Name: Luso di MALDI-TOF spettrometria di massa e un database personalizzato per caratterizzare batteri indigeni ad un unico ambiente di Cave (Kartchner Caverns, AZ, USA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Scopri l'identificazione batterica rapida con MALDI-TOF MS e database personalizzato per batteri di ambienti cavernosi. Questo metodo consente analisi accurate tramite spettri di massa e analisi statistica.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal New College of Interdisciplinary Arts and Sciences dell'Arizona State University, Applied Maths NV, e dalla National Science Foundation (ROA Supplement to Award No. MCB0604300). Tutte le opinioni, i risultati, le conclusioni o le raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation.

Attenzione: i batteri non identificati da qualsiasi ambiente possono essere patogeni e devono essere trattati con cautela utilizzando protocolli di biosicurezza adeguate. Lavora con fermenti vivi deve essere eseguita in un armadio biosicurezza Classe II utilizzando biologica Livello di sicurezza 2 (BSL-2) procedure. Maggiori informazioni su BSL-2 procedure sono disponibili nel manuale CDC / NIH intitolato &quot;biosicurezza in microbiologiche e Biomediche Laboratories,&quot; pagine 33-38. Il documento è disponibile online all&#39;indirizzo <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf</a> . Adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI), tra cui camici / camici, occhiali di sicurezza e guanti di lattice o di nitrile, deve essere indossato. Pratiche microbiologiche standard e precauzioni devono essere seguite, e rifiuti biologici devono essere eliminati in modo appropriato. I batteri utilizzati in questa manifestazione sono stati isolati da Kartchner Caverns,AZ, USA, da quattro ambienti, tra cui speleothem secca, pietra flusso, speleothem umido e stalattiti gocciolatoio (Tabella 1). Tutti gli isolati sono stati identificati mediante sequenziamento del 16S rDNA e conservati a -80 ° C in 25% glicerolo-R media 2 B. Tutti gli esperimenti sono stati completati a RT. Nota: Si consiglia di utilizzare lo stesso metodo di preparazione del campione per acquisire spettri di massa per la costruzione di database e gli spettri di massa di incognite. Metodo di preparazione del campione è stato dimostrato in precedenza di influenzare la qualità dello spettro e riproducibilità 3. Utilizzando un metodo di preparazione del campione diverso può causare non corretta identificazione di incognite, soprattutto quando a risoluzione più elevata tassonomica (es, a livello del ceppo) è desiderato. 1. Deposizione sul MALDI destinazione Attenzione: Diversi protocolli per ottenere estratti di proteine ​​richiedono l&#39;uso di acidi e solventi organici che devono essere utilizzati in conformità con guidElines e le informazioni contenute nei rispettivi Schede di sicurezza dei materiali (MSDS). Adeguato DPI devono essere indossati e varia in base al tipo e il volume di prodotti chimici utilizzati (ad esempio, camici / camici, guanti, occhiali di sicurezza, e la protezione delle vie respiratorie devono essere utilizzati quando si lavora con grandi quantità di solventi infiammabili, tossiche, come acetonitrile, e acidi corrosivi, come acidi formico e trifluoroacetico). <ol><li> Deposito 1 ml estratto proteico che non contiene cellule vitali (ottenute utilizzando opportuni protocolli, descritte in precedenza 11-13) su una piastra segnale MALDI acciaio inox e lasciarlo asciugare. Sovrapporre l&#39;estratto proteico secco con una soluzione di matrice 1 ml (soluzione di acido-4-idrossi cinnamico α-ciano-), e lasciarlo asciugare. </li><li> Per ogni replica biologica, individuare un numero adeguato di repliche tecnici (da 5 a 20 replicati tecnici). Qui, individuare 10 replicati tecnici per ogni replica biologica e 3 repliche biologiche were preparati. Nota: Si consiglia di utilizzare una piastra segnale MALDI acciaio lucido quando si utilizza il metodo di preparazione del campione di estrazione di proteine. Utilizzando piastre di acciaio di destinazione terra può causare la diffusione e la miscelazione involontaria di diversi campioni di fuori dei singoli pozzetti del campione. </li><li> Deposito 1 ml calibrante