Name: Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Impara a creare un modello di lesione polmonare indotta da Pseudomonas aeruginosa nel topo mediante iniezione intratracheale. Questo metodo permette di studiare infiammazione, morte cellulare e meccanismi di riparazione alveolare.

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni del National Institutes of Health HL105947-01 (YL), HL07829-16 (AM), HL090152 (AM).

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di cura degli animali e istituzionali biosicurezza Comitati della University of Illinois a Chicago. NOTA: Tutte le procedure che coinvolgono Pseudomonas devono essere eseguite con il livello di biosicurezza 2 (BSL2) pratiche, che includono ma non sono limitate a: maschera, occhiali di protezione, abito o tuta, e due paia di guanti. Lavorare in sicurezza biologica certificata Gabinetto. Trattare gli strumenti in contatto con i batteri con candeggina o biossido di cloro disinfettante a base. Utilizzare una scatola sigillata per i campioni di trasporto. 1. P. aeruginosa cultura e di crescita <ol><li> Negozio P. aeruginosa PA103 come uno stock batterica in un tappo a vite esageratamente a -80 ° C. </li><li> Posizionare la fiala in un rack in una scatola con etanolo al 70% bagnato asciugamani di carta e prendere al laboratorio livello di biosicurezza 2 (BSL2). </li><li> Streak i batteri su piastre di agar sangue di pecora e crescono a 37 ° C per ~ 15 ore in un incubatore. </li&gt; <li> In una cappa BSL2, graffiare i batteri dalla piastra con batteri loop e risospendere in 5 ml di PBS. </li><li> Conservare il titolo a 4 ° C per un massimo di 3 mesi. Tuttavia, determinare il titolo ogni 2 settimane. </li><li> Serialmente diluire i batteri in PBS (di solito da 1:10 a 1:10 4 7) e piastra fuori la diluizione noto su piastre di agar sangue di pecora. </li><li> Incubare le piastre per ~ 15 ore. Contare le colonie e calcolare Colony Forming Unit (CFU) per determinare la concentrazione di batteri. </li><li> Risospendere le concentrazioni appropriate (~ 5 x 10 3 UFC / ml) in 0,5 ml di PBS in 1,5 ml sterili cryovials con tappo a vite. Sigillare i cryovials e metterli in un rack esageratamente sul disinfettante salviette di carta a pieno carico in una scatola coperchio a scatto. </li><li> Trasportare la casella di stabulario BSL2. Una volta lì, aprire la scatola nell&#39;armadio BSL2. </li></ol> 2. P. aeruginosa instillazione <ol><li> Eseguire un intervento chirurgico di sopravvivenza in condizioni asettiche (guanti sterili, strumenti sterili, ed impiegare tecniche asettiche). Utilizzare un telino sterile per fornire un piano di lavoro per la (autoclave) gli strumenti chirurgici sterili. Sterilizzare gli strumenti utilizzando uno sterilizzatore tallone caldo tra ogni instillazione tracheale procedura. </li><li> Pesare i topi prima di anestesia. Anestetizzare topi con ketamina (100 mg / kg), xilazina (5 mg / kg), in 0,1 - 0,2 ml di PBS per via intraperitoneale (ip). Determinare l&#39;efficacia dell&#39;anestetico dalla non rispondenza