Name: Limpianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Impara l'impianto di gel di fibrina sul polmone di topo per studiare l'angiogenesi e la rigenerazione alveolare. Questo metodo permette di analizzare la formazione dei vasi sanguigni in vivo.

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Questo lavoro è stato sostenuto da fondi da American Heart Association (AM), US Department of Defense (BC074986), e Boston Children Hospital Facoltà Career Development Fellowship (TM, AM). Gli autori ringraziano Amanda Jiang e Jiang Elisabeth per l&#39;assistenza tecnica.

NOTA: Lo studio in vivo degli animali in stato effettuato in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato esaminato e approvato dalla cura degli animali e uso Comitato di Hospital di Boston per bambini (numeri di protocollo: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Tutti i farmaci utilizzati in questo protocollo sono di qualità farmaceutica e questi farmaci sono preparati in condizioni sterili. 1. fibrina Gel Preparazione <ol><li> Preparare gel di fibrina che contiene VEGF e bFGF. <ol><li> Scongelare soluzioni stock di fibrinogeno e trombina che sono immagazzinate a -80 ° C a temperatura ambiente (25 ° C). </li><li> Aggiungere trombina (concentrazione finale: 2,5 U / ml), CaCl 2 (concentrazione finale: 45 mM), VEGF (concentrazione finale: 0-100 ng / ml) e bFGF (concentrazione finale: 0-100 ng / ml) al fibrinogeno soluzione (concentrazione finale: 12,5 mg / ml in 0,9% sodium soluzione di cloruro 43-45) in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Mescolare delicatamente pipettando. </li><li> Pipettare delicatamente 200 microlitri della miscela su un piatto di plastica sterile in modo goccia a goccia con punta p200 pipetta. </li><li> Incubare le gocce a 37 ° C per 30-60 min fino a che solidificano. NOTA: Il gel solidificato può essere mantenuto nel piatto di plastica sigillata a temperatura ambiente (25 ° C) per diverse ore prima dell&#39;impianto (Figura 1a). </li></ol></li><li> Tagliare il gel di fibrina in circa 3 x 3 x 3 millimetri cubi utilizzando piccole forbici chirurgiche prima dell&#39;impianto. </li></ol> 2. Preparazione del mouse <ol><li> Anestetizzare topo adulto (8-12 settimane) da intraperitoneale (IP) iniezione di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) e verificare che il mouse sia adeguatamente anestetizzato pizzicando punta del mouse. <ol><li> Usare pomata veterinario su occhi del mouse per prevenire la secchezza durante l&#39;esperimento. </li></ol></li><li> Shave fur su lato sinistro della gabbia toracica del mouse. </li><li> Eseguire intubazione endotracheale del mouse. </li><li> Posizionare il mouse sul basamento intubazione angolata a 70 ° e tenere in posizione il mouse agganciando suoi incisivi superiori su un piccolo elastico situato nella parte superiore del supporto. </li><li> Ritrarre delicatamente la lingua da un lato con pinze smussato. </li><li> Visualizzare la laringe con l&#39;aiuto di un microscopio a collo d&#39;oca illuminatore a fibre ottiche. </li><li> Inserire endotracheale catetere elastico (21 G) nella trachea. </li><li> Verificare che il mouse sia spontaneamente respirando in modo regolare (normale 100-150 respiri / min, senza respiro paradosso o superficiale). </li><li> Posizionare il mouse in posizione prona al microscopio di dissezione. </li><li> Meccanicamente ventilare il mouse utilizzando un ventilatore roditore (150 respiri / min e 7 ml / kg volume corrente). </li><li> Contare costole di individuare spazio intercostale tra 4 ° e 5 ° costola. </li><li> Creare un campo sterile sull&#39;area by accuratamente pulire giù con alcool e Povidone-iodio. Coprire il campo chirurgico adeguato con un telo chirurgico sterile. </li></ol> 3. mouse Chirurgia <ol><li> Dopo iniezione locale di 0,25% bupivacaina (200 microlitri) nella pelle, fare una incisione cutanea trasversale (circa 1 cm di lunghezza) sopra spazio intercostale usando forbici dissezione. </li><li> Dopo l&#39;iniezione di 0,25% bupivacaina (200 ml) nel muscolo intercostale fare un&#39;incisione muscolo tra il 4 ° e 5 ° costola con belle piccole forbici. </li><li> Inserire un divaricatore dissezione tra le costole di visualizzare completamente il polmone sinistro. <ol><li> Raschiare una piccola area (1 x 1 mm quadrato) di pleura viscerale del centro di polmone sinistro utilizzando una pinza sottile. </li><li> Applicare una leggera pressione sulla zona con un tampone di cotone sterile fino sanguinamento e perdite d&#39;aria sono completamente controllati. </li><li> Mettete piccola quantità di miscela fresca di fibrinogeno / trombina (colla di fibrina) (fase 1.1.2. 