Name: Real Time Analisi di profilo metabolico in Ex Vivo Culture del mouse intestinale Cripta organoide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Scopri l'analisi metabolica in tempo reale di organoidi di cripte intestinali murine ex vivo. Questo metodo utilizza l'analizzatore XF 24 per misurare il consumo di ossigeno e l'acidificazione extracellulare.

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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni RO1 CA 135561, R01 CA151494, R01 CA174432 e P3013330 dal National Institutes of Health. Vorremmo ringraziare Michele Houston, Elena Dhima e Dott.ssa Anna Velcich per i loro preziosi commenti nello sviluppo del protocollo di isolamento cripta. Ringraziamo anche la formazione del diabete e Centro di Ricerca del Albert Einstein College of Medicine sostenuto da NIH P60DK20541, e il dottor Michael Brownlee e il dottor Xue Liang-Du, che dirigono e operano la struttura Seahorse, rispettivamente.

Questo studio è stato eseguito in conformità con le raccomandazioni nella Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dalla commissione etica della sperimentazione animale del Albert Einstein College of Medicine. 1. Isolamento Cripta e Cultura <ol><li> Isolamento delle Cripte dal piccolo intestino: <ol><li> Isolare cripte intestinali da qualsiasi modello di topi di interesse. Eutanasia i topi con CO 2 seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Aprire l&#39;addome longitudinalmente e riempire il piccolo intestino (SI) con soluzione fisiologica fredda ghiaccio fosfato tamponata, PBS (-Ca 2+; -Mg 2+) con 2x antibiotico-antimicotico (anti-anti). Rapidamente isolare piccolo intestino. </li><li> Sezionare completamente privo di grasso mesenterico con un bisturi. Fare attenzione a non forare il tessuto - in ogni momento mantenere il tessuto umido con ghiaccio PBS freddo. Aprite inteStine longitudinalmente e lavare accuratamente con ghiaccio freddo PBS. </li><li> Tagliare piccolo intestino in due sezioni e appiattire con una punta di cotone bagnato, delicatamente raschiare il villi con una diapositiva pre-raffreddata. Lavare vigorosamente in PBS freddo più volte. </li><li> Incubare 3 minuti in 20 ml di PBS 1x per 3 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) /0.5 mM ditiotreitolo (DTT) per la dissociazione non enzimatica del tessuto. </li><li> Tagliare il tessuto in piccoli pezzi (2-4 mm) usando una lama di rasoio su un vetrino pre-raffreddato. Trasferire i pezzi in un tubo da 50 ml contenente 20 ml di PBS freddo ghiaccio. </li><li> Pipettare su e giù delicatamente 10x con un 10 ml sterile, pipetta monouso. Lasciate che frammenti di tessuto sedimentano per gravità. Rimuovere il surnatante con una pipetta. Ripetere altre tre volte; assicurarsi che il surnatante è chiaro. </li><li> Aggiungere 20 ml di PBS per 2 mM EDTA. Turbinio e incubare a 4 ° C per 30 minuti con dolce dondolio. </li><li> Lasciate sedimenti tessuti ed eliminare il surnatante. Aggiungere 15 ml di PBS freddo ghiaccio e pipettasu e giù 5x con una pipetta 10 ml. Lasciate che i frammenti di tessuto sedimenti e raccogliere il surnatante come Frazione 1 (F1). Ripetere la raccolta di F2-F5, ogni frazione mantenuto separatamente. </li><li> Aggiungere 15 ml di ghiaccio PBS freddo e questa volta agitare vigorosamente a mano per 15 secondi. Raccogliere F6 e ripetere per F7, F8. Se i pezzi di tessuto cominciano a galleggiare, toccare per aiutarli a stabilirsi. </li><li> Controllare un&#39;aliquota di ciascuna frazione al microscopio. In comune le frazioni contenenti cripte. </li><li> Passare le frazioni aggregati attraverso un filtro 