di serie sulla piastra segnale e lasciare asciugare. Sovrapposizione con la soluzione di matrice 1 ml e lasciare asciugare. </li><li> Deposito soluzione di matrice 2 microlitri sulla piastra porta come controllo negativo. </li></ol> 2. Mass Spectra Acquisition <ol><li> Utilizzare uno spettrometro di massa MALDI-TOF dotato di un laser di azoto (λ = 337 nm) e gestito utilizzando il software Bruker FlexControl. </li><li> Raccogliere ogni spettro di massa in modalità lineare positiva da accumulo di colpi 500 laser con incrementi colpo 100. Impostare la tensione della sorgente di ioni 1 a 20 kV; sorgente di ioni 2 tensione 18.15 kV; e la tensione lenti a 9,05 kV. Si noti che questi parametri sono strumento di specific e potrebbe richiedere una regolazione su altri strumenti per ottenere risultati ottimali. </li><li> Impostare l&#39;intervallo di massa-a-charge per la valutazione dello spettro automatica da 2 a 20 kDa per carica. Utilizzare l&#39;algoritmo di rilevamento di picco baricentro. Impostare la soglia minima risoluzione a 100 Da. Impostare il rapporto segnale rumore (S: N) soglia 2. Impostare la soglia minima di intensità a 100. </li></ol> 3. Database di costruzione <ol><li> Progettazione di database <ol><li> Creare un nuovo database in BioNumerics 7.1 utilizzando la &quot;procedura guidata Nuovo database&quot;. </li><li> Creare un tipo di esperimento spettro, ad esempio, Maldi, utilizzando i comandi nel pannello &quot;Tipi di esperimento&quot;. </li><li> Creare i livelli utilizzando il &quot;pannello di progettazione del database&quot;. Aggiungere nuovi livelli utilizzando il &quot;Livello&gt; Aggiungi nuovo livello ...&quot; comando nel menu &quot;Database&quot;. Qui, creare &quot;specie&quot; di livello, &quot;replica biologica&quot; &quot;e&quot; replica tecnici &quot;livello, respectively. </li></ol></li><li> Importazione e pre-elaborazione spettri di massa grezza <ol><li> Esportare gli spettri di massa crudo come file .txt utilizzando FlexAnalysis cliccando sul pulsante &quot;Esporta&gt; Spettro di massa&quot; comando nel menu &quot;File&quot;. </li><li> Importare gli spettri di massa grezza (.txt) nel database del livello dei replicati tecnici. </li><li> Pre-elaborazione spettri di massa grezza. <ol><li> Importazione e resample (utilizzando un algoritmo quadratico raccordo). </li><li> Eseguire una sottrazione della linea di base (con un disco di rotolamento con una dimensione di 50 punti). </li><li> Calcola rumore [continua Wavelet Transformation (CWT)], liscia (Finestra Kaiser con una dimensione della finestra di 20 punti e beta di 10 punti), ed effettuare una seconda sottrazione di base (disco a rotazione con dimensioni di 200 punti). </li><li> Rileva picchi [CWT con un segnale minimo di rumore (S: N) di 10]. </li></ol></li><li> Dopo la pre-elaborazione, salvare modelli caratteristici di ogni spettro di massa, come le liste contenenti picco piccodimensioni, intensità dei picchi, S: N, ecc, nel database. </li></ol></li><li> Creazione di spettri di massa composita <ol><li> Creare spettri composito da spettri già preparati usando il comando &quot;Riassumere ...&quot; nel menu &quot;Analisi&quot;. Scegliere la &quot;replica biologica&quot; come livello target. </li><li> Qui, unire spettri di massa di 10 replicati tecnici della stessa colonia per produrre uno spettro di massa composito per quella colonia, con conseguente tre composito spettri di massa per isolare che a livello &quot;replica biologica&quot;. </li><li> Qui, riassumere i tre spettri composito per creare uno spettro composito per isolare che a livello &quot;Specie&quot;. Nota: Lo spettro composito è la media punto per punto dei replicati tecnici. Replica con una similitudine (Pearson di correlazione) alla media di inferiore al 95% (impostazione di default) sono esclusi dal composito. Peaks sul spettri compositi sono chiamati solo se sono presenti nel 75% (impostazione di default) dei replicati inclusi. Per le repliche biologiche, queste impostazioni sono state 90 e 60%, rispettivamente. </li></ol></li></ol> Analisi 4. Messa Spectrum dati <ol><li> Selezionare le voci nel database e creare un confronto facendo clic sul comando &quot;Crea nuovo confronto&quot; nel pannello &quot;Confronti&quot;. </li><li> Qui, utilizzare gli spettri di massa al &quot;replicare tecnici&quot; e / o livelli &quot;replicati biologica&quot; per visualizzare i confronti e analisi. </li><li> Analisi cluster basato somiglianza e scalabilità multi-dimensionale (MDS) <ol><li> Creare gruppi di colori. Selezionare i tre biologica spettri di massa composita e fare clic su &quot;Crea nuovo gruppo dalla selezione&quot; comando nel menu &quot;gruppi&quot; di creare un gruppo per la corrispondente isolato. Designare un colore usato automaticamente per questi tre spettri di massa. </li><li> In alternativa, definire gli stati di campo con i colori corrispondenti utilizzando i comandi del &quot;Database voci pannello &quot;tale che qualsiasi raggruppamento basato su questo campo definito utilizza lo stesso colore definito per questo gruppo. </li><li> Eseguire l&#39;analisi cluster. Fare clic sul comando &quot;Calcola cluster analysis&quot; nel menu &quot;Clustering&quot;. In Impostazioni di confronto Page 1, selezionare il &quot;Pearson di correlazione&quot; e lasciare gli altri parametri di default. A pagina 2, selezionare &quot;UPGMA&quot;. Quindi fare clic su &quot;Fine&quot;. </li><li> Ottenere una trama MDS utilizzando il &quot;ridimensionamento Multi-dimensionale ...&quot; comando nel menu &quot;Statistica&quot;. </li></ol></li><li> Corrispondenza Peak <ol><li> Cliccate sul tipo di spettro &quot;Maldi&quot; nel pannello &quot;Esperimenti&quot;. Quindi selezionare &quot;Layout&gt; Immagine&quot;. Spectra sono presenti come bande gel. </li><li> Eseguire corrispondenza picco con il comando &quot;Do corrispondente picco&quot; nel menu &quot;Spectra&quot;. </li></ol></li><li> Individuazione delle classi di punta <ol><li> Effettuare analisi delle componenti principali (PCA). Evidenziare il &quot;Maldi &quot;tipo di esperimento nel&quot; sperimentale &quot;del pannello e utilizzare la funzione&quot; Analisi delle Componenti Principali ... &quot;comando nel menu&quot; statistico &quot;per eseguire PCA. </li><li> Eseguire due vie clustering. Fare clic su &quot;Statistiche&gt; mining Matrix&quot; ... nella finestra &quot;Confronto&quot;. L&#39;intensità dei picchi corrispondenti alle classi di punta è rappresentata utilizzando colori diversi (mappa di calore). </li></ol></li></ol> 5. Batteri identificazione con un database personalizzato <ol><li> Metodo coefficiente a base di somiglianza <ol><li> Creare un confronto e generare un dendrogramma basato su spettri di massa a livello di &quot;replicare tecnici&quot; come descritto al punto 4.3.3. Salvare il dendrogramma per il confronto di similarità. </li><li> Selezionare uno spettro di massa sconosciuta, e fare clic su &quot;Analisi&gt; Identificare le voci selezionate&quot;. Verrà visualizzata la finestra di dialogo di identificazione. </li><li> Selezionare la &quot;base di confronto&quot; tipo classificatore (o un classif memorizzataier) e cliccare su &quot;Avanti&quot;. Nella pagina successiva, scegli il dendrogramma salvato come un confronto di riferimento e quindi fare clic su &quot;Avanti&quot;. </li><li> Scegliere la &quot;somiglianza di base&quot; come un metodo di identificazione e quindi fare clic su &quot;Avanti&quot;. </li><li> Scegliere la &quot;somiglianza Massimo&quot; come metodo di punteggio. Digitare appropriati valori soglia e valori minimi di differenza per ogni parametro e quindi fare clic su &quot;Avanti&quot;. </li><li> Una volta che i calcoli sono stati completati, viene visualizzata la finestra di identificazione. Nel &quot;Risultati&quot; pannello, vengono elencati i membri del database che meglio corrispondono l&#39;ignoto. </li><li> Salvare il progetto di identificazione e validare l&#39;identificazione con il &quot;analisi cross-validazione&quot; comando nel pannello &quot;progetto di identificazione&quot;. </li></ol></li><li> Potenziale metodo basato biomarcatore- <ol><li> Definire le classi di picco. Nella finestra &quot;Matrix Mining&quot;, selezionare serie di cime che condividono caratteristiche comuni e definire questi picchi come speciclassi fic picco (potenziali biomarkers) usando &quot;Spectra&gt; Gestisci tipi di classe picco ...&quot; nella &quot;finestra di confronto&quot;. </li><li> Qui, definire classi di picco specifici per ogni isolano per tutti i 15 isolati. </li><li> Selezionare spettri di massa di incognite e abbinare i picchi di questi spettri alle classi picchi definiti come precedentemente descritto. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: A review.</a> Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).</li>
