Name: Le iniezioni per via endovenosa nel topo neonatale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: Impara a eseguire iniezioni endovenose non invasive in topi neonati di uno-due giorni per studiare malattie pediatriche. Questo metodo consente la somministrazione accurata di farmaci e migliora la ricerca sulle terapie neonatali.

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Gli autori desiderano ringraziare il NINDS, FightSMA, e le famiglie di SMA per il sostegno finanziario. SEGL è supportato da una formazione NINDS concessione # 5T32NS077984-02.

Tutte le procedure elencate nel protocollo sono stati approvati Istituto per uso animale e del comitato Care (IACUC), della Ohio State University. 1. Preparazione del lavoro <ol><li> Raccogliere ghiaccio, per anestetizzare i cuccioli di topo, una gabbia vuota per separare diga dalla lettiera, un microscopio da dissezione, una fonte di luce che può essere posizionato in un angolo per l&#39;iniezione (uso di una sorgente di luce a 90 ° &#160; angolo rispetto al sito di iniezione oscura la vena), una superficie pulita per posizionare l&#39;animale per l&#39;iniezione, tamponi di cotone, 3/10 cc siringa da insulina con 3/8 &quot;30 ago G (uno per animale) e l&#39;1% Evans Blu Dye ( fatta con) una soluzione tampone fosfato salino (PBS) per la formazione. </li><li> Rimuovere la diga di una gabbia separata, mentre la manipolazione dei cuccioli. </li></ol> Procedura 2. Iniezione <ol><li> Posizionare un cucciolo direttamente sul ghiaccio umido per 30-60 secondi per anestetizzare l&#39;animale. Non lasciare tegli animali sul ghiaccio troppo a lungo a causa di un rischio di complicanze legate ipotermia, tra cui la fibrillazione ventricolare, ipossia tissutale e acidosi metabolica. NOTA: La nostra esperienza è che 30-60 secondi è sufficiente a rallentare i movimenti cucciolo per consentire l&#39;iniezione. Se è necessaria l&#39;anestesia profonda, inalanti, come 1-2% isoflurano può essere opportuno. </li><li> Mentre l&#39;animale è sul ghiaccio, caricare la siringa con 30 ml di Evans colorante blu. </li><li> Quando l&#39;animale è completamente anestetizzato, confermata dalla mancanza di movimento sul ghiaccio mentre ancora respirando, spostarlo al microscopio. Per un&#39;iniezione mano destra, di fronte il muso dell&#39;animale a destra. Posizionare il dito indice sinistro sul muso e la caudale dito medio sinistro per il cuscinetto auricolare in modo che il cuscinetto auricolare è tra l&#39;indice e il medio (Figura 1). </li><li> Esaminare solo anteriore per il cuscinetto auricolare per una capillare superficiale che si muove quando la pelle viene manipolato. Questa capillare non è l&#39;obiettivo, maidentificazione è importante per l&#39;identificazione della vena temporale. Quindi, individuare un buio, vena ombra inferiore alla capillare che rimane fissa a prescindere dalla posizione della pelle. La vena temporale appare in ombra, corre dorsale a ventrale, e alimenta la vena giugulare (Figura 1). </li><li> Inserisci la vena temporale con l&#39;ago smusso up. Se inserita correttamente, è possibile visualizzare le bisello dell&#39;ago riempiono di sangue attraverso la pelle. Quindi premere il pistone lentamente e nota pallore della vena lungo il lato del viso. </li><li> Lasciare l&#39;ago di rimanere all&#39;interno della vena per l&#39;aggiunta di un 10-15 secondi per impedire il riflusso del injectant. </li></ol> 3. Post-iniezione <ol><li> Dopo un&#39;iniezione adeguata, il cucciolo dovrebbe diventare blu quasi immediatamente. Rimuovere l&#39;ago e usare la forza gentile per applicare un tampone di cotone sul sito di iniezione fino a quando i coaguli di sangue. </li><li> Monitorare il cucciolo per segni di sofferenza. Lasciare il cucciolo 2-3 minuti per recuperare e riscaldare, recognize quando il cucciolo è cosciente, in posizione verticale e in movimento, prima di tornare in gabbia. Coppa dei cuccioli nelle mani guantate del ricercatore di fornire calore appropriato per aiutare nel recupero, se necessario. In alternativa, inserire una piastra elettrica sotto la gabbia a casa per facilitare il riscaldamento il cucciolo iniettato. In genere dopo l&#39;iniezione colorante blu Evans, eutanasia cuccioli. Non includere colorante quando si inietta materiale di prova. </li><li> Posizionare il cucciolo nella gabbia casa e garantire il cucciolo è rivestito con biancheria da letto e / o nestlet per garantire il reinserimento dalla diga. </li><li> Utilizzare una nuova siringa e un batuffolo di cotone per ogni cucciolo di mantenere la sterilità. </li></ol>

