quindi calibrare la forma del sensore di do, una connessione sterile tra una linea di aggiunta del mezzo inutilizzata identificata da una banda arancione e la fonte della sacca della bottiglia di celle utilizzando raccordi per esche. Quindi, installare la sezione in silicone del tubo nella pompa del fluido. Assicurarsi che il tubo clamp è aperto e che il tubo ramificato clamp è chiuso.Passare alla scheda della pompa di controllo, quindi accendere la pompa del fluido. Aggiungere le celle e spegnere la pompa del supporto. Dopo l'inoculazione, accedere alla scheda delle azioni e selezionare Preleva campione.Assicurarsi che il tubo di campionamento sia nella pompa di campionamento e manipolare il rubinetto di arresto del campionamento secondo le istruzioni sullo schermo. Rimuovere la siringa con il campione per la conta delle cellule e altre applicazioni a valle per eseguire la conta delle cellule. Infine, quando le cellule hanno raggiunto la densità desiderata di 1,2 volte 10 per le sei cellule per millilitro, si aggiunge setticamente l'inoculo virale a una siringa da 20 millilitri.Collegare la siringa a una porta di aggiunta di riserva sul reattore. Utilizzare lo schermo della pompa di controllo per accendere la pompa di addizione e aggiungere l'inoculo virale. La maggior parte delle celle A 5 49 ha aderito ai micro carrier entro due ore.Dopo 12 ore, le cellule hanno mostrato segni di appiattimento e diffusione sulla superficie della microcar. Entro 24 ore, i micro portatori hanno mostrato una distribuzione uniforme delle cellule. La colonizzazione delle microcar avviene rapidamente, come dimostrato qui.La percentuale di colonizzazione di microcar da parte di 54 9 cellule è del 75% entro 24 ore. Questo grafico mostra il numero di cellule vitali in coltura 54 9 in coltura pre e post infezione da adenovirus. Le cellule continuano a crescere in modo esponenziale fino a 1 milione di cellule per millilitro dopo 48 ore.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare e far funzionare un bioreattore a ruota d'aria per far crescere cellule di mammifero ad alta densità per la produzione cellulare o proteica. Grazie per aver guardato e in bocca al lupo per i vostri esperimenti.

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