<li>Siegrist, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+and+characterization+of+environmental+strains+of+Escherichia+coli+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+%28MALDI-TOF-MS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Discrimination and characterization of environmental strains of Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS).</a> J Microbiol Meth. 68 (3), 554-562 (2007).</li>
<li>Goldstein, J. E., Zhang, L., Borror, C. M., Rago, J. V., Sandrin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+conditions+and+sample+preparation+methods+affect+spectrum+quality+and+reproducibility+during+profiling+of+Staphylococcus+aureus+with+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Culture conditions and sample preparation methods affect spectrum quality and reproducibility during profiling of Staphylococcus aureus with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Lett Appl Microbiol. 57 (2), 144-150 (2013).</li>
<li>Benagli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+MALDI-TOF+MS+identification+database+at+genospecies+level+for+clinical+and+environmental+Aeromonas+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li>
<li>Sauer, S., Kliem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+tools+for+the+classification+and+identification+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry tools for the classification and identification of bacteria.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 74-82 (2010).</li>
<li>Bohme, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpectraBank%3A+An+open+access+tool+for+rapid+microbial+identification+by+MALDI-TOF+MS+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">SpectraBank: An open access tool for rapid microbial identification by MALDI-TOF MS fingerprinting.</a> Electrophoresis. 33 (14), 2138-2142 (2012).</li>
<li>Walker, J., Fox, A. J., Edwards-Jones, V., Gordon, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+cell+mass+spectrometry+%28ICMS%29+used+to+type+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+media+effects+and+inter-laboratory+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Intact cell mass spectrometry (ICMS) used to type methicillin-resistant Staphylococcus aureus: media effects and inter-laboratory reproducibility.</a> J Microbiol Meth. 48 (2-3), 117-126 (2002).</li>
<li>Ruelle, V., El Moualij, B., Zorzi, W., Ledent, P., De Pauw, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+environmental+bacterial+strains+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of environmental bacterial strains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun Mass Sp. 18 (18), 2013-2019 (2004).</li>
<li>Sedo, O., Sedlacek, I., Zdrahal, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+Methods+for+Maldi-MS+Profiling+of+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation Methods for Maldi-MS Profiling of Bacteria.</a> Mass Spectrom Rev. 30 (3), 417-434 (2011).</li>
<li>Swatkoski, S., Russell, S., Edwards, N., Fenselau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+model+virus+using+residue-specific+chemical+cleavage+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of a model virus using residue-specific chemical cleavage and MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Anal Chem. 79 (2), 654-658 (2007).</li>
<li>Freiwald, A., Sauer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+classification+and+identification+of+bacteria+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic classification and identification of bacteria by mass spectrometry.</a> Nat Protoc. 4 (5), 732-742 (2009).</li>
<li>Drevinek, M., Dresler, J., Klimentova, J., Pisa, L., Hubalek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+preparation+methods+for+MALDI-TOF+MS+identification+of+highly+dangerous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lett+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample preparation methods for MALDI-TOF MS identification of highly dangerous bacteria.</a> Lett Appl Microbiol. 55 (1), 40-46 (2012).</li>