<ol><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nature. 27, 59-65 (2009).</li>
<li>Dominguez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+scAAV9+delivery+of+a+codon-optimized+SMN1+sequence+rescues+SMA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice.</a> Human molecular genetics. 20, 681-693 (2011).</li>
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<li>Forsythe, E., Beales, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bardet-Biedl+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+human+genetics%22%5BJournal%5D)">Bardet-Biedl syndrome.</a> European journal of human genetics. 21, 8-13 (2013).</li>
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<li>Saunders, N. R., Joakim Ek, C., Dziegielewska, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neonatal+blood-brain+barrier+is+functionally+effective%2C+and+immaturity+does+not+explain+differential+targeting+of+AAV9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">The neonatal blood-brain barrier is functionally effective, and immaturity does not explain differential targeting of AAV9.</a> Nature biotechnology. 27, 804-805 (2009).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+AAV9-mediated+suppression+of+mutant+SOD1+slows+disease+progression+and+extends+survival+in+models+of+inherited+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS.</a> Mol Ther. 21, 2148-2159 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Consegna intravascolare di agenti al sistema nervoso centrale o in tutto il corpo è difficile in modelli murini di malattie neonatali. Il protocollo descritto è un modo rapido, relativamente non invasivo per somministrare per via endovenosa di soluzioni in topi neonati con requisiti di equipaggiamento minimo. Sebbene faccia temporale vena può essere visto ad occhio nudo, iniezioni possono avere una maggiore precisione con l&#39;uso del microscopio e sorgente di luce a fibre ottiche, in particolare per un iniettore inesp...

Consegna di terapie del sistema nervoso centrale (SNC) in modelli murini di malattia pediatrica rimane una sfida. I topi che modello patologie neonatali sono sottodimensionati e in maniera immatura, e quindi può essere difficile da iniettare direttamente in strutture adeguate all&#39;interno del sistema nervoso centrale. Iniezione intravascolare di agenti terapeutici è un non-invasiva, metodo ben tollerato per fornire cellule, droghe, o vettori virali per tutto il corpo, compreso il sistema nervoso centrale e della retina 1-5 3,5-9. Pubblicazioni precedenti descrivono temporale iniezione faccia vena utilizzando un transilluminatore 10,11, senza un microscopio dissezione 11,12, o che richiedono due individui a iniettare 10. La tecnica di iniezione descritto in questo protocollo è vantaggioso perché un singolo individuo può iniettare cuccioli, e la sorgente di luce per visualizzare la vena temporale non tocca il cucciolo, eliminando la necessità di nastro chirurgico o l&#39;attacco di un cucciolo di una superficie fissacome un transilluminatore 11. Consegna di adeno-associato vettore virale sierotipo 9 (AAV9) nei topi produce robusta espressione nei neuroni e astrociti in tutto il cervello e il midollo spinale (Figura 1). Consegna intravascolare di vettori virali nella superficiale vena facciale temporale è stato utilizzato in modo affidabile in vari studi in topi neonati per trattare il disturbo neuromuscolare pediatrica Atrofia Muscolare Spinale (SMA) 2,4,13,14 e, infine, ha aumentato la durata della vita dei topi trattati. Iniezione intravascolare di topi neonati anche gli obiettivi in modo efficace il sistema nervoso periferico e organi periferici (Figura 2). Dopo l&#39;iniezione di AAV, trasduzione dei gangli spinali, fegato, cuore, muscolo scheletrico, del polmone e del plesso mioenterico dell&#39;intestino è stato osservato 1,3,6,7,15. Trasduzione diffusa del SNC e della periferia rende questo metodo di iniezione ideale per le malattie che richiedono espressione globaleun transgene, come la malattia di 16 e di altre malattie da accumulo lisosomiale di Gaucher 17,18, la malattia di Batten e relativi lipofuscinoses ceroid neuronali, 19 e la sindrome di Bardet-Biedl, una malattia multisistemica genetico con insorgenza dei sintomi che si verificano nella prima infanzia 20. Iniezione intravascolare in topi neonatale dovrebbe essere considerato come un nuovo metodo di malattie pediatriche modellazione a livello di sistema. Questa tecnica è stato tradotto in modelli animali di maggiori dimensioni 5,21 e l&#39;iniezione intravascolare esiste già come un metodo clinicamente accettabile di fornire terapie. L&#39;attuale protocollo descrive un metodo semplice e efficace di diffondere agenti a topi neonati attraverso il volto superficiale vena temporale entro e non oltre postnatale giorno 2. iniezione può essere completato da un singolo, praticata individuale ed è ben tollerato sia dai cuccioli e le dighe. Pups sperimentano disagio minimo e recuperare rapidamente. ImportanTLY, iniezione di successo si tradurrà nella consegna globale dell&#39;agente somministrato. Questo protocollo è appropriato per la consegna di vettori virali, agenti farmaceutici o cellule di topi appena nati.