20 &amp; #181; l) sopra la zona utilizzando punta p200 pipetta. </li></ol></li><li> Posizionare delicatamente un gel di fibrina (passo 1,2) con piccole pinze sopra la zona (Figura 1b). <ol><li> Verificare che il gel è ben fissato sulla superficie durante i movimenti respiratori del polmone. </li></ol></li><li> Verificare che non vi è né perdite di aria massiccia né sanguinamento dal polmone. </li><li> Chiudi incisioni (strati muscolari e cutanee) con sutura riassorbibile, che non devono essere rimosse. </li><li> Aspirare la cavità toracica con 27 G ago e siringa da 1 ml per evitare pneumotorace. </li><li> Terminare la ventilazione meccanica. </li></ol> 4. Il recupero del mouse <ol><li> Assicurarsi che il mouse sia spontaneamente respirando in modo regolare (normale 100-150 respiri / min, senza respiro paradosso o superficiale). </li><li> IP iniettare 1 ml di pre-riscaldato 0,9% NaCl per prevenire la disidratazione. </li><li> Lasciare il mouse per recuperare sul pad circolare acqua calda. </li><li> Rimuovere il endotracheal tubo dopo aver confermato che il mouse ha respirazione stabile. </li><li> Iniettare Meloxicam (5 mg / kg, iniezione sottocutanea (SC), per 3 giorni come analgesico postoperatorio. </li><li> Monitorare i movimenti del mouse attentamente un minimo di 15 min intervalli finché è sternale (grado di rotolare sul suo stomaco e restare in piedi) e consapevole. </li><li> Dopo il recupero, ritorno il mouse in una nuova gabbia isolata da topi senza intervento chirurgico. </li><li> Monitorare il sito chirurgico per segni di infezione (rossore, gonfiore, scarico), le funzioni biologiche di base di animali (cibo e acqua presa, minzione, defecazione, corpo aumento di peso), così come i segni clinici di sofferenza (piloerezione, ridotta locomozione) al giorno dopo la procedura chirurgica. </li></ol> 5. La raccolta Polmone <ol><li> 7 a 30 giorni dopo l&#39;impianto, eutanasia il mouse utilizzando CO 2 tramite fonte di gas compresso. </li><li> Fare un&#39;incisione tra la punta del processo xifoideo e sternalenotch (sternotomia mediana) e il raccolto intero polmone con il gel impiantato per l&#39;analisi istologica e biochimica tagliando la trachea e sezionare tutti i collegamenti con il cuore, i polmoni, e la trachea. </li><li> Fissare gel impiantato con polmoni con soluzione di paraformaldeide 4% per una notte a 4 ° C, incorporare in OCT, e prendere le sezioni di passo di serie di 30 micron di spessore. </li><li> Eseguire istologico (ematossilina e eosina) e le analisi immunoistochimica (marcatore endoteliale: CD31, marcatore epiteliale: aquaporin (AQP) 5 e surfattante proteina (SP) -B) utilizzando il microscopio confocale 22,37,40. </li><li> Compilare pile di sezioni ottiche (30 micron di spessore) per formare le immagini tridimensionali di cellule endoteliali e cellule epiteliali del polmone mediante immagini 3D software di analisi 37. </li><li> Quantificare le aree proiettate dei vasi sanguigni di nuova formazione con immagine software di analisi 46. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo articolo introduce un nuovo metodo per impiantare biomateriali sulla superficie del polmone di vivere topo adulto. Con questo sistema, angiogenesi ospitante polmone-derivato è ricapitolato correttamente all&#39;interno del materiale. Questo sistema permette ai ricercatori di esplorare diafonia tra le cellule endoteliali, altre cellule (ad esempio, cellule epiteliali, cellule mesenchimali, cellule immunitarie) e vari componenti ECM che sono necessari per l&#39;angiogenesi locale 50-53 e rigener...