<li>Lasch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+mass+spectrometry+compatible+inactivation+method+for+highly+pathogenic+microbial+cells+and+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF mass spectrometry compatible inactivation method for highly pathogenic microbial cells and spores.</a> Anal Chem. 80 (6), 2026-2034 (2008).</li>
<li>Usbeck, J. C., Kern, C. C., Vogel, R. F., Behr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+experimental+and+modelling+parameters+for+the+differentiation+of+beverage+spoiling+yeasts+by+Matrix-Assisted-Laser-Desorption%2FIonization+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry+%28MALDI-TOF+MS%29+in+response+to+varying+growth+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Optimization of experimental and modelling parameters for the differentiation of beverage spoiling yeasts by Matrix-Assisted-Laser-Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) in response to varying growth conditions.</a> Food Microbiol. 36 (2), 379-387 (2013).</li>
<li>Del Chierico, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+MS+proteomic+phenotyping+of+filamentous+and+other+fungi+from+clinical+origin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF MS proteomic phenotyping of filamentous and other fungi from clinical origin.</a> J Proteomics. 75 (11), 3314-3330 (2012).</li>
<li>Vitale, R., Roine, E., Bamford, D. H., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+fingerprints+of+intact+viruses+by+MALDI-TOF%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Bba-Mol+Cell+Biol+L%22%5BJournal%5D)">Lipid fingerprints of intact viruses by MALDI-TOF/mass spectrometry.</a> Bba-Mol Cell Biol L. 1831 (4), 872-879 (2013).</li>
<li>Zhang, L., Borror, C. M., Sandrin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designed+experiments+approach+to+optimization+of+automated+data+acquisition+during+characterization+of+bacteria+with+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">A designed experiments approach to optimization of automated data acquisition during characterization of bacteria with MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Plos One. 9 (3), (2014).</li>
<li>Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacteria+from+positive+blood+culture+bottles+by+use+of+matrix-assisted+laser+desorption-ionization+time+of+flight+mass+spectrometry+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22J+ClinMicrobiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting.</a> J ClinMicrobiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).</li>
</ol>

Gli autori Vranckx e Janssens sono dipendenti di Applied Maths NV, il produttore del software di analisi dei dati utilizzato in questo video. Applied Maths NV ha fornito alcuni moduli software evidenziati in questo video, nonché una parte dei costi di pubblicazione associati a questo video.

Questa dimostrazione ha mostrato le procedure dettagliate di caratterizzazione e identificazione di batteri utilizzando MALDI-TOF MS e un database personalizzato. Rispetto ai metodi tradizionali molecolari, per esempio, metodi di impronte 16S rDNA sequenziamento, MS MALDI-TOF facilitano più rapida identificazione di diversi batteri. A causa della sua robustezza, questa tecnica è ampiamente utilizzata per caratterizzare i batteri, virus, funghi e lieviti dall&#39;ambiente e in ambito clinico 1,14-16. Inoltre, ...

La spettrometria di massa (MS) a tempo di volo/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF) ha dimostrato di essere uno strumento rapido e affidabile per l'identificazione di batteri a livello di genere, specie e, in alcuni casi, di ceppo1-4. MALDI-TOF MS ionizza molecole biologiche (tipicamente proteine) che originano dalle superfici cellulari, dalle membrane intracellulari e dai ribosomi da cellule batteriche intere o estratti proteici1,5. I picchi risultanti formano modelli caratteristici o "impronte digitali" dei batteri analizzati1. L'identificazione dei batteri si basa su queste "impronte digitali" massa-carica. 