70 micron cellule di nylon, raccogliendo cripte in un tubo da 50 ml. </li><li> Centrifugare a 100 xg per 5 minuti a 4 ° C, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di PBS freddo ghiaccio con 2x cripte anti-anti e trasferirli in una provetta da 15 ml. Ripetere il lavaggio ancora una volta. </li><li> Lavare le cripte una volta con 10 ml ghiacciata ADF, avanzata DMEM / F-12 (Dulbecco &quot;s Modified Eagle Medium / Ham&quot; s F-12) - 2x anti-anti. </li><li> Lavare le cripte una volta con 10 ml ADF - 1x anti-anti. </li><li> Contare le cripte con un emocitometro. Regolare il volume della soluzione cripta e trasferire in una provetta da 1,5 ml in modo che la concentrazione finale quando cripta risospeso sarà 100-500 cripte per 50 ml di miscela proteica gelatinosa (Matrigel). Centrifugare a 100 xg per 5 min a 4 ° C e risospendere cripte nella miscela proteica gelatinosa. </li><li> Tavola 50 ml di sospensione gelatinosa cripta - miscela proteica per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti (area di crescita: 2 cm 2), ponendo attenzione la goccia di sospensione al centro di ciascun pozzetto. Mantenere la piastra in una di CO 2, 37 ° C incubatore per ~ 30 minuti fino a quando la sospensione si solidifica. </li><li> Aggiungere 500 supporti freddo ghiaccio cultura completa ml (ottimo DMEM / F12 con 1x contro - contro, 10 mM 4- (2-idrossietil) -1 acid-piperazineethanesulfonic (HEPES), 1x Glutamax, 1x B27 supplemento, 1x N2 Supplement, 1 mM N-acetil-L-cisteina (NAC), 50 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF), 100 ng / mlZucca, 500 ng / ml R-spondina). <ol><li> Ricostituire fattori di crescita nello 0,1% albumina sierica bovina (BSA) in PBS. </li></ol></li></ol></li><li> Cripta organoide cultura e del passaggio: <ol><li> Passaggio organoidi cripta 14-21 giorni dopo la semina (o secondo necessità) come segue: <ol><li> Cambia i media ogni venerdì e lunedì. Il mercoledì, sostituire la metà della media con mezzi freschi. </li></ol></li><li> Rimuovere il terreno di coltura. Lavare il campione due volte con 500 microlitri di PBS a intervalli di 5 min. </li><li> Rimuovere PBS e rompere delicatamente la miscela proteica gelatinosa con un P1000 sterile punta micro pipetta. </li><li> Aggiungi terreni di coltura 1 ml completa di un singolo pozzo e risospendere le organoidi in 1 ml di media. </li><li> Interrompere delicatamente i organoidi con un P1000 pipettando su e giù 20-30x (controllare sotto il microscopio per una corretta dissociazione organoide con una buona resa cripta, fino a quando una tecnica consistente si sviluppa). </li><li> Trasferire le cripte in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml;centrifugare a 100 xg a 4 ° C, 5 min. </li><li> Lavare il pellet due volte con 1 ml di terreno di coltura completo. </li><li> Split a un rapporto di 1: 3 o 1: 6 come necessario, cripte risospeso in 50 microlitri Matrigel per pozzetto. Procedere come descritto in precedenza (sezione 1.1.16-18). </li></ol></li><li> Cripta di congelamento organoide: <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura. Lavare il campione in 500 l di PBS. </li><li> Disperdere la miscela proteica gelatinosa con una punta P1000 pipetta. </li><li> Aggiungere 1 ml di media per un singolo pozzo e risospendere le organoidi in 1 ml di media. </li><li> Rompere delicatamente le organoidi con un P1000 pipettando su e giù 20-30x. </li><li> Trasferire i organoidi in una provetta da 1,5 ml. Centrifugare a 100 xga 4 ° C, 5 min. </li><li> Lavare il pellet due volte con 1 ml di terreno di coltura completo. </li><li> Cripte risospendere in 500 microlitri di congelamento