<table><tbody><tr><td>Siringa da insulina Thinpro</td><td>Terumo</td><td>SS30M3009</td><td>3/10 cc, ago da 3/8", 30 G, 1 per topo</td></tr><tr><td>Colorante blu Evans</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td>Diluire all'1% con 1x Applicatori in cotone salino tamponato con fosfato</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa in fibra ottica</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-562-36</td><td></td></tr><tr><td>Dissezione microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

le iniezioni per via endovenosa nel topo neonatale

Intravenous Injections in Neonatal Mice

L&#39;iniezione endovenosa è un modo clinicamente applicabile per fornire terapie. Per i roditori adulti e animali più grandi, iniezioni endovenose sono tecnicamente fattibili e di routine. Tuttavia, alcuni modelli di mouse possono avere insorgenza precoce della malattia, con una progressione rapida che rende la somministrazione di potenziali terapie difficile. La vena temporale (o facciale) è appena anteriore alla auricolare nei topi ed è chiaramente visibile per i primi due giorni dopo la nascita su entrambi i lati della testa utilizzando un microscopio da dissezione. In questa finestra, la vena temporale può essere iniettato con volumi fino a 50 microlitri. L&#39;iniezione è sicuro e ben tollerato sia dai cuccioli e le dighe. Una tipica procedura di iniezione è completata entro 1-2 minuti, dopo di che il cucciolo viene restituito alla gabbia a casa. Con il terzo giorno dopo la nascita la vena è difficile da visualizzare e la procedura di iniezione diventa tecnicamente inaffidabile. Questa tecnica è stata utilizzata per la consegna del virus adeno-associato (AAV) vectRUP, che a loro volta possono fornire, espressione del transgene stabile quasi scala corpo per la vita dell&#39;animale a seconda del sierotipo virale prescelto.

Durante una iniezione corretta, la vena deve momentaneamente girare chiaro, o sbollentare. Se l'iniezione di tingere l'intero cucciolo dovrebbe diventare blu in pochi secondi. Se si è verificato un iniezione improprio, vi è spesso un bolo sottocutaneo concentrato nella testa o al collo e injectant può fuoriuscire dal sito di iniezione. Iniezioni scorrette possono anche provocare la comparsa di lividi intorno alla gola. Cuccioli che ricevono iniezioni sottocutanee (cioè l'iniezione non è stato completamente cons...

Modelli animali di malattia pediatrica possono sperimentare insorgenza precoce e la progressione della malattia aggressiva. Erogazione di una terapia clinicamente rilevanti per modelli giovani del mouse può essere tecnicamente difficile. Questo protocollo descrive un metodo di iniezione endovenosa non invasivo per topi neonati entro i primi due giorni di vita postnatale.