Due delle strategie di identificazione più comunemente utilizzate sono le strategie basate su librerie e quelle basate sulla bioinformatica1. Gli approcci basati su librerie prevedono il confronto degli spettri di massa di incognite con gli spettri di massa precedentemente raccolti di batteri noti in database/librerie per l'identificazione. Sono disponibili software disponibili in commercio, come i pacchetti software BioNumerics, Biotyper e SARACIS, nonché strumenti software open source, come SpectraBank6, per facilitare il confronto e la quantificazione della somiglianza tra gli spettri di massa di batteri sconosciuti e quelli di riferimento. Gli approcci basati sulla bioinformatica di solito si basano su genomi di batteri completamente sequenziati per l'identificazione. A differenza degli approcci basati su librerie che non implicano l'identificazione della natura biologica di particolari picchi, gli approcci basati sulla bioinformatica implicano l'identificazione delle proteine1. 
La maggior parte dei recenti studi basati sulle impronte digitali MALDI ha utilizzato approcci basati su librerie per identificare i batteri1. Gli approcci basati su librerie richiedono la costruzione di database e il confronto della somiglianza tra gli spettri di massa. Gli studi dimostrano che molte procedure sperimentali, come il terreno3,7, il tempo di coltivazione8, il metodo di preparazione del campione3 e la matrice utilizzata9, influenzano gli spettri di massa ottenuti. Inoltre, alcune specie e ceppi strettamente imparentati generano spettri con solo sottili differenze. Pertanto, gli approcci basati su librerie richiedono procedure rigorosamente standardizzate per generare spettri di massa altamente riproducibili tra le repliche. Piccole variazioni nei protocolli possono compromettere l'efficacia dell'identificazione, specialmente a livello di sottospecie e ceppo1,3,10. Tuttavia, né i database di riferimento forniti dal produttore né i database personalizzati riportati includono procedure visivamente documentate per la costruzione del database e/o l'applicazione di una pipeline di analisi dei dati. Per questo motivo, l'obiettivo di questo lavoro è stato quello di sviluppare, applicare e dimostrare una procedura completa e dettagliata per l'identificazione batterica basata su libreria utilizzando MALDI-TOF MS. 
In questa dimostrazione, sono stati raccolti e importati nel software spettri di massa di 15 batteri isolati da un ambiente carsico (Kartchner Cavern, AZ, USA) per costruire un database di modelli. L'elaborazione dei dati e la pipeline di analisi sono state dettagliate utilizzando il database del modello. Infine, gli spettri di massa dei batteri codificati in cieco che sono stati selezionati casualmente da questi 15 batteri sono stati nuovamente raccolti e confrontati con gli spettri di riferimento nel database del modello per l'identificazione. I risultati mostrano che i batteri possono essere identificati correttamente in base ai coefficienti di somiglianza o ai potenziali biomarcatori/classi di picco.

<table><tbody><tr><td>Acido &alfa;-ciano-4-idrossi-cinnamico</td><td>ACROS Organics</td><td>163440050</td><td>&ge; 97%, CAS 28168-41-8</td></tr><tr><td>Software Bruker FlexControl</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>versione 3.0</td></tr><tr><td>Software Bruker FlexAnalysis</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>versione 3.0</td></tr><tr><td>Software Bionumerica</td><td>Matematica</td><td></td><td>applicata versione 7.1</td></tr></tbody></table>

l&#39;uso di maldi-tof spettrometria di massa e un database personalizzato per caratterizzare batteri indigeni ad un unico ambiente di cave (kartchner caverns, az, usa)

Use of MALDI-TOF Mass Spectrometry and a Custom Database to Characterize Bacteria Indigenous to a Unique Cave Environment (Kartchner Caverns, AZ, USA)

La spettrometria di massa MALDI-TOF ha dimostrato di essere uno strumento rapido e affidabile per l'identificazione di batteri a livello di genere e specie e, in alcuni casi, di ceppo. Sono stati sviluppati strumenti software disponibili in commercio e open source per facilitare l'identificazione; Tuttavia, in letteratura non è stata descritta alcuna pipeline di analisi dei dati universale/standardizzata. Qui, forniamo una dimostrazione completa e dettagliata delle procedure di identificazione batterica utilizzando uno spettrometro di massa MALDI-TOF. Gli spettri di massa sono stati raccolti da 15 diversi batteri isolati da Kartchner Caverns, AZ, USA, e identificati mediante sequenziamento dell'rDNA 16S. I database sono stati costruiti in BioNumerics 7.1. Sono state eseguite analisi di follow-up degli spettri di massa, tra cui analisi dei cluster, corrispondenza dei picchi e analisi statistiche. L'identificazione è stata eseguita utilizzando campioni codificati in cieco selezionati casualmente tra questi 15 batteri. Vengono presentati due metodi di identificazione: quelli basati sul coefficiente di somiglianza e quelli basati sui biomarcatori. I risultati mostrano che entrambi i metodi di identificazione possono identificare i batteri a livello di specie.