media. </li><li> Trasferimento cripte ad un cryotube, posizionare il tubo in un contenitore di congelamento e conservare in freezer -80 ° C overnight. </li><li> Trasferimento cripte di liquido N 2 serbatoio. <ol><li> Recuperare organoidi cripta congelati rapidamente scongelamento in un bagno a 37 ° C Acque. Lavare con 500 microlitri mezzi di coltura completo una volta, centrifugare a 100 xg, 5 min e risospendere in miscela proteica gelatinosa e cultura come descritto sopra. Per una migliore ripresa, aggiungere inibitore ROCK (Y-27632) per il supporto di congelamento. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Cripta organoide Metabolismo Assay <ol><li> 24-ben Preparazione del piatto: <ol><li> Isolare e contare cripte secondo il protocollo (vedere la sezione 1.1 per l&#39;isolamento cripta e la sezione 1.2 per il passaggio cripta). </li><li> Cripte Risospendere in miscela proteica gelatinosa (100-200 cripte per 20 ml). </li><li> Piastra cripta-gelatinosa sospensione miscela proteica in una piastra a 24 pozzetti test (assicurarsi che non vi siano almeno triplicato per ogni campione) e permettono la sospensione a solidificare a 37 ° C in CO 2incubatore; quindi aggiungere 500 microlitri Terreni di coltura completo. </li><li> Cripte cultura (come descritto nella sezione 1.1) e osservare al microscopio fino cripte crescere in organoidi completamente sviluppati. </li></ol></li><li> Extracellulare Flux saggio: <ol><li> Cartuccia Hydrate durante la notte in un non-CO 2 (0% CO 2), 37 ° C incubatore. </li><li> Rimuovere il terreno di coltura e lavare organoidi due volte con 500 microlitri DMEM (senza: glucosio, L-glutamina, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio, e con: rosso fenolo). Attendere 5 min. </li><li> Aggiungere 675 ml per medie dimensioni, ben dosaggio (DMEM con 2 mM L-glutammina e 5 mm D-glucosio) in ciascun pozzetto. </li><li> Controllare cripta organoidi morfologia microscopica per garantire che organoidi e miscela proteica gelatinosa sono intatti dopo i lavaggi. Incubare 1 ora in un non-CO 2, 37 ° C incubatore. </li><li> Preparare 10 mM composti iniettabili (oligomicina, cianuro di carbonile-p-trifluoro-metossi-fenil-idrazone (FCCP), rotenone) nel terreno di coltura. </li><li> Set-up della cartuccia caricando 75 ml di 10 micron composti iniettabili nei porti della sequenza della cartuccia: Port A - oligomicina; Port B - FCCP; e Port C - rotenone (Le concentrazioni finali durante il test sarà di 1 micron). </li><li> Incubare cartuccia 30 min - 1 ora a 37 ° C in un non-CO 2 incubatore. </li><li> Allo stesso tempo, attivare la XF Analyzer e creare il modello di protocollo del test. </li><li> Posizionare la cartuccia e la piastra di utilità in XF Analyzer ed eseguire &quot;calibrare&quot; cartuccia. </li><li> Controllare organoidi cripta al microscopio per assicurarsi che essi sono attaccati alla miscela proteica gelatinosa. </li><li> Cella di carico piastra di coltura nel protocollo dello strumento ed eseguire test. </li></ol></li></ol>

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<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
</ol>

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Abbiamo testato il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) delle cripte isolate da 8 mesi topi e cresciuti in organoidi ex vivo. Dopo la misurazione del tasso basale, il metabolismo cripta è stata valutata con l&#39;aggiunta di oligomicina, il cianuro di carbonile -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) e rotenone, in sequenza. Basale OCR e ECAR basale sono stati registrati 0-29 min (Figura 2A e 2B). A...