L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di introdurre un metodo per impiantare il gel di fibrina sulla superficie del polmone di topo adulto, che permette ai ricercatori di caratterizzare i meccanismi molecolari di vascolare polmonare e sviluppo alveolare, e di sfruttare questa conoscenza per sviluppare materiali biomimetici grado di ricapitolare vascolare polmonare fisiologica e formazione alveolare per il trattamento di varie malattie polmonari. Più di 35 milioni di americani soffrono di malattie polmonari croniche, tra cui malattia polmonare ostruttiva cronica e fibrosi polmonare. Questi pazienti hanno sintomi di lunga durata croniche respiratorie, come mancanza di respiro, senso di costrizione toracica, tosse fastidiosa, e la stanchezza, che limitano considerevolmente la loro vita quotidiana 1-3. Nonostante una grande quantità di sforzo per sviluppare terapie efficaci per queste malattie polmonari, attualmente non esiste una cura; quindi, la qualità della vita di questi pazienti è scarsa ed economica e costi umani sono high 4-7. Attualmente, il trapianto di polmone è l&#39;unico modo per salvare i pazienti con stadio terminale malattie polmonari croniche. Tuttavia, a causa della carenza di donatori di trapianto, costo elevato, gravi complicazioni, e basso tasso di sopravvivenza 8-11, il trapianto non è un approccio ottimale. Recenti rapidi progressi nelle tecniche di ingegneria tissutale ha permesso ai ricercatori di bioingegnere polmone impiantabile da ripopolamento decellularized intero polmone con vari tipi di cellule progenitrici o staminali pluripotenti indotte (iPS), cellule 12,13. Tuttavia, questi polmoni bioingegneria sono funzionali in animali ospiti solo per diverse ore dopo l&#39;impianto 12,14,15. Utilizzando biomateriali per rigenerare le strutture complesse e le funzioni dei polmoni è stato abbastanza infruttuoso anche. Ciò può essere dovuto processi biologici fondamentali che regolano la rigenerazione dei polmoni per adulti non sono stati ben esplorato. Nel polmone, formazione del sistema vascolare è uno degli eventi prime e più importanti durisviluppo ng e rigenerazione 16-21. Vasculatures nuova formazione nel polmone non solo fornire ossigeno, nutrienti e vari componenti cellulari necessari per la formazione di organi, ma anche fornire segnali regolatori istruttivi alle cellule circostanti 22-25. Così, l&#39;angiogenesi svolge un ruolo chiave nel alveolarization rigenerativa nei polmoni adulti 24,26,27. Inoltre, l&#39;angiogenesi deregolamentato contribuisce a malattie polmonari croniche come la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) 28, displasia broncopolmonare (BPD) 21-23, e la fibrosi polmonare 29. Così, per sviluppare strategie più efficaci per l&#39;ingegneria polmoni o la cura delle malattie polmonari croniche, è necessario capire i meccanismi fondamentali di angiogenesi specifici polmone. Ogni organo visualizza uniche proprietà meccaniche e chimiche, che possono differire tra le condizioni fisiologiche e patologiche 30-33. Questi microenviron organo-specificamenti regolano i comportamenti delle cellule endoteliali e orchestrare la formazione della rete vascolare in maniera specifica per organo 24,34-36. Così, per sviluppare strategie più efficaci per la rigenerazione dei polmoni, il meccanismo alla base dell&#39;angiogenesi specifici polmone deve essere capito. Mentre convenzionali in vivo test di angiogenesi come il sottocutaneo idrogel l&#39;impianto sono stati ampiamente utilizzati per la ricerca angiogenesi 37-39, questi metodi non ricapitolano angiogenesi organo-specifica. Recentemente, un nuovo metodo per impiantare Matrigel in uno stampo elastico sul polmone del mouse è stato sviluppato e dimostrato di reclutare vasi sanguigni e cellule epiteliali polmonari nei gel 22. Questo approccio unico permetterà ai ricercatori di esplorare il meccanismo di angiogenesi specifici polmone, nonché le interazioni tra i vasi sanguigni e cellule polmonari non-vascolari in condizioni fisiologiche e patologiche. Poiché 1) Matrigel non è adatto per l&#39;applicazione clinica; 2) la emuffa lastic utilizzato per lanciare il gel possono influenzare le interazioni tra idrogel e tessuto polmonare ospitante e 3) lo stampo elastico sul polmone potenzialmente causa compromissione della funzione polmonare e dolore durante la respirazione, come un approccio più clinicamente rilevante, una matrice di fibrina 3D contenente fattori angiogenetici (fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) / base il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF)) è stato impiantato il polmone mouse senza fusione in stampo elastico, ed è ricapitolata successo ospite angiogenesi polmone-derivato. Gel di fibrina, fibrille polimeriche generati dal fibrinogeno-trombina spaccati, è noto per intrappolare una varietà di fattori angiogenici come bFGF e VEGF per accelerare l&#39;angiogenesi in vivo 40,41. A causa della sua capacità rigenerativa e la natura biodegradabile 42, gel di fibrina è ampiamente usato nel campo dell&#39;ingegneria dei tessuti. Questo articolo introduce un approccio nuovo e unico per impiantare il gel di fibrina sulla superficie del polmone di Adul viveret mouse e dimostra che ospitano l&#39;angiogenesi polmone-derivato è ricapitolato all&#39;interno dei gel in vivo. Questo metodo, che consente ai ricercatori di studiare l&#39;angiogenesi specifici polmone, probabilmente porterà allo sviluppo di nuovi approcci terapeutici per i vari tipi di malattie polmonari e far avanzare in modo significativo gli sforzi per rigenerare con successo polmonare adulta.

