Tecniche sperimentali e di imaging per l'esame Strutture coagulo di fibrina in normali e patologiche Uniti

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare le differenze morfologiche nelle strutture anormali dei coaguli che si verificano nel diabete e nell'anemia falciforme, condizioni patologiche per coaguli diabetici simulati. Ciò si ottiene mediante l'imaging delle strutture del coagulo glicato mediante microscopia confocale per campioni di sangue da pazienti affetti da anemia falciforme. I coaguli di fibrina contenenti globuli rossi vengono visualizzati confocali in tempo reale.

L'analisi al microscopio può quindi essere eseguita per valutare i tassi di fibrinolisi sulle strutture normali e glicate del coagulo. In definitiva, questa analisi in tempo reale può essere utilizzata per valutare le differenze morfologiche che si verificano nelle strutture anomale dei coaguli in risposta agli stati patologici in cui insorgono. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della trombosi e dell'emostasi, come ad esempio in che modo le strutture del coagulo di fibrina sono diverse nei pazienti con diabete o anemia falciforme.

Per valutare i coaguli diabetici simulati mediante microscopia confocale, scongelare prima il fibrinogeno umano e il coniugato di fibrinogeno umano marcato al 10% in fluorescenza a 37 gradi Celsius quando le soluzioni di fibrinogeno riscaldato mescolato al fibrinogeno umano e il fibrinogeno coniugato in una soluzione di cloruro di sodio trics glucosio e incubare la soluzione protetta dalla luce in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 48 ore. Verso la fine dell'incubazione, utilizzare un adesivo non liquido per applicare un adesivo sottile su due lati di un vetrino da microscopio in vetro per creare una camera, quindi miscelare una soluzione di fibrinogeno con fattore di temperatura ambiente 13 e trombina fino a un volume finale di 50 microlitri e trasferire immediatamente 30 microlitri della soluzione di fibrina nella camera del vetrino del microscopio. A questo punto, posizionare un vetrino coprioggetto da 22 x 22 millimetri con una punta di 15 millimetri di spessore sopra l'adesivo e sigillare i lati aperti della camera con adesivo trasparente, facendo attenzione che l'adesivo non interagisca con il coagulo.

Lasciare polimerizzare i coaguli di fibrina a una temperatura compresa tra 21 e 23 gradi Celsius per due ore. Quindi acquisisci immagini al microscopio confocale dei coaguli utilizzando un obiettivo 40x e un laser ad argon da 488 nanometri per valutare i coaguli di pazienti affetti da anemia falciforme. Per prima cosa, diluire il campione di globuli rossi a 1 milione di cellule per millilitro in terreno di coltura cellulare libero dal siero e mescolare le cellule con cinque microlitri della soluzione di marcatura cellulare appropriata mediante pipettaggio delicato.

Dopo 20 minuti a 37 gradi Celsius, lavare le cellule tre volte in un mezzo a 37 gradi Celsius mentre le cellule sono nella centrifuga, mescolare la soluzione di fibrinogeno appena preparata, il fattore 13 e la trombina, come appena dimostrato. Quindi trasferire 10 microlitri dei globuli rossi marcati nella soluzione di fibrina ed erogare immediatamente 30 microlitri della soluzione cellulare in una camera adesiva. Su un vetrino da microscopio, lasciare che la fibrina polimerizzi a 21-23 gradi Celsius dopo due ore, acquisire immagini confocali dei coaguli utilizzando laser di eccitazione con lunghezze d'onda di 488 nanometri e 633 nanometri per eccitare rispettivamente la fibrina marcata in fluorescenza e i globuli rossi.

Per valutare i tassi di fibrinolisi e le strutture dei coaguli glicati, preparare prima i coaguli glicati come appena dimostrato questa volta. Tuttavia, dopo aver erogato la soluzione di coagulo di fibrina nella camera adesiva, non sigillare le estremità della camera. Invece, lascia che i coaguli polimerizzino a 21-23 gradi Celsius in un involucro sigillato contenente 250 millilitri di acqua per prevenire la disidratazione.

Dopo un'ora e mezza, acquisire le immagini dei coaguli mediante microscopia confocale come appena dimostrato. Quindi pipettare 25 microlitri di plasmina nell'estremità aperta della camera e lasciare che la plasmina si disperda in tutto il coagulo per azione capillare. Infine, aprire le funzioni delle serie temporali del software del microscopio confocale, fare clic su Modalità di acquisizione e selezionare Serie temporali.

Quindi selezionare il numero di cicli e l'intervallo di tempo di registrazione per acquisire riprese video in tempo reale della lisi del coagulo indotta dalla plasmina L'analisi dei coaguli normali e glicati rivela che i coaguli glicati sono più densi con pori più piccoli rispetto ai coaguli normali, sia con che senza l'aggiunta del fattore 13 durante la polimerizzazione del coagulo. Infatti, nei coaguli glicati dell'ONU, c'è una concentrazione di fibrina inferiore, che crea una struttura meno densa rispetto a quella osservata nei coaguli glicati, che contengono una concentrazione di fibrina più elevata. I coaguli di fibrina dei pazienti affetti da anemia falciforme contengono globuli rossi e mostrano strutture più dense rispetto a quelli dei coaguli di fibrina sani a causa di un aumento della concentrazione di fibrinogeno in questi individui.

Inoltre, la tendenza naturale dei globuli rossi dei pazienti con anemia falciforme a formare aggregati e generi, grumi di globuli rossi che si intrecciano nella rete di fibrina, con conseguente formazione di strutture di coaguli aberranti che sono marcatamente diverse nella morfologia rispetto a quelle osservate nei pazienti normali. Infine, l'analisi dei tassi di fibrinolisi dei coaguli normali rispetto a quelli glicati dimostra una capacità significativamente compromessa dei coaguli diabetici simulati di assumere fibrina in assenza di sufficiente plasmina. Questa ricerca contribuirà a spianare la strada ai ricercatori nel campo della trombosi e dell'emostasi, in particolare per i pazienti che sviluppano patologie concomitanti a causa dell'anemia falciforme e del diabete.