Cancro del colon-retto (CRC) è la terza causa di decessi per cancro correlati negli Stati Uniti. Cancro del colon sporadica - vale a dire che derivanti nel corso della vita (&gt; 50 anni di età) e senza fattori predisponenti genetici chiare - conti per ~ 80% di tutti i casi, con un&#39;incidenza fortemente influenzata da abitudini alimentari a lungo termine 1,2. Questi tumori presentano uno spostamento metabolico verso dipendenza glicolisi ossidativa, noto come effetto Warburg, che può in parte rendere concentrazioni elevate di particelle elementari cellulari e di energia disponibili (attraverso glutaminolysis) permettere e forse guidare alti tassi di proliferazione delle cellule tumorali 3-5 . Studi di tumore del colon e altri tumori gastrointestinali, inclusi piccoli tumori intestinali fornire informazioni importanti sulle cause della formazione di tumori. Indagare le differenze metaboliche tra gli stati normali, pro-tumorali e tumorali di sistemi di organi gastrointestinali possono aiutare detine di rischio relativo per lo sviluppo del tumore e la diagnosi precoce della neoplasia. Inoltre, la comprensione del metabolismo bioenergetico che coinvolge la respirazione mitocondriale e la glicolisi si forniscono informazioni fondamentali sul modo in cui la fisiologia delle cellule, l&#39;invecchiamento e la malattia lo stato perturba l&#39;omeostasi intestinale. L&#39;utilizzo della tecnologia bioenergetica test per l&#39;analisi del flusso extracellulare in grado di valutare i tassi di respirazione mitocondriale e glicolisi contemporaneamente in cellule in crescita in coltura in tempo reale 6,7. Fino a poco tempo, studi in vitro di tenue sono stati limitati a linee cellulari derivate da tumori benigni o maligni 8,9 e non rappresentano la fisiologia dei normali epiteli intestinali e l&#39;influenza del microambiente in cui risiedono. Nel 2009, Sato et al. 10 ha introdotto un sistema ex vivo della cultura a crescere tridimensionale (3D) del mouse intestinali organoidi epiteliali, o epithelial &quot;mini-coraggio&quot;, adatto a fini sperimentali, diagnostiche e terapeutiche indagini 10,11. Inoltre, cripte isolate da topi calorico limitati mantengono le loro proprietà di crescita alterati come organoidi in tali colture 12. Rispetto a linee cellulari trasformate, culture organoide cripta possono essere utilizzati per generare dati fisiologicamente rilevanti che presentano un modello molto meglio comprendere lo stato in vivo. Abbiamo adattato la tecnologia di analisi bioenergetica per saggiare il metabolismo energetico di organoidi cripta intestinale. Mouse organoidi cripta intestinale sono state coltivate ex vivo per lo sviluppo degli studi cripta metabolismo energetico organoide presentati. Il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) di organoidi cripta sono stati misurati in assenza e in presenza di due diversi inibitori metabolici (oligomicina, rotenone) e un vettore di ioni (Carbonil cianuro-p-trifluorometossifenil idrazone). L&#39;orga criptarisposta metabolica noid a questi composti chimici sono riflessi con successo attraverso la modifica ECAR e valori OCR. Studi bioenergetici cellulari potranno chiarire le reciproche interazioni tra stato metabolico e rischio di malattia e fenotipo nel cancro, obesità, diabete, malattie metaboliche e le malattie mitocondriali e contribuire a metodi di screening anticipo aventi implicazioni dirette per la medicina traslazionale. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare piccole cripte intestinali e alla cultura organoidi cripta. Inoltre, si introduce un nuovo metodo per usare le culture organoide cripta per le analisi metaboliche.