<table><tbody><tr><td>Fibrinogeno da placenta umana</td><td>Sigma</td><td>F4883</td><td>Per la fabbricazione di gel di fibrina</td></tr><tr><td>Trombina da plasma bovino</td><td>Sigma</td><td>T9549</td><td>Per la fabbricazione di gel di fibrina</td></tr><tr><td>Topo ricombinante VEGF 164</td><td>R& D</td><td>493-MV</td><td>Per l'integrazione con gel di fibrina</td></tr><tr><td>Mouse ricombinante bFGF</td><td>R& D</td><td>3139-FB</td><td>Per l'integrazione al gel di fibrina</td></tr><tr><td>Supporto per intubazione per roditori</td><td>Braintree Scientific INC</td><td>RIS 100</td><td>Per intubazione</td></tr><tr><td>Sorgente luminosa a fibre ottiche</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-35</td><td>Per intubazione</td></tr><tr><td>21 G Catetere elastico</td><td>B.Braun</td><td>4251652-02</td><td>Per intubazione</td></tr><tr><td>Ventilatore MiniVent</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>CGS-8009</td><td>Per ventilazione</td></tr><tr><td>Stemi DV4 Steromicroscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-070-515</td><td>Per chirurgia</td></tr><tr><td>Sutura absobabile</td><td>Ethicon</td><td>PDP304</td><td>Sutura chirurgica</td></tr><tr><td>Anticorpo contro CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Immunoistochimica</td></tr><tr><td>Anticorpo contro AQP5</td><td>Abcam</td><td>AB78486</td><td>Anticorpo immunoistochimico</td></tr><tr><td>contro SP-B</td><td>Abcam</td><td>AB40876</td><td>Immunoistochimica</td></tr></tbody></table>