alle pinch punta. Usare una pomata veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza sotto anestesia. </li><li> Trattenere mouse su una scheda chirurgico in armadietto BSL2. </li><li> Identificare l&#39;area per il taglio verso il basso. Radere questo settore e preparare la pelle con alternanza di alcol e tamponi povidone iodio 3 volte. </li><li> Trattare l&#39;area di incisione con anestetico locale (lidocaina) poiché l&#39;anestesia è sufficiente per un intervento chirurgico minore come un incisione cutanea per accedere alla trachea. </li><li> Fai una piccola incisione (circa 5 mm) sulla linea mediana del collo, e l&#39;uso schietto forceps per spostare delicatamente il muscolo per l&#39;accesso alla trachea. Esporre la trachea da dissezione chirurgica. </li><li> Disegna la soluzione di batteri in un 1 ml siringa monouso con ago 27 G. Per ogni mouse, somministrare 20-30 ml di batteri alla concentrazione adeguata (fino a 10 5 CFU ogni mouse). </li><li> Inserire l&#39;ago nella trachea. Iniettare la soluzione lentamente nel tracheale. </li><li> Assicurarsi che i rantoli di animali, che di solito indica che la soluzione ha raggiunto nei polmoni. </li><li> Chiudere la ferita con punti di sutura sterili (6-0 monofilamento) in condizioni asettiche. </li><li> Utilizzare 0,1 mg / kg di buprenorfina per via sottocutanea come post-operatoria analgesia per controllare il dolore postoperatorio. </li><li> Assicurarsi che il tempo richiesto dalla induzione di anestesia prima di incisione di chiusura è inferiore a 15 min. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, gettare siringhe e aghi in un apposito contenitore per rischio biologico taglienti. </li><li> Trattare gli strumenti chirurgici con disi a base di biossido di cloronfectant per 15 minuti, risciacquare e tornare al laboratorio per la sterilizzazione e il riutilizzo, se necessario. </li><li> La casa dei topi singolarmente in gabbie pulite in ambiente caldo. </li><li> Controllare sull&#39;animale ogni 30 minuti fino a quando non riprende conoscenza e comincia a muoversi; e in seguito a intervalli di 12 h per i primi 3 giorni dopo l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Tenere i topi nella struttura BSL2 animali tutto l&#39;esperimento. Assicurarsi che solo il tessuto contenute in scatola sigillata lasciano l&#39;impianto BSL2 animali. Se i topi esprimono uno dei comportamenti moribondi (definito come distress respiratorio, letargia, incapacità di deambulare in risposta alla stimolazione dolce) in qualsiasi punto dello studio, i topi eutanasia da CO 2 inalazione da una fonte in bottiglia seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Euthanize il soggetto sperimentale per dissanguamento in anestesia. <ol><li> Raccogliere tessuto polmonare di topi eutanasia. Eseguire queste procedure in un cappuccio BSL2. Se necessario, trasferire il campione utilizzando tubi sigillati posti in una rack su disinfettanti carta assorbente pieno carico in una scatola coperchio a scatto per un ulteriore processo. </li></ol></li></ol>