<table><tbody><tr><td>BD Matrigel Matrice di membrana basale, GFR, senza rosso fenolo, senza LDEV</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (soluzione salina tamponata con fosfato), senza magnesio, senza calcio, pH 7.2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Aquila modificata&prime; s Terreno senza glucosio, L-glutammina, rosso fenolo, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Sale sodico rosso fenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>Concentrazione finale 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic, 100x, 100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Concentrazione finale 1x o 2x</td></tr><tr><td>Penicilina-Streptomicina, liquid</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Concentrazione finale 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; GlutaMAX&commercio; integratore</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Concentrazione finale 1x</td></tr><tr><td>Gibco® HEPES (acido N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano solfonico), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Concentrazione finale 10 mM</td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteina, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>Concentrazione finale 1 mM</td></tr><tr><td>100x N-2 integratore, liquido</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Concentrazione finale 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&reg; integratore meno vitamina A, liquido</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Concentrazione finale 1x</td></tr><tr><td>R-spondina 1 di topo ricombinante, CF, 50 &mu; g</td><td>R& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Concentrazione finale 500 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF murino ricombinante, 100 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Concentrazione finale 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Noggin murino ricombinante, 20 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Concentrazione finale 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco® L-glutammina, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Concentrazione finale 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco® polvere di glucosio</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>Concentrazione finale 5 mM</td></tr><tr><td>Ambion&reg; 0,5 M EDTA (acido etilendiamminotetraacetico), pH 8,0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>Concentrazione finale 3 mM per step 1.1.5; 2 mM per step 1.1.8</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DTT (ditiotreitolo), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>Concentrazione finale 3 mM</td></tr><tr><td>Albumina da siero bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>0.1% in PBS</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1% in PBS</td></tr><tr><td>Recovery&trade; Congelamento di colture cellulari Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore di ROCK (Y-27632)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Concentrazione finale 10 &mu; M</td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>Concentrazione finale 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Cianuro di carbonile-p-trifluoro-metossi-fenil-idrazone (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Concentrazione finale 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Concentrazione finale 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Concentrazione finale 0,1 N in PBS</td></tr><tr><td>XF24 Extracellular Flux Analyzer (XF Analyzer)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real time analisi di profilo metabolico in ex vivo culture del mouse intestinale cripta organoide

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

La mucosa dell&#39;intestino tenue presenta un&#39;architettura ripetitiva organizzata in due strutture fondamentali: villi, sporgenti nel lume intestinale e composti da enterociti maturi, cellule caliciformi e cellule enteroendocrine; e cripte, che risiedono in prossimità del sottomucosa e muscolare, l&#39;ospitare staminali adulte e cellule progenitrici e cellule mature Paneth, così come stromali e cellule del sistema immunitario del microambiente cripta. Fino agli ultimi anni, studi in vitro di piccolo intestino era limitato a linee cellulari derivate da tumori benigni o maligni, e non rappresentano la fisiologia dei normali epiteli intestinali e l&#39;influenza del microambiente in cui risiedono. Qui, dimostriamo un metodo adattato da Sato et al. (2009) per la coltura di organoidi cripta del mouse intestinali primarie derivate da topi C57BL / 6. Inoltre, vi presentiamo l&#39;uso di colture organoide cripta di saggiare il profilo metabolico cripta in tempo reale per misurazione del consumo basale di ossigeno, glicolisi, la produzione di ATP e la capacità respiratoria. Organoidi mantengono proprietà definite per la loro origine e conservano gli aspetti del loro adattamento metabolico riflessa dal consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare. In tempo reale studi metabolici in questo organoide sistema di coltura cripta sono un potente strumento per studiare il metabolismo energetico organoide cripta, e come possono essere modulati da fattori nutrizionali e farmacologici.

Organoidi cripta sono state stabilite da 8 mesi C57BL / 6 topi nutriti purificato roditore dieta American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Organoidi cripta intestinali possono essere coltivate in coltura per lunghi periodi da un unico crypt (Figura 1A, singola freccia rossa). Organoidi crescono strutture cripta-come in 18-20 giorni in coltura (Figura 1B, frecce rosse). Cripte sono stati diversi passaggi ogni 3 settimane e organoidi recuperati in modo efficiente dopo ogni passaggio. ...