Le basi di dati costruiti in questa manifestazione ha avuto quattro livelli, dal più alto al più basso livello, tra cui "tutti i livelli", "Species", "replica biologica" e "replicare tecnici", rispettivamente (Figura 1A). La "replica tecnici" livello conteneva tutti gli spettri di pre-elaborato replicati tecnici. La "replica Biologica" e livelli di "specie" contenevano il (sommario) spettri composito. "Tutti i livelli" contenevano tutta la replica spettri tecnica così come tutti gli spettri composito. <...

Questo lavoro descrive in dettaglio le procedure per l'identificazione rapida dei batteri utilizzando MALDI-TOF MS. Le procedure di identificazione includono l'acquisizione dello spettro, la costruzione di database e le analisi di follow-up. Vengono presentati due metodi di identificazione, quelli basati sul coefficiente di somiglianza e quelli basati sui biomarcatori.

L&#39;uso di MALDI-TOF spettrometria di massa e un database personalizzato per caratterizzare batteri indigeni ad un unico ambiente di Cave (Kartchner Caverns, AZ, USA)

MALDI-TOF mass spectrometry has been shown to be a rapid and reliable tool for identification of bacteria at the genus and species, and in some cases, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sviluppare, applicare e dimostrare una procedura dettagliata per l'identificazione batterica basata su libreria utilizzando MALDI per la spettrometria di massa. Ciò si ottiene acquisendo prima gli spettri di massa dei batteri utilizzando uno spettrometro di massa maloff. In questo studio, vengono raccolti spettri di massa di 15 batteri isolati da un ambiente caustico, la forma dei picchi, i modelli caratteristici o le impronte digitali dei batteri analizzati.Questi spettri di massa vengono quindi importati nel software e viene costruito un database di modelli. Successivamente, gli spettri di massa di riferimento nel database del modello vengono elaborati e analizzati utilizzando l'analisi dei cluster, la corrispondenza dei picchi e l'analisi statistica. Infine, gli spettri di massa dei batteri codificati in cieco, che vengono selezionati casualmente da questi 15 batteri, vengono nuovamente raccolti e confrontati con gli spettri di riferimento nel database del modello per i risultati dell'identificazione, mostrano che i batteri possono essere identificati correttamente in base ai coefficienti di somiglianza o ai potenziali biomarcatori e classi di picco.Iniziare questa procedura con la deposizione di un microlitro di estratto proteico che non contiene cellule vitali su una piastra target maldi in acciaio inossidabile e lasciarla asciugare. Quindi sovrapporre l'estratto proteico essiccato con un microlitro di soluzione di matrice e lasciarlo asciugare. Quindi depositare un microlitro di CBR standard sulla piastra di destinazione dopo che si è asciugata, sovrapporre il CBR con un microlitro di soluzione di matrice e lasciarlo asciugare.Infine, depositare due microlitri di soluzione di matrice sulla piastra target come controllo negativo. Utilizzare lo spettrometro multiplo a massa dotato di laser ad azoto e azionato utilizzando il software di controllo Bruker flex. Raccogli ogni spettro di massa in modalità lineare positiva accumulando 500 colpi laser con incrementi di 100 colpi.Impostare la sorgente ionica di una tensione a 20, i kilovolt la sorgente ionica, due tensioni a 18,15 kilovolt e la tensione della lente a 9,05 kilovolt. Questi parametri sono specifici dello strumento e possono richiedere un'ottimizzazione. Impostare la massa per l'intervallo di carica per la valutazione automatica dello spettro da due a 20 kilodalton per carica.Quindi impostare la soglia minima di risoluzione su 100. Selezionare l'algoritmo di