Le iniezioni per via endovenosa nel topo neonatale

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di somministrare per via endovenosa un articolo di prova a un topo neonato. Ciò si ottiene identificando prima i topi di uno o due giorni da trattare. Il secondo passo è preparare i materiali di iniezione.Successivamente, viene eseguita l'iniezione. Il passo finale è quello di restituire i topi trattati e svegli alla madre. In definitiva, è necessario un test a valle per determinare se l'articolo di prova ha l'effetto desiderato.In generale, le persone che non conoscono questo metodo hanno maggiori difficoltà a identificare e mirare alla vena appropriata. Per iniziare, raccogli tutta l'attrezzatura necessaria per la procedura di iniezione. Inoltre, preparare il colorante blu Evans all'1% in PBS e una siringa da insulina con un ago da 30 gauge per animale da iniettare.Quindi, rimuovi la madre in una gabbia separata mentre manipoli i cuccioli. Quando è pronto. Metti un singolo cucciolo direttamente sul ghiaccio bagnato per 30-60 secondi.Anestetizzare. Non lasciare l'animale sul ghiaccio troppo a lungo a causa del rischio di complicazioni legate all'ipotermia mentre l'animale è sul ghiaccio. Siringa Lotus con 30 microlitri di colorante blu di Evan.Quando l'animale è completamente anestetizzato, confermato dalla mancanza di movimento sul ghiaccio mentre respira ancora, spostalo al microscopio per un'iniezione con la mano destra, posiziona il muso dell'animale nel posto giusto. L'indice sinistro sul muso e il medio sinistro si sono avvicinati all'auricolare in modo che l'auricolare si trovi tra l'indice e il medio. Esamina appena anteriormente all'auricolare per un capillare superficiale che si muove quando la pelle viene manipolata.Questo capillare non è l'obiettivo. Tuttavia, l'identificazione è importante per l'identificazione della vena temporale. Successivamente, individuare una vena scura e ombreggiata inferiore al capillare che rimane fissa indipendentemente dalla posizione della pelle.La vena temporale appare ombrosa, corre da dorsale a ventrale e alimenta la vena giugulare. Entrare nella vena temporale con l'ago smussato verso l'alto. Se inserito correttamente.È possibile visualizzare il riempimento dello smusso dell'ago con sangue attraverso la pelle. Quindi premere lentamente lo stantuffo e notare lo sbiancamento della vena lungo il lato del viso. Lasciare che l'ago rimanga all'interno della vena per altri 10-15 secondi per evitare il riflusso dell'iniezione.Dopo un'iniezione adeguata, il cucciolo dovrebbe diventare blu. Quasi immediatamente. Rimuovere l'ago e applicare con una forza delicata un batuffolo di cotone sul sito di iniezione fino a quando il sangue non si coagula.Lascia che il cucciolo si riprenda e si riscaldi due o tre minuti. Conferma che il cucciolo sia cosciente, eretto e in movimento. Prima di tornare nella gabbia, i cuccioli possono essere messi a coppa nelle mani guantate dell'investigatore per fornire un calore adeguato per favorire il recupero.In alternativa, posiziona un termoforo sotto la gabbia di casa per facilitare il riscaldamento del cucciolo iniettato. Rimetti il cucciolo nella gabbia di casa e coprilo con la lettiera. Per garantire l'accettazione da parte della madre, utilizzare una nuova siringa e un batuffolo di cotone per ogni cucciolo per mantenere la sterilità dopo l'iniezione endovenosa nel neonato di un transgene GFP A V nove Inod L'espressione è osservata in tutto il cervello, compreso lo striato anteriore, così come il ponte e il cervelletto.L'espressione di GFP è rilevata anche nel midollo spinale e si osserva sia nei motoneuroni spinali che nei neuroni dei gangli della radice dorsale. L'immunofluorescenza della GFP è rilevabile nel topo adulto, nel cuore e nel fegato dopo l'iniezione endovenosa neonatale di GFP autocomplementare A, A, V. nove. In confronto, l'espressione di GFP è assente nel cuore e nel fegato dei topi non iniettati una volta padroneggiati.Questa tecnica dovrebbe richiedere dai tre ai cinque minuti per animale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire iniezioni endovenose nei topi neonati.

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Questo articolo viene illustrato due metodi molto diversi di iniezione: 1) nel cervello (intracerebroventricolare) e 2) sistemica (endovenosa) per introdurre gli agenti terapeutici nel sistema nervoso centrale di topi neonati.