l&#39;impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi lung-specifica

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

I recenti progressi significativi nelle tecniche di ricerca e bioingegneria delle cellule staminali hanno fatto grandi progressi nell&#39;utilizzazione biomateriali per rigenerare e riparare i danni nei tessuti semplici nel settore ortopedico e parodontali. Tuttavia, i tentativi di rigenerare le strutture e le funzioni più complesse tridimensionali (3D) organi come polmoni non hanno avuto molto successo perché i processi biologici di rigenerazione di organi non sono stati ben esplorato. E &#39;ormai chiaro che l&#39;angiogenesi, la formazione di nuovi vasi sanguigni, gioca un ruolo chiave nella rigenerazione degli organi. Di recente formazione vasculatures forniscono non solo ossigeno, nutrienti e vari componenti cellulari che sono necessari per la rigenerazione di organi, ma anche fornire segnali istruttivi ai rigeneranti tessuti locali. Pertanto, per rigenerare successo polmoni in un adulto, è necessario ricapitolare i microambienti specifico polmonari in cui angiogenesi unità rigenerazione dei tessuti polmonari locali. Sebbene conventional saggi in vivo di angiogenesi, come impianto sottocutaneo di matrice extracellulare (ECM) ricchi di idrogel (per esempio, fibrina o collagene gel o Matrigel - miscela di proteine ​​ECM secreta dalle cellule del mouse Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma), sono ampiamente utilizzati per esplorare la meccanismi generali di angiogenesi, angiogenesi specifici polmone non è stato ben caratterizzato, perché i metodi per l&#39;impianto ortotopico di biomateriali a livello polmonare non sono stati ben stabiliti. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di introdurre un metodo unico per impiantare il gel di fibrina sulla superficie del polmone di vivere topo adulto, consentendo la ricapitolazione di successo dell&#39;ospite angiogenesi polmone-derivati ​​all&#39;interno del gel. Questo approccio consente ai ricercatori di esplorare i meccanismi con cui il microambiente specifico-polmone controlla l&#39;angiogenesi e la rigenerazione alveolare sia in condizioni normali e patologiche. Dal biomateriali impiantati rilascio e fornire segnali fisici e chimici a adiacente ltessuti ung, l&#39;impianto di questi biomateriali sul polmone malato possono potenzialmente normalizzare i tessuti malati adiacenti, consentendo ai ricercatori di sviluppare nuovi approcci terapeutici per i vari tipi di malattie polmonari.

Per esaminare se ospite polmone-derivato formazione vascolare è ricapitolato all'interno dei biomateriali impiantati sul polmone, gel di fibrina integrati con i principali fattori angiogenici VEGF e bFGF (0, 10 e 100 ng / ml) sono stati impiantati sulla superficie della vita polmoni mouse come segnalato con Matrigel 22. Gel di fibrina 47 che contengono questi fattori di crescita angiogenici sono stati fabbricati come mostrato in Figura 1a. Dopo toracotomia, una piccola area della s...

La ricapitolazione del microambiente organo-specifico, che stimola l'angiogenesi locale, è indispensabile per il successo della rigenerazione dei tessuti danneggiati. Questo rapporto dimostra un nuovo metodo per impiantare gel di fibrina sulla superficie polmonare di topo vivente al fine di esplorare come il microambiente polmonare specifico modula l'angiogenesi e la rigenerazione alveolare nel topo adulto.