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<li>Sadikot, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+immunomodulation+of+the+nf-kappab+pathway+in+airway+epithelium+impacts+host+defense+against+pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeted immunomodulation of the nf-kappab pathway in airway epithelium impacts host defense against pseudomonas aeruginosa.</a> J Immunol. 176, 4923-4930 (2006).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il mouse polmone modello di lesioni Pseudomonas che descriviamo qui imita l&#39;intero processo di infiammazione, danno polmonare, la riparazione e la risoluzione che si verificano a seguito di lesione polmonare acuta o polmonite. Ha vantaggi unici a confronto con diversi altri modelli di pregiudizio, in quanto è clinicamente rilevante e relativamente sicuro e facile da maneggiare. La fase critica nella procedura è che l&#39;iniezione della soluzione di batteri deve essere molto lenta. Se l&...

I polmoni sono esposti agli agenti patogeni ambientali e sono suscettibili di infiammazione e lesioni 1-3. In condizioni patologiche come la polmonite o sindrome da sofferenza respiratoria dell&#39;adulto (ARDS), agenti patogeni e fattori infiammatori rilasciati dai leucociti inducono lesioni e la morte delle cellule alveolari 1-3. E &#39;importante sviluppare modelli animali di danno polmonare acuto per facilitare lo studio della patologia del pregiudizio, nonché il meccanismo di riparazione. Attualmente, la maggior parte delle persone usano iperossia e bleomicina topo indotto modelli danno polmonare 4. Tuttavia, i meccanismi di iperossia causato lesioni non sono gli stessi come maggior parte delle lesioni polmonari comuni che si verificano durante polmonite o ARDS 5. Bleomicina indotta lesione acuta è rara in un contesto clinico 4. Qui riportiamo un polmone modello di lesione del mouse usando iniezione intra-tracheale di P. aeruginosa 6,7. Questo modello è clinicamente rilevante, e imita il processes che accadono dopo la polmonite 8. Come un opportunista, agente patogeno nosocomiale di individui immunocompromessi, P. aeruginosa infetta in genere il tratto polmonare, delle vie urinarie, ustioni, ferite, e causa anche altre infezioni del sangue 6. Il batterio rilascia virulenza fattore esotossina A, si moltiplicano e si scatenano risposte immunitarie 6. Somministrazione intra-trachael di P. aeruginosa riflette la situazione di esposizione umana ai batteri che causano la polmonite e la patologia è probabile che sia diverso dal virus H1N1 dell&#39;influenza polmonare indotta modello di lesione recentemente riportato 9. Dal momento che P. aeruginosa è un patogeno opportunista, è relativamente sicuro da maneggiare rispetto ad alcuni dei patogeni più virulenti. Qui abbiamo usato iniezione intra-tracheale per amministrare i batteri, perché abbiamo osservato che questo metodo ha introdotto più batteri nella regione distale alveoli del polmone rispetto aalcune altre procedure come l&#39;utilizzo di un catetere attraverso la bocca. Rispetto ad altri modelli di danno polmonare acuto, il P. aeruginosa modello qui descritto è adatto per studiare danno polmonare indotta da batteri e infiammazione eccessiva. A differenza di altri modelli animali che utilizzano P. aeruginosa per indurre la sepsi 10,11, qui si usa l&#39;iniezione intra-tracheale di questi batteri di indurre localizzata danno polmonare acuto.

<table><tbody><tr><td>Anestetico: ketamina, xilazina, lidocaina, buprenorfina</td><td></td><td></td><td>grado farmaceutico</td></tr><tr><td>Ago da 27 G</td><td></td> Siringa <td>Fisher 1482648</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td></td><td>14823434</td><td>forbici da 1 ml</td></tr> Strumenti di <tr><td></td><td>scienza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fine Pinze</td><td>Strumenti</td> di scienza <td></td><td></td></tr><tr><td>fine Sutura&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>19-037-526</td><td></td></tr><tr><td>Calibro oculare, guanto, camice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Disinfettante <td></td><td></td><td>a base di biossido di cloro</td> per armadio <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>di<td>biosicurezza</td></tr> Piastre di <tr><td>agar per sangue di pecora</td> Clidox<td>Fornitura Medex</td><td>HL-1160</td><td></td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa induced lung injury modello

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

Per studiare danno polmonare acuto umana e la polmonite, è importante sviluppare modelli animali per simulare varie caratteristiche patologiche di questa malattia. Qui abbiamo sviluppato un modello di topo polmone lesioni da iniezione intra-tracheale di batteri Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa o PA). Utilizzando questo modello, siamo stati in grado di mostrare l&#39;infiammazione polmonare in fase precoce di lesioni. Inoltre, alveolare leakiness barriera epiteliale è stato osservato analizzando lavaggio broncoalveolare (BAL); e la morte delle cellule alveolari è stato osservato da Tunel test utilizzando il tessuto ottenuto da polmoni feriti. In una fase successiva dopo un trauma, abbiamo osservato proliferazione cellulare richiesto per il processo di riparazione. L&#39;infortunio è stato risolto 7 giorni dalla apertura di P. aeruginosa iniezione. Questo modello riproduce il corso sequenziale di infiammazione polmonare, lesioni e di riparazione durante la polmonite. Questo modello animale clinicamente rilevante è adatto per studiare la patologia, il meccanismo di riparazione, fopo danno polmonare acuto, e può anche essere usato per testare potenziali agenti terapeutici per questa malattia.

