L'uso di MALDI-TOF spettrometria di massa e un database personalizzato per caratterizzare batteri indigeni ad un unico ambiente di Cave (Kartchner Caverns, AZ, USA)
2 gennaio 2015
Questo lavoro descrive in dettaglio le procedure per l'identificazione rapida dei batteri utilizzando MALDI-TOF MS. Le procedure di identificazione includono l'acquisizione dello spettro, la costruzione di database e le analisi di follow-up. Vengono presentati due metodi di identificazione, quelli basati sul coefficiente di somiglianza e quelli basati sui biomarcatori.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare, applicare e dimostrare una procedura dettagliata per l'identificazione batterica basata su libreria utilizzando MALDI per la spettrometria di massa. Ciò si ottiene acquisendo prima gli spettri di massa dei batteri utilizzando uno spettrometro di massa maloff. In questo studio, vengono raccolti spettri di massa di 15 batteri isolati da un ambiente caustico, la forma dei picchi, i modelli caratteristici o le impronte digitali dei batteri analizzati.
Questi spettri di massa vengono quindi importati nel software e viene costruito un database di modelli. Successivamente, gli spettri di massa di riferimento nel database del modello vengono elaborati e analizzati utilizzando l'analisi dei cluster, la corrispondenza dei picchi e l'analisi statistica. Infine, gli spettri di massa dei batteri codificati in cieco, che vengono selezionati casualmente da questi 15 batteri, vengono nuovamente raccolti e confrontati con gli spettri di riferimento nel database del modello per i risultati dell'identificazione, mostrano che i batteri possono essere identificati correttamente in base ai coefficienti di somiglianza o ai potenziali biomarcatori e classi di picco.
Iniziare questa procedura con la deposizione di un microlitro di estratto proteico che non contiene cellule vitali su una piastra target maldi in acciaio inossidabile e lasciarla asciugare. Quindi sovrapporre l'estratto proteico essiccato con un microlitro di soluzione di matrice e lasciarlo asciugare. Quindi depositare un microlitro di CBR standard sulla piastra di destinazione dopo che si è asciugata, sovrapporre il CBR con un microlitro di soluzione di matrice e lasciarlo asciugare.
Infine, depositare due microlitri di soluzione di matrice sulla piastra target come controllo negativo. Utilizzare lo spettrometro multiplo a massa dotato di laser ad azoto e azionato utilizzando il software di controllo Bruker flex. Raccogli ogni spettro di massa in modalità lineare positiva accumulando 500 colpi laser con incrementi di 100 colpi
.Impostare la sorgente ionica di una tensione a 20, i kilovolt la sorgente ionica, due tensioni a 18,15 kilovolt e la tensione della lente a 9,05 kilovolt. Questi parametri sono specifici dello strumento e possono richiedere un'ottimizzazione. Impostare la massa per l'intervallo di carica per la valutazione automatica dello spettro da due a 20 kilodalton per carica.
Quindi impostare la soglia minima di risoluzione su 100. Selezionare l'algoritmo di rilevamento del picco OID. Impostare la soglia del rapporto segnale/rumore su due e la soglia minima di intensità su 100.
Infine, impostare il picco di accumulo su 500 per la progettazione del database. Creare un nuovo database in bio numerics 7.1 utilizzando la procedura guidata per il nuovo database. Creare quindi un tipo di esperimento dello spettro, ad esempio maldi, utilizzando i comandi nel pannello dei tipi di esperimento.
Quindi, crea i livelli utilizzando il pannello di progettazione del database, vai al menu del database e aggiungi nuovi livelli utilizzando il comando livello aggiungi nuovo livello qui. Crea a livello di specie, a livello di replica biologica e a livello tecnico. Per importare gli spettri di massa grezzi.
Innanzitutto, esportare gli spettri di massa grezzi come file di testo utilizzando l'analisi flessibile navigando nel menu file e facendo clic sul comando esporta spettro di massa. Quindi importare gli spettri di massa grezzi nel database a livello delle repliche tecniche. Pre-elabora gli spettri di massa grezzi importando e ricampionando utilizzando un algoritmo di adattamento quadratico.
Quindi, esegui una sottrazione di base utilizzando un disco rotante con una dimensione di 50 punti, calcola il rumore utilizzando la trasformazione wavelet continua o CWT. Smussa gli spettri utilizzando una finestra di Kaiser con una dimensione della finestra di 20 punti e una beta di 10 punti. Quindi eseguire una seconda sottrazione di base utilizzando un disco rotante con una dimensione di 200 punti.