L&#39;impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

L'obiettivo generale della seguente procedura è utilizzare l'impianto di gel di fibrina per studiare la rigenerazione vascolare e alveolare nel polmone del topo. Ciò si ottiene preparando prima gocce di gel di fibrina, integrate con fattori angiogenici. Nella seconda fase, l'animale da esperimento viene ventilato meccanicamente e il torace viene aperto.Successivamente, un gel di fibrina viene accuratamente attaccato al polmone del topo con colla di fibrina. E poi, nella fase finale, il polmone e il gel impiantato vengono raccolti da sette a 30 giorni dopo per l'analisi istologica. In definitiva, la formazione dei vasi sanguigni e delle alveolari all'interno dell'impianto di gel può essere valutata mediante analisi immunoistochimica.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia vascolare, come ad esempio come gli organi rischiano il microambiente, controllano l'angiogenesi e la morfogenesi degli organi, dimostrando che la procedura sarà un modello bema un collega del nostro laboratorio Per preparare gel di fibrina che contengono sia VEGF che BFGF iniziare riscaldando meno 80 gradi Celsius, scorte di fibrinogeno e trombina a temperatura ambiente. Quando le scorte sono completamente scongelate, aggiungere trombina, cloruro di calcio, VEGF e BFGF alla soluzione di fibrinogeno in una provetta da 1,5 millilitri. E poi mescolare la soluzione mediante pipettaggio.Quindi pipettare delicatamente 200 microlitri di miscela, goccia a goccia su un piatto di plastica sterile. Incubare le gocce a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti fino a quando non si solidificano. Quindi usa piccole forbici chirurgiche per tagliare i gel in cubi di circa tre per tre per tre millimetri.Dopo aver confermato la sedazione completa in un topo di età compresa tra otto e 12 settimane con un pizzico per le dita dei piedi, coprire gli occhi dell'animale con un unguento veterinario per prevenire la secchezza, quindi radere il pelo sul lato sinistro della gabbia toracica. Per l'intubazione endotracheale, posizionare il mouse su un supporto per intubazione inclinato a 70 gradi e agganciare gli incisivi superiori su un piccolo elastico situato nella parte superiore del supporto per tenere l'animale in posizione. Usa una pinza smussata per ritrarre delicatamente la lingua da un lato, quindi visualizza la laringe con l'aiuto di un illuminatore per microscopio a collo d'oca a fibra ottica.Quindi, inserire un catetere elastico endotracheale calibro 21 nella trachea. Verificare che il topo respiri spontaneamente senza intoppi, quindi posizionare l'animale in posizione prona sotto il microscopio di dissezione. Utilizzare un ventilatore per roditori per ventilare meccanicamente l'animale a 150 respiri al minuto e sette millilitri per chilogrammo di volume corrente.E poi contare le costole per individuare lo spazio intercostale tra la quarta e la quinta costola. Quindi pulire accuratamente l'area con alcol e iodio povidone per creare un campo sterile e coprire l'area chirurgica con un tra sterile per posizionare il gel sul polmone. Successivamente, praticare un'incisione cutanea trasversale di un centimetro sullo spazio intercostale.E poi fai un'incisione muscolare tra la quarta e la quinta costola. Inserire un divaricatore da dissezione tra le costole per visualizzare completamente il polmone sinistro, quindi utilizzare una pinza fine per raschiare un quadrato di pleura viscerale di un millimetro per un dal centro del polmone sinistro utilizzando un batuffolo di cotone sterile. Quindi, applicare