rilevamento del picco OID. Impostare la soglia del rapporto segnale/rumore su due e la soglia minima di intensità su 100.Infine, impostare il picco di accumulo su 500 per la progettazione del database. Creare un nuovo database in bio numerics 7.1 utilizzando la procedura guidata per il nuovo database. Creare quindi un tipo di esperimento dello spettro, ad esempio maldi, utilizzando i comandi nel pannello dei tipi di esperimento.Quindi, crea i livelli utilizzando il pannello di progettazione del database, vai al menu del database e aggiungi nuovi livelli utilizzando il comando livello aggiungi nuovo livello qui. Crea a livello di specie, a livello di replica biologica e a livello tecnico. Per importare gli spettri di massa grezzi.Innanzitutto, esportare gli spettri di massa grezzi come file di testo utilizzando l'analisi flessibile navigando nel menu file e facendo clic sul comando esporta spettro di massa. Quindi importare gli spettri di massa grezzi nel database a livello delle repliche tecniche. Pre-elabora gli spettri di massa grezzi importando e ricampionando utilizzando un algoritmo di adattamento quadratico.Quindi, esegui una sottrazione di base utilizzando un disco rotante con una dimensione di 50 punti, calcola il rumore utilizzando la trasformazione wavelet continua o CWT. Smussa gli spettri utilizzando una finestra di Kaiser con una dimensione della finestra di 20 punti e una beta di 10 punti. Quindi eseguire una seconda sottrazione di base utilizzando un disco rotante con una dimensione di 200 punti.Infine, rilevare i picchi utilizzando il CWT con un rapporto segnale/rumore minimo di 10 dopo la pre-elaborazione di modelli caratteristici sicuri di ogni spettro di massa, come elenchi di picchi, contenenti le dimensioni dei picchi, le intensità dei picchi e il rapporto segnale/rumore. Successivamente, creare spettri di massa compositi da spettri pre-elaborati utilizzando il comando riassunto nel menu di analisi. Scegli la replica biologica come livello target. Qui.Combina spettri di massa di 10 repliche tecniche della stessa colonia per ottenere uno spettro di massa composito per quella colonia, ottenendo tre spettri di massa compositi per quell'isolato a livello di replicato biologico. Infine, riassumi i tre spettri compositi per creare uno spettro composito per quell'isolato a livello di specie. Per eseguire l'analisi dei cluster basata sulla somiglianza e la scala multidimensionale, creare gruppi con colori.Innanzitutto, selezionare i tre spettri di massa compositi biologici e fare clic sul comando crea nuovo gruppo da selezione nel menu del gruppo per creare un gruppo per l'isolato corrispondente. Quindi progetta un colore utilizzato automaticamente per questi tre spettri di massa. Eseguire l'analisi dei cluster navigando nel menu di clustering e facendo clic sul comando calcola analisi cluster.Nelle impostazioni di confronto, pagina uno, selezionare la correlazione di Pearson e lasciare gli altri parametri come predefiniti. A pagina due, selezionare il metodo del gruppo di coppie non ponderate con media aritmetica. Quindi fare clic su Fine.Ottenere un grafico di scala multidimensionale utilizzando il comando di scala multidimensionale nel menu delle statistiche per eseguire la corrispondenza dei picchi. Fare clic sul tipo di spettro maldi nel pannello degli esperimenti. Quindi seleziona il layout.Mostra immagine, vengono mostrati i singoli picchi di spettri. Quindi, eseguire la corrispondenza dei picchi utilizzando il comando do peak matching nel menu spettri per identificare le classi di picco, eseguire il clustering bidirezionale facendo clic su matrice statistica. Estrazione dati. L'intensità dei picchi abbinati alle classi di picco è rappresentata