Partendo 24-72 ore dopo P. iniezione aeruginosa, aumentata cellularità è stata osservata in sezioni polmonari (Figura 1A-D). Il polmone ha iniziato a recuperare da infortuni 96 ore dopo (Figura 1E). A 7 giorni dopo il P. aeruginosa, normale morfologia alveoli è stato in gran parte restaurato (Figura 1F). Tunnel di colorazione sezioni grazie polmonari preparati in 24 ore di post P. aeruginosa ha mostrato la morte cellulare nelle cellul...

Abbiamo sviluppato un modello di lesione polmonare nel topo mediante iniezione intra-tracheale del batterio Pseudomonas aeruginosa. Questo modello imita il danno polmonare durante la polmonite ed è clinicamente rilevante.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di imitare la polmonite, le condizioni di danno polmonare nel topo mediante la somministrazione di pseudomonas aerogen. Ciò si ottiene preparando prima lo pseudomonas alla concentrazione appropriata per l'iniezione. Nella seconda fase, la trachea del topo viene accuratamente esposta e quindi i batteri vengono somministrati ai polmoni mediante iniezione intratracheale.Nella fase finale, la progressione della malattia nel topo viene monitorata attentamente. In definitiva, l'infiammazione polmonare, i cambiamenti della morte cellulare nella barriera alveolare e la riparazione polmonare possono essere studiati nel polmone di topo iniettato con pseudomonas aerogen. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia del danno polmonare acuto causato dalla polmonite.Poiché questo modello imita i processi successivi alla polmonite Per creare quats di p Aerogen, PA 1 0 3 per l'installazione iniziare trasportando una fiala criogenica dei batteri da meno 80 gradi Celsius, conservando al livello di biosicurezza due o BSL due laboratorio in un rack in una scatola rivestita con tovaglioli di carta bagnati al 70% di etanolo. Quindi, sotto una striscia di due cappucci BSL, l'aerogeno P PA 1 0 3 colonie batteriche su piastre di agar di sangue di pecora e far crescere le colonie in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Dopo circa 15 ore, utilizzare un ansa batterica per trasferire le colonie in cinque millilitri di PBS.Quindi diluire in serie i batteri in più PBS da uno a 10, a quattro, da uno a 10 a sette concentrazioni e distribuire la diluizione su piastre di agar di sangue di pecora fresco. Quindi, dopo circa altre 15 ore di incubazione, calcolare le unità formanti colonie per ciascuna piastra per determinare la concentrazione di batteri. Successivamente, Eloqua la quantità appropriata di batteri in 0,5 millilitri di PBS in 1,5 millilitri, fiale criogeniche sterili con tappo a vite, quindi posizionare le fiale sigillate in un rack per fiale criogeniche su salviette di carta cariche di disinfettante in una scatola con coperchio a scatto in un armadietto BSL a due, coprire delicatamente gli occhi dell'animale con un unguento veto funzionante.Radere rapidamente l'incisione e pulire la pelle utilizzando tamponi alternati di alcool e iodio povidone tre volte e confermare la sedazione con le dita dei piedi. Pizzicare, trattenere il topo su una tavola chirurgica dopo aver trattato la pelle con un anestetico locale. Quindi, fai una piccola incisione di cinque millimetri sulla linea mediana del collo dell'animale e usa una pinza smussata per muovere delicatamente il muscolo per accedere alla trachea.Quando la trachea è stata esposta, aspirare fino a una volta 10 nelle cinque unità formanti colonie dei batteri in 20-30 microlitri di PBS in una siringa monouso da un millilitro dotata di un ago calibro 27. Quindi inserire l'ago nella trachea e iniettare lentamente la soluzione. Assicurati che l'animale ansimi, il che di solito indica che la soluzione ha raggiunto il polmone.Chiudere ora asetticamente la ferita con sei punti di sutura sterili monofilamento zero e somministrare l'analgesia postoperatoria. Quindi gettare le siringhe e gli aghi nell'apposito contenitore per oggetti taglienti a rischio biologico dopo che ogni animale è stato iniettato. Come stanno i myers da soli in gabbie pulite in un ambiente caldo?Controllo degli animali ogni 30 minuti fino a quando non riprendono conoscenza e iniziano a