una leggera pressione sull'area fino a quando l'emorragia e le perdite d'aria non sono completamente controllate, quindi erogare una piccola quantità di colla di trombina fibrinogeno non solidificata sull'area.Quindi, posizionare delicatamente un gel di fibrina sulla colla e osservare i movimenti respiratori del polmone per determinare che il gel sia ben fissato. Quindi chiudere le incisioni con una sutura riassorbibile. Aspirare la cavità toracica con una siringa da un millilitro dotata di ago calibro 27 per prevenire lo pneumotorace, quindi terminare la ventilazione meccanica.Dopo aver confermato che il topo respira senza intoppi, iniettare un millilitro di cloruro di sodio allo 0,9% prebellico per via intraperitoneale per prevenire la disidratazione e consentire al topo di riprendersi su un cuscinetto di acqua calda circolante. Una volta che l'animale mostra una respirazione stabile, rimuovere il tubo endotracheale e iniettare un analgesico postoperatorio. Quando l'animale si è completamente ripreso, rimettilo in una nuova gabbia isolata dai topi senza intervento chirurgico, monitorando quotidianamente l'animale per segni di infezione o complicanze.Da sette a 30 giorni dopo l'impianto, sopprimere il topo secondo il protocollo e praticare un'incisione tra la punta del processo xifoideo e la tacca sternale. E poi tagliare la trachea sezionando tutte le connessioni dal polmone al cuore e alla trachea, raccogliere l'intero polmone e il gel impiantato, quindi fissare il gel e il tessuto polmonare all'interno di una soluzione di aldeide paraforme al 4% durante la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo, incorporare il tessuto polmonare nel composto OCT e quindi raccogliere sezioni seriali del polmone e del gel a uno spessore di 30 micrometri. Colorare le sezioni con ematina ed eoina e anticorpi contro i marcatori di interesse appropriati.E poi, dopo aver scattato le immagini delle sezioni di Zack, compila le pile delle sezioni ottiche per formare immagini tridimensionali delle cellule endoteliali ed epiteliali del polmone. Utilizzo di un software di analisi delle immagini 3D. Infine, quantificare le aree proiettate dei vasi sanguigni appena formati utilizzando l'apposito software di analisi delle immagini.Sette giorni dopo l'impianto, il gel di fibrina viene incorporato nel polmone ospite La ricostruzione 3D delle immagini a fluorescenza confocale ha dimostrato che le cellule endoteliali CD31 positive derivate dall'ospite formano reti vascolari all'interno dei gel sette giorni dopo l'impianto in modo dipendente dalla dose A-V-E-G-G-F-F, le cellule epiteliali polmonari positive all'acquaporina di tipo uno, cinque positive all'acquaporina e la proteina B positiva al tensioattivo di tipo due vengono reclutate anche lungo i vasi sanguigni appena formati all'interno dei gel che vengono integrati con concentrazioni più elevate di VGF e B, FGFH e d. La colorazione delle sezioni istologiche rivela che anche altri tipi di cellule ospiti migrano nel gel sette giorni dopo l'impianto. Questi risultati suggeriscono che le reti vascolari rigenerative derivate dal polmone ospite e la formazione alveolare sono costruite con successo all'interno dei gel di fibrina dopo l'integrazione con fattori angiogenici e l'impianto sulla superficie del polmone di topo adulto dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada a un minor numero di ricercatori nel campo della biologia polmonare e della medicina primaria per esplorare il meccanismo della normale angiogenesi e come si manifesta nello stato di malattia nei polmoni di topo.