Consegna di agenti terapeutici attraverso intracerebroventricolare (ICV) e per via endovenosa (ev) nei topi

Fonte: Seman, B. G., et al. Un modello di imaging neonatale della sepsi batterica Gram-negativa. J. Vis. Esp. (2020)Il video mostra un modello neonatale di topo per studiare l'infezione sistemica utilizzando batteri bioluminescenti incapsulati. I cuccioli neonatali vengono iniettati con sospensioni batteriche ad alto o basso dosaggio e restituiti alla madre per le cure postnatali. I batteri incapsulati sfuggono alla rilevazione immunitaria precoce, si diffondono sistemicamente e vengono...

Modellazione dell'infezione nei topi neonatali utilizzando batteri bioluminescenti incapsulati

Questo video dimostra il processo di iniezione intracerebroventricolare per studiare la distribuzione del citomegalovirus murino (MCMV) nel cervello del topo neonatale. L'MCMV, progettato per esprimere una proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) per la visibilità, viene iniettato nel ventricolo laterale del cervello di un cucciolo di topo. Il virus iniettato circola attraverso il liquido cerebrospinale, infettando le cellule della regione periventricolare, compresa la zona marginale, il...

Un'iniezione intracerebroventricolare per analizzare la distribuzione del citomegalovirus murino nel cervello di un topo neonatale

Citomegalovirus (HCMV), l'infezione umana di neonati rappresenta una importante causa di ritardo mentale, ma gli eventi molecolari che portano alla indotta da virus patogenesi sono ancora poco conosciuti. Per indagare le dinamiche di infezione del cervello, abbiamo adattato...

Uso di<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging per monitorare la progressione della Sperimentale mouse infezione da citomegalovirus nei neonati

Qui dimostriamo una tecnica per la trasduzione neuronale diffusa mediante iniezione intraventricolare di virus adeno-associato nel cervello del topo neonatale.  Questo metodo fornisce un modo rapido e semplice per ottenere l'espressione permanente dei transgeni veicolati viralmente.

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

Qui, descriviamo un semplice metodo di iniezione intracerebroventricolare e intravascolare di particelle virali o microsfere fluorescenti nel cervello del topo neonatale. Il modello di localizzazione del virus e delle nanoparticelle potrebbe essere rilevato mediante valutazione microscopica o ibridazione in situ.

Intracerebroventricular e intravascolare Iniezione di Viral particelle e fluorescenti microperle nel cervello neonatale

Descriviamo un protocollo per l'esecuzione di un trapianto in utero (IUT) attraverso vie endovenosa e intra-amniotic di iniezione nel modello murino. Questo protocollo consente di introdurre cellule, vettori virali e altre sostanze nell'unico ambiente fetale immunitario-tollerante.

Endovenosa e Intra-amniotic nell'Utero trapianto nel modello murino

Qui viene descritto un approccio semplice e rapido per l'esecuzione di iniezioni intracerebroventricolari nei topi utilizzando un approccio a mano libera (cioè senza un dispositivo stereotassico).

Iniezioni intracerebroventricolari a mano libera nei topi

Questo protocollo mira a dimostrare una via di somministrazione venosa riproducibile che può essere utilizzata nei ratti e nei topi per tutto il periodo neonatale. Questa procedura è importante per gli studi preclinici sui roditori che desiderano rispecchiare la somministrazione di farmaci nelle unità di cura neonatale utilizzando principalmente la somministrazione endovenosa.

Un modello di roditore neonatale di iniezione venosa retroorbitaria

Il presente protocollo delinea le istruzioni passo-passo per l'esecuzione di iniezioni intratecali nei topi neonatali per l'editing genetico e la somministrazione di farmaci.

Iniezione intratecale di topo neonato per l'editing del genoma e la somministrazione di farmaci

Questo protocollo dimostra l'iniezione temporale nelle vene per la somministrazione endovenosa di cellule tumorali pediatriche ai topi neonatali, consentendo una modellazione precisa e riproducibile delle risposte immunitarie precoce contro il cancro. Il metodo consente di valutare l'impatto degli interventi, come l'immunomodulazione o la terapia, quando applicati durante il periodo neonatale.

Un modello di trapianto endovenoso neonatale per la valutazione delle attività immunitarie precoce contro le cellule tumorali

Impara a eseguire iniezioni endovenose non invasive in topi neonati di uno-due giorni per studiare malattie pediatriche. Questo metodo consente la somministrazione accurata di farmaci e migliora la ricerca sulle terapie neonatali.

Le iniezioni per via endovenosa nel topo neonatale

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