Piccoli organoidi cripta intestinali in coltura ex vivo fornire un sistema di coltura tessuto che racchiude in sintesi la crescita delle cripte dipendenti sulle cellule staminali e la loro nicchia. Abbiamo stabilito un metodo per dosare il profilo metabolico in tempo reale in organoidi cripta del mouse primario. Abbiamo trovato organoidi mantengono le proprietà fisiologiche definite dalla loro fonte.

Real Time Analisi di profilo metabolico in Ex Vivo Culture del mouse intestinale Cripta organoide

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Lo scopo di questa procedura è quello di saggiare in tempo reale il profilo metabolico di organoidi primari della cripta di topo. Ciò si ottiene raccogliendo prima l'intestino tenue del topo, seguito dall'isolamento delle cripte intestinali Andre piegato in matrigel. Il secondo passo è quello di coltivare le cripte fino a formare organoidi di cripta completamente cresciuti.Il passo successivo è la preparazione di un test su cartuccia per gli studi metabolici. Il passaggio finale consiste nel caricare la cartuccia e la piastra di servizio nell'analizzatore di flusso extracellulare XF 24 ed eseguire l'analisi del flusso extracellulare per misurare il tasso di consumo di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare degli organoidi K cripta. In definitiva, questa procedura consente lo studio del profilo metabolico di organoidi primari della cripta intestinale di topo in tempo reale.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'utilizzo della coltura cellulare per i saggi metabolici è che ci consente di valutare il metabolismo degli organi crittografici intestinali in tempo reale. Le colture di organoidi imitano lo stato immunitario in modo più accurato e questo aiuta a generare dati più rilevanti dal punto di vista fisiologico. La tecnica può essere estesa anche all'analisi di altre XI colture di organoidi 3D.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro, come la caratterizzazione dei cambiamenti metabolici nel Crips dell'intestino tenue durante la tumorgenesi, e nella ricerca sul diabete e sul metabolismo, come il confronto del metabolismo degli stati normali e patologici. Per iniziare questa procedura, aprire longitudinalmente l'addome di un topo soppresso. Riempi l'intestino tenue con PBS ghiacciato privo di calcio e magnesio e due antibiotici antimicotici.Quindi isolare rapidamente l'intestino tenue. Rimuovere il grasso mesenterico con un bisturi. Fare attenzione a non perforare il tessuto e mantenere il tessuto umido con PBS ghiacciato durante l'intera procedura.Aprire l'intestino e lavarlo accuratamente con PBS ghiacciato. Successivamente, taglia l'intestino tenue in due sezioni. Appiattiscili usando una punta di cotone bagnata.Quindi, raschiare delicatamente il VII utilizzando un vetrino preco. Lavare energicamente i fazzoletti in PBS ghiacciato più volte. Quindi incubarli in 20 millilitri di XPBS con tre millimolari EDTA e 0,5 millimolari DTT per tre minuti.Successivamente, tagliare i fazzoletti in pezzi da due a quattro millimetri su un vetrino preco. Con l'aiuto di una lametta, trasferite i pezzi in un tubo da 50 millilitri contenente 20 millilitri di PBS ghiacciato. Quindi pipettare delicatamente su e giù 10 volte utilizzando una pipetta sterile monouso da 10 millilitri.Dopo che i frammenti di tessuto si sono depositati per gravità, rimuovere il SUP natum con una pipetta. Ripeti la procedura altre tre volte e assicurati che il surnatante sia limpido. Ora, trasferire i pezzi di tessuto in una provetta da 50 millilitri contenente 20 millilitri di PBS con due millimolari EDTA SW e incubare la miscela a quattro gradi Celsius per 30 minuti con un leggero dondolio.Dopodiché, lascia che il tessuto si depositi e scarta la supinata. Aggiungere 15 millilitri di ghiaccio carbone PBS e tubi su e giù cinque volte. Lascia che i frammenti di tessuto si depositino e raccogli il supinato come frazione uno.Ripetere le procedure per raccogliere la frazione due alla frazione cinque e mantenere le frazioni separate. Successivamente, aggiungere 15 millilitri di ghiaccio chiamato PBS e agitare energicamente a mano per 15 secondi. Raccogli