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Questo video mostra un saggio modificato basato su microsfere di vettore che incorpora periciti per studiare la germinazione endoteliale durante le prime fasi dell'angiogenesi. Il test fornisce un modello sperimentale in vitro per comprendere i meccanismi molecolari dell'angiogenesi e l'effetto delle terapie anti-angiogenetiche.

Saggio di germinazione di perline per la valutazione dell'angiogenesi in fase iniziale: un modello in vitro basato su perline per studiare la germinazione endoteliale in presenza di periciti

Il polmone è perfuso sia l'arteria sistemica bronchiale e arterie polmonari. Nella maggior parte delle patologie polmonari, è il più piccolo vascolare sistemica che mostra neovascolarizzazione robusta. La cessazione del flusso ematico polmonare promuove l'angiogenesi vivace bronchiale. Noi forniamo i dettagli chirurgici di indurre ischemia arteriosa polmonare sinistra che promuove la neovascolarizzazione bronchiale.

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Nella misura in vivo della superficie polmonare strato endoteliale mouse

Per migliorare la nostra conoscenza della formazione neotissue cellulare e molecolare, un modello murino della TEVG è stata sviluppata di recente. Gli innesti sono stati impiantati come infrarenali innesti vena cava interposizione di C57BL / 6 topi. Questo modello raggiunge risultati simili a quelli ottenuti nella nostra ricerca clinica, ma nel corso di un time-course di gran lunga ridotto.

L&#39;impianto di Vena cava inferiore Interposizione Graft in modello murino

Vi presentiamo un protocollo per studiare le interazioni umane endoteliali-periciti in mouse utilizzando una variazione del saggio spina angiogenesi gel matrice.

Studio in vivo di Human Interaction endoteliale-pericyte Utilizzando la matrice di gel Plug Assay nel topo

Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare formazione del vaso sanguigno in vivo e in tempo reale in 3D impalcature da microscopia multifotonica. Angiogenesi in impalcature geneticamente è stato studiato in un modello di difetto critico calvarial murino dell'osso. Più nuovi vasi sanguigni sono stati rilevati nel gruppo di trattamento rispetto ai controlli.

Visualizzando l'angiogenesi da microscopia multifotonica In Vivo in geneticamente 3D-PLGA/nHAp impalcatura per Calvarial riparazione di difetti ossei critici

Descriviamo un multimodali non invasive imaging approccio basato su Micro-CT e fluorescenza molecolare tomografia per valutazione longitudinale del modello di fibrosi del polmone del topo indotto mediante instillazione intratracheale doppia di bleomicina.

Un Multimodal Imaging approccio basato su Micro-CT e fluorescenza molecolare tomografia per valutazione longitudinale della fibrosi polmonare indotta da bleomicina in topi

Qui presentiamo un metodo efficace per studiare l'attività antifibrotica delle cellule manomalifonde umane infuso infuso ottenuto da tutto il cordone ombelicale in seguito all'induzione della lesione polmonare da un'iniezione endotracheale di bleomycina nel C57BL /6 topi. Questo protocollo può essere facilmente esteso ai test preclinici di altre terapie.

Induzione di lesioni polmonari del topo da Iniezione endotracheale di Bleomycin

Il metodo qui presentato può valutare l'effetto dei reagenti sull'angiogenesi o sulla permeabilità vascolare in vivo senza colorazione. Il metodo utilizza l'iniezione di destrano-FITC attraverso la vena caudale per visualizzare i neovasi o le perdite vascolari.

Saggio modificato in vivo del gel plug della matrice per gli studi sull'angiogenesi

Questo articolo descrive come creare polmoni di topo bioingegnerizzati utilizzando metodi di decellularizzazione e ricellularizzazione. Descrive anche in dettaglio il successivo trapianto di polmone ortotopico.

Trapianto di polmone bioingegnerizzato utilizzando polmoni di topo decellularizzati e cellule endoteliali umane primarie

La terapia cellulare offre un intervento promettente per la fibrosi polmonare utilizzando cellule progenitrici per riparare i tessuti danneggiati e migliorare la funzione polmonare. Poiché l'imaging svolge un ruolo fondamentale nel tracciamento dell'integrazione cellulare, in questo articolo descriviamo il tracciamento in vivo guidato dall'imaging con particelle magnetiche della terapia cellulare per la fibrosi polmonare in un modello murino.

Tracciamento in vivo guidato da immagini di cellule progenitrici epiteliali polmonari distali trapiantate per la fibrosi polmonare mediante imaging con particelle magnetiche

Impara l'impianto di gel di fibrina sul polmone di topo per studiare l'angiogenesi e la rigenerazione alveolare. Questo metodo permette di analizzare la formazione dei vasi sanguigni in vivo.

L'impianto di fibrina gel sul mouse polmone per studiare angiogenesi Lung-specifica

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