Che caratterizza la composizione molecolare di motori su Moving assonale Cargo Utilizzo dell'analisi "Cargo Mapping"

L'obiettivo generale della mappatura del carico è quello di determinare la quantità relativa e il tipo di proteine motrici molecolari che si associano e muovono i carichi vescicolari e di correlare questa composizione dei motori con una direzionalità del movimento del carico vivo. Ciò si ottiene facendo crescere prima i neuroni primari dell'ippocampo di topo in dispositivi microfluidici in modo che gli assoni crescano relativamente dritti e registrando il movimento intracellulare in tempo reale delle proteine cargo marcate in fluorescenza negli assoni dei neuroni trasfettati transitoriamente. Il secondo passo consiste nel fissare i neuroni durante il corso dell'imaging del carico vivo e successivamente colorare gli assoni con anticorpi contro le proteine motorie molecolari come la chinesina e i dines, seguiti dall'imaging al microscopio a immunofluorescenza.

Successivamente, le immagini del carico fisso e del motore vengono allineate ai grafici del movimento del carico nel tempo, chiamati anche kraft, al fine di correlare il movimento del carico vivo con i motori associati colorati, come determinato dalla colorazione immunofluorescente. Il passo finale consiste nel determinare le posizioni dei subpixel delle proteine cargo e motorie utilizzando un pacchetto software MATLAB sviluppato su misura chiamato colocalizzazione motoria. Questo software fornisce le coordinate XY precise di ogni carico e posizione del motore, nonché la quantità relativa di intensità di fluorescenza associate a carichi e motori.

In definitiva, la correlazione della microscopia a fluorescenza di carichi e motori sotto tensione e fissi a livello di risoluzione inferiore ai pixel fornisce informazioni sui tipi di motori associati a carichi specifici per i quali è nota la direzionalità del movimento. Quindi questo metodo fornisce informazioni sul meccanismo del trasporto dell'esone. Può essere applicato ad altri studi che correlano la microscopia vitale con la colorazione immunofluorescente, come l'associazione di proteine ai microtubali durante la dinamica delle microt tube o il reclutamento di proteine durante l'endocitosi.

La dimostrazione visiva di questo metodo aiuterà a eseguire le fasi di fissazione e analisi dell'imaging, che altrimenti potrebbero essere difficili da apprendere in quanto richiedono una configurazione specializzata. I neuroni primari dell'ippocampo di topo per questa procedura vengono preparati come indicato nel testo del protocollo e risospesi nella crescita neurobasale dell'uovo. Terreno per placcare i neuroni nel dispositivo microfluidico.

Rimuovere il mezzo dal serbatoio microfluidico uno e uno prime. Applicare 20 microlitri di cellule su quello del serbatoio microfluidico e lasciarle fluire. Posizionare il dispositivo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 per 20 minuti.

Guarda al microscopio per assicurarti che le cellule abbiano aderito al vetro coperto. Aggiungi neuro basale, un mezzo di crescita per completare tutti i serbatoi. Restituire il dispositivo con le cellule all'incubatrice entro il nono giorno.

In coltura, i neuroni estendono gli assoni attraverso i micro canali e sono pronti per la trasfezione per l'espressione di proteine fluorescenti. L'imaging dal vivo dei neuroni primari dell'ippocampo di topo trasfettato viene eseguito su un microscopio ottico a epifluorescenza invertita, dotato di un'incubatrice a 37 gradi Celsius e di una camera di controllo a CO2. Per iniziare questa procedura, selezionare l'obiettivo 100 x olio.

Applicare olio sull'obiettivo e montare il vetrino coprioggetti con i neuroni dell'ippocampo cresciuti in un dispositivo microfluidico sul tavolino del microscopio. Per evitare la morte neuronale, lavorare rapidamente per mantenere i campioni al microscopio per non più di un'ora. Trova gli assoni delle cellule trasfettate che si estendono attraverso i canali della camera microfluidica.

Registrare il numero dei canali in cui è stato trovato l'assone trasfettato. Conta il numero di canali utilizzando un contatore di conteggio manuale per una registrazione ottimale del movimento in tempo reale e la successiva analisi di colocalizzazione. Scegliere assoni che crescano relativamente piatti attraverso i canali in modo che l'imaging della maggior parte delle vescicole possa essere eseguito a fuoco.

Per facilitare il successivo allineamento di immagini fisse con traiettorie di movimento su innesto chm. Allineare il bordo destro dei microcanali con il campo visivo durante l'imaging. Al fine di fissare con successo le cellule durante l'imaging dal vivo, la procedura viene eseguita al meglio con due persone, una persona per aggiungere il fissativo e un'altra persona per regolare la messa a fuoco.

È anche importante avere tutti i reagenti pronti e a portata di mano. Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica da un millilitro. Rimuovere la maggior parte del fluido dai serbatoi due e due Prime Start imaging del movimento del carico in tempo reale con specifiche time lapse specifiche per la dinamica di trasporto del carico da analizzare.