la frazione sei e ripeti le procedure per la frazione sette e la frazione otto.Se i pezzi di tessuto iniziano a galleggiare, picchiettare il tubo per aiutarli a depositarsi. Quindi ispezionare un'aliquota di ciascuna frazione per verificare la presenza di crips al microscopio. Questo è un esempio di frazione cattiva, e questo è un esempio di frazione buona.Metti insieme quelli che contengono Crips. Successivamente, passare le frazioni estratte attraverso un colino a celle di nylon da 70 micron e raccogliere i Crips in una provetta da 50 millilitri. Successivamente, centrifugare il campione a 100 volte G per cinque minuti, quattro gradi Celsius, scartare il supinato e risospendere il PT in 10 millilitri di PBS ghiacciato con due antibiotici antimicotici.Quindi trasferire i Crips in un tubo da 15 millilitri e ripetere il lavaggio ancora una volta. Successivamente, lavare le cripte una volta con 10 millilitri di ghiaccio freddo, un DF avanzato D-M-E-M-F 12 contenente due antibiotici antimicotici. Successivamente lavare le cripte una volta con 10 millilitri di un FD contenente un antibiotico antimicotico.Successivamente, conta le cripte usando un emocitometro. Regolare il volume della soluzione della cripta e trasferirlo in una provetta da 1,5 millilitri in modo che la concentrazione finale della cripta quando viene risospesa sia compresa tra 100 e 200 cripte per 20 microlitri di miscela di proteine gelatinose. Quindi, centrifugare la soluzione della cripta a 100 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Rimuovere la Senna e risospendere le cripte nella miscela proteica gelatinosa. Successivamente, piastra 20 microlitri della sospensione della miscela proteica gelatinosa della cripta per pozzetto in una piastra di utilità da 24 pozzetti. Tenere la piastra in un incubatore a CO2 a 37 gradi Celsius per 30 minuti fino a quando la sospensione non si solidifica.Quindi aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura completo e ghiacciato a ciascun pozzetto e coltivare i Crips fino a quando non crescono in organoidi completamente sviluppati In questa procedura, idratare la cartuccia per una notte in un incubatore senza anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Quindi rimuovere il terreno di coltura e lavare due volte gli organoidi con 500 microlitri di DMEM. Dopo cinque minuti, aggiungere 675 microlitri di terreno di prova a ciascuno.Bene, allora controllate la morfologia microscopica degli organoidi della cripta per incubarli in un incubatore senza anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un'ora. Successivamente, preparare 10 composti iniettabili micromolari nel terreno di analisi. Impostare la cartuccia caricando in sequenza 75 microlitri di composti iniettabili da 10 micromolari nelle porte della cartuccia.Quindi, incubare la cartuccia per 30 minuti a un'ora in un incubatore senza anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Contemporaneamente, accendere l'analizzatore XF e creare il modello del protocollo di analisi. Posizionare la cartuccia e la piastra di servizio nell'analizzatore XF ed eseguire la calibrazione della cartuccia Successivamente, caricare la piastra di coltura cellulare nello strumento ed eseguire il test.Il protocollo mostrato qui sono gli organoidi della cripta derivati da un topo nero di otto mesi C 57 in due giorni o 18 giorni. Cultura. Questa figura mostra il test metabolico utilizzando organoidi derivati da topi neri di otto mesi di età C 57 in cui sono presentati il tasso di consumo di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare. Le cripte sono indicate in rosso e il controllo è indicato in blu.I reagenti precaricati nella cartuccia sono stati iniettati in sequenza come oligomicina, B-F-C-C-P e C rotenone. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del cancro e del metabolismo per esplorare i cambiamenti metabolici negli organoidi della cripta derivati da pazienti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare la cripta intestinale, il metabolismo degli organoidi in tempo reale.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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