muoversi. Trattare gli strumenti chirurgici con disinfettante a base di biossido di cloro per 15 minuti. Quindi sciacquare e restituire gli strumenti al laboratorio per un'ulteriore sterilizzazione, se necessario.Ospitare i topi nella struttura BSL per due animali durante l'esperimento e poi, dopo il dissanguamento in anestesia, raccogliere il tessuto polmonare da ciascun animale sotto un cappuccio BSL due. Infine, se si desidera un'ulteriore elaborazione, trasferire i campioni in provette sigillate poste su un rack su tovaglioli di carta carichi di disinfettante in una scatola con coperchio a scatto all'impianto di lavorazione appropriato. In questo esperimento rappresentativo da 24 a 72 ore dopo l'iniezione di aerogeno P, si può osservare un aumento della cellularità nelle sezioni polmonari.Entro 96 ore, il polmone ha iniziato a riprendersi e entro sette giorni, la normale morfologia degli alveoli è in gran parte ripristinata. La colorazione a tunnel delle sezioni polmonari preparata 24 ore dopo l'installazione dell'aerogeno mostra la morte cellulare all'interno delle cellule alveolari per studiare il processo di riparazione. In questa lesione, il modello BRDU può essere iniettato nei topi tre giorni dopo la somministrazione di p aerogen.Come illustrato, gli animali trattati con p aerogen mostrano un'iperproliferazione nel tessuto polmonare rispetto agli animali trattati con controllo. Per studiare i cambiamenti nella barriera, nella permeabilità e nell'infiammazione post-infortunio, il lavaggio broncoalveolare o il liquido intestinale possono essere raccolti in diversi punti temporali. Dopo l'iniezione di aerogeno, ad esempio, la concentrazione di proteine all'interno dell'intestino aumenta significativamente a 48 ore dall'installazione batterica, indicando la perdita della barriera epiteliale il numero di cellule.Anche l'intestino è aumentato in modo significativo in questo momento, suggerendo una risposta infiammatoria da quattro a cinque giorni dopo l'iniezione di aerogeno P, sia il livello di proteine intestinali che il numero di cellule iniziano a diminuire, suggerendo il recupero. Inoltre, un livello di proteina infiammatoria dei macrofagi due, una citochina coinvolta nell'attrazione dei neutrofili, aumenta significativamente a 48 ore per poi tornare ai livelli basali a 96 ore. Nei lisati polmonari senza p aerogeno si osserva solo un piccolo numero di monociti nel liquido intestinale.Al contrario, nell'intestino è presente un gran numero di neutrofili, isolati a 48 ore dall'iniezione. Entro 96 ore, la composizione cellulare dell'intestino ritorna ai livelli di controllo Seguendo questa procedura. Altri metodi, come l'istologico, il sezionamento o la raccolta del lavaggio broncoalveolare, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio: quali cellule o fattori sono coinvolti nell'infiammazione e nella riparazione dopo un danno polmonare acuto?

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Attualmente mancano modelli in vivo suscettibili di screening farmacologico contro le infezioni batteriche croniche. Qui, descriviamo un protocollo per l'infezione della ferita da parte di un isolato clinico di Pseudomonas aeruginosa per generare un'infezione persistente nelle larve di zebrafish.

Modellazione dell'infezione persistente da Pseudomonas aeruginosa nelle larve di zebrafish ferite

In questo studio, una tecnica di instillazione endotracheale non invasiva è dimostrata per sviluppare l'ALI nei ratti utilizzando un laringoscopio di base per garantire una precisa somministrazione di LPS ai polmoni. La LPS viene immessa tramite un tubo endotracheale tramite un laringoscopio. L'entità della lesione polmonare viene valutata in più momenti temporali.

Somministrazione endotracheale non invasiva di lipopolisaccaridi per indurre lesioni polmonari acute nei roditori

Impara a creare un modello di lesione polmonare indotta da Pseudomonas aeruginosa nel topo mediante iniezione intratracheale. Questo metodo permette di studiare infiammazione, morte cellulare e meccanismi di riparazione alveolare.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

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