Dopo aver raccolto un numero sufficiente di dati sul movimento in tempo reale, chiedere a una persona di riempire i serbatoi due e due con il fissativo di preriscaldamento. Evitare di toccare il dispositivo microfluidico in quanto ciò interromperebbe la messa a fuoco dell'imaging dal vivo. Chiedi all'altra persona di regolare la messa a fuoco mentre viene aggiunto il fissativo.

Allo stesso modo, riempire uno e uno dei serbatoi con la fissazione fissativa ha successo quando si osserva l'immediata cessazione del movimento. Successivamente, i neuroni fissati vengono colorati con anticorpi contro le proteine motorie endogene e sottoposti a imaging come descritto nel testo del protocollo. Per iniziare la mappatura del carico, genera un cromografo del movimento del carico utilizzando un software di analisi delle immagini.

Il plug-in Image J sviluppato da Rich Dorf Insights è consigliato per generare Kraft utilizzando software di grafica disponibili in commercio: allineare manualmente l'immagine di immunofluorescenza del carico al grafico CHM del movimento del carico, sovrapporre i punti di carico alla posizione delle traiettorie nel grafico CHM nel punto di fissazione in modo tale che ogni punto di carico corrisponda a una traiettoria specifica sul grafico CHM. Per ottenere risultati ottimali nell'allineamento, utilizzare la sezione Z che è più a fuoco per il carico mappato. È possibile utilizzare diverse sezioni Z per ogni immagine nella pila Z.

Determina le coordinate XY e le ampiezze di intensità per ogni punto fluorescente utilizzando un algoritmo consolidato per adattare le gaussiane 2D alla funzione di diffusione dei punti che rappresenta le sorgenti puntiformi in ciascuno dei tre canali. Per ottenere le coordinate XY, è stato sviluppato un pacchetto software MATLAB personalizzato chiamato colocalizzazione del motore, che incorpora un algoritmo di adattamento gaussiano sviluppato da Yakima DONA e colleghi per ciascuno dei singoli punti di carico che sono stati mappati sulle traiettorie mobili o stazionarie. Sul grafico Kog, selezionare le coordinate XY e le ampiezze di intensità dai risultati del programma di colocalizzazione motoria.

Usa diverse immagini di Zack per mappare più carichi che si trovano su diversi piani focali. Confrontare le singole coordinate XY per il carico mappato con quelle ottenute per ciascuno dei canali del motore nella sezione Z corrispondente. Determinare e selezionare le coordinate del motore XY che si trovano entro un raggio di 300 nanometri dal carico per i carichi e i motori che hanno segnalato all'interno dello stesso piano focale.

Utilizzare il pacchetto software di colocalizzazione del motore per determinare i puncta che si trovano entro il raggio di 300 nanometri. La mappatura del carico è stata utilizzata per correlare il trasporto di vescicole che trasportano la proteina prionica normale marcata con la proteina fluorescente gialla o Y-F-P-P-R-P-C con le quantità relative di chinesina e motori dine negli assoni. Questo grafico mostra il movimento della vescicola F-P-P-R-P-C e la linea tratteggiata indica il tempo di fissazione durante l'imaging dal vivo.

Le immagini a fluorescenza delle vescicole Y-F-P-P-R-P-C fissate e le corrispondenti immagini di immunofluorescenza della catena leggera Kinesin 1 e dine sono allineate al cromografo. Questo ingrandimento mostra i segnali immunofluorescenti di ciascuno dei tre canali con assegnazioni di funzioni gian 2D. Questo grafico rappresenta la quantificazione della COLOCALIZZAZIONE tra le vescicole Y-F-P-P-R-P-C, la catena leggera della chinesina uno e la dine nei neuroni wild-type e nei neuroni privi della catena pesante della cinesina.

La quantità relativa di catene leggere Kinesin one e dine associate alle vescicole Y-F-P-P-R-P-C è ottenuta dalle ampiezze gaussiane e tracciata per esaminare le possibili correlazioni tra le quantità motorie relative e la direzionalità del movimento. Questo esempio di neuroni wildtype indica che le vescicole Y-F-P-P-R-P-C, che sono in movimento o stazionarie, si associano con la catena leggera KINESIN uno o dine o entrambi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro tre giorni. Oltre a circa 10 giorni di preparazione all'imaging pre-EM dei dispositivi micro fillic e del neurone primario, entro tre giorni sarai in grado di eseguire l'imaging dal vivo della colorazione in immunofluorescenza e dell'analisi dei dati.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come registrare il movimento in tempo reale di carichi e neuroni marcati in fluorescenza che sono stati cresciuti in dispositivi microfluidici. Come fissare le cellule C durante l'imaging, come analizzare la colocalizzazione come risoluzione sub pixel e come correlare la colocalizzazione di un carico e delle proteine motrici molecolari con il movimento del carico.