Infine, rilevare i picchi utilizzando il CWT con un rapporto segnale/rumore minimo di 10 dopo la pre-elaborazione di modelli caratteristici sicuri di ogni spettro di massa, come elenchi di picchi, contenenti le dimensioni dei picchi, le intensità dei picchi e il rapporto segnale/rumore. Successivamente, creare spettri di massa compositi da spettri pre-elaborati utilizzando il comando riassunto nel menu di analisi. Scegli la replica biologica come livello target. Qui.
Combina spettri di massa di 10 repliche tecniche della stessa colonia per ottenere uno spettro di massa composito per quella colonia, ottenendo tre spettri di massa compositi per quell'isolato a livello di replicato biologico. Infine, riassumi i tre spettri compositi per creare uno spettro composito per quell'isolato a livello di specie. Per eseguire l'analisi dei cluster basata sulla somiglianza e la scala multidimensionale, creare gruppi con colori.
Innanzitutto, selezionare i tre spettri di massa compositi biologici e fare clic sul comando crea nuovo gruppo da selezione nel menu del gruppo per creare un gruppo per l'isolato corrispondente. Quindi progetta un colore utilizzato automaticamente per questi tre spettri di massa. Eseguire l'analisi dei cluster navigando nel menu di clustering e facendo clic sul comando calcola analisi cluster.
Nelle impostazioni di confronto, pagina uno, selezionare la correlazione di Pearson e lasciare gli altri parametri come predefiniti. A pagina due, selezionare il metodo del gruppo di coppie non ponderate con media aritmetica. Quindi fare clic su Fine.
Ottenere un grafico di scala multidimensionale utilizzando il comando di scala multidimensionale nel menu delle statistiche per eseguire la corrispondenza dei picchi. Fare clic sul tipo di spettro maldi nel pannello degli esperimenti. Quindi seleziona il layout.
Mostra immagine, vengono mostrati i singoli picchi di spettri. Quindi, eseguire la corrispondenza dei picchi utilizzando il comando do peak matching nel menu spettri per identificare le classi di picco, eseguire il clustering bidirezionale facendo clic su matrice statistica. Estrazione dati. L'intensità dei picchi abbinati alle classi di picco è rappresentata come una mappa di calore per identificare i batteri utilizzando il metodo basato sul coefficiente di somiglianza, creare un confronto e generare un rogramma basato sugli spettri di massa a livello di replica tecnica come eseguito per l'analisi dei cluster, salvare il rogramma per il confronto della somiglianza.
Selezionate uno spettro di massa sconosciuto e fate clic sull'analisi. Identificare le voci selezionate. Viene visualizzata la finestra di dialogo di identificazione.
Selezionare il tipo di classificatore basato sul confronto e fare clic su Avanti. Nella pagina successiva, scegli il grammo salvato come confronto di riferimento, quindi fai clic su Avanti. Scegli la somiglianza di base come metodo di identificazione e di nuovo, fai clic su Avanti, scegli la somiglianza massima come metodo di punteggio.
Digitare i valori di soglia e i valori di differenza minima appropriati per ogni parametro, quindi fare clic su Avanti. Una volta completati i calcoli, nel pannello dei risultati viene visualizzata la finestra di identificazione. Vengono elencati i membri del database che corrispondono meglio all'ignoto.
Un rogramma basato sull'analisi del clustering mostra una somiglianza tra ciascun isolato nel database. Il set di dati contiene spettri di 15 specie diverse con tre spettri compositi per ciascuna specie. L'analisi dei cluster a due vie può aiutare i ricercatori a identificare potenziali biomarcatori per una specie o ceppi all'interno di una specie.
Qui, il picco di intensità è rappresentato dai colori, il verde significa bassa intensità e il rosso significa alta intensità. Infine, sulla base di queste analisi, lo spettro di massa di un'incognita può essere confrontato con il grammo e si ottiene un'identificazione basata sul coefficiente di somiglianza.
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Panoramica
Questo lavoro descrive le procedure per l'identificazione rapida di batteri mediante MALDI-TOF MS. Le procedure di identificazione includono l'acquisizione dello spettro, la costruzione del database e le analisi di follow-up.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Spettrometria di Massa
- Identificazione Batterica
Sfondo
- La spettrometria di massa MALDI-TOF è uno strumento potente per l'identificazione batterica.
- Gli spettri di massa forniscono schemi caratteristici o impronte digitali dei batteri.
- La costruzione di database è essenziale per un'identificazione accurata.
- L'analisi statistica migliora l'affidabilità dei metodi di identificazione.
Scopo dello studio
- Sviluppare una procedura dettagliata per l'identificazione batterica basata su librerie.
- Dimostrare l'efficacia della spettrometria di massa MALDI-TOF nell'identificare i batteri.
- Confrontare diversi metodi di identificazione basati sugli spettri di massa.
Metodi Utilizzati
- Acquisizione di spettri di massa da batteri mediante uno spettrometro di massa MALDI-TOF.
- Costruzione di un database modello a partire da spettri di massa di riferimento.
- Elaborazione e analisi degli spettri mediante analisi cluster e corrispondenza dei picchi.
- Confronto di batteri codificati in cieco con spettri di riferimento per l'identificazione.
Risultati principali
- I batteri possono essere correttamente identificati mediante coefficienti di somiglianza.
- I potenziali biomarcatori e le classi dei picchi agevolano l'identificazione.
- L'analisi statistica supporta l'accuratezza dei metodi di identificazione.
- I risultati dimostrano l'affidabilità della spettrometria MALDI-TOF MS per l'identificazione batterica.
Conclusioni
- La spettrometria di massa MALDI-TOF è un metodo efficace per l'identificazione rapida dei batteri.
- Sia i metodi basati sul coefficiente di similarità che quelli basati su biomarcatori sono validi.
- La costruzione e l'analisi del database sono fondamentali per ottenere risultati accurati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La spettrometria di massa MALDI-TOF consente un'identificazione rapida dei batteri, supportando la validazione precoce del bersaglio nella scoperta di agenti antimicrobici grazie a una caratterizzazione affidabile a livello di genere e di specie. Questo metodo riduce l'ambiguità meccanicistica nei flussi di lavoro di screening microbico mediante l'impiego di impronte spettrali standardizzate e di confronti basati su database. Questo approccio aumenta la sicurezza predittiva nei processi di identificazione dei composti promettenti, fornendo risultati quantitativi e riproducibili per la differenziazione dei ceppi microbici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche chiarificando l'identità microbica di isolati ambientali.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante identificazione riproducibile a livello di genere e di specie.
- Valore predittivo: Permette il triage del portafoglio distinguendo ceppi patogeni da ceppi non patogeni nei microbiomi derivati da grotte.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per lo screening antimicrobico successivo mediante impronta spettrale.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità del saggio attraverso l'allineamento dei picchi e l'analisi dei cluster.
- Scalabilità: Facilita il riutilizzo della piattaforma stabilendo un database personalizzato per campagne di screening ripetute.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega la scoperta microbica ambientale alla validazione preclinica attraverso l'identificazione a livello di specie.
- Allineamento dei Biomarcatori: Identifica potenziali biomarcatori mediante l'analisi delle classi di picchi per il tracciamento specifico di ceppi.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione confermando l'identità microbica prima dei test sui composti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo la verifica di ipotesi mediante l'identificazione microbica, supportando l'individuazione di composti promettenti con dati spettrali riproducibili e orientando le decisioni precliniche attraverso il rilevamento di biomarcatori specifici per ceppo.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi identificando batteri indigeni provenienti da ambienti unici.
- Screening: Fornisce prontezza per saggi e risultati quantitativi mediante spettri di massa compositi e mappatura dell'intensità dei picchi.
- Analisi: Offre risultati statistici come coefficienti di somiglianza e mappe termiche per il confronto tra condizioni.
- Ricerca Translazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico attraverso l'identificazione a livello di specie e l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile mediante la costruzione di database personalizzati per lo screening ripetuto tra progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nel screening microbico.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dei flussi di lavoro di identificazione.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi antimicrobici.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio basate sull'identità microbica confermata.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in spettrometria di massa, bioinformatica e coltura microbica.
- Necessita di uno strumento MALDI-TOF, del software BioNumerics e di un'infrastruttura per l'analisi spettrale.
- Richiede standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per l'acquisizione degli spettri, la cura del database e i protocolli di abbinamento dei picchi.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si applica il metodo a diversi sistemi modello oltre agli isolati di grotta.
- È limitato dalla necessità di spettri di riferimento di alta qualità e di parametri di pre-elaborazione ottimizzati per un'identificazione accurata.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
1:46
Deposition on the MALDI Target
2:38
Mass Spectra Acquisition Using FlexControl Software
3:56
Database Construction Using Bionumerics Software
6:41
Mass Spectrum Data Analysis
8:24
Bacteria Identification with a Custom Database
9:40
Results: Similarity-coefficient-based Method Can Correctly Identify Bacteria to the Species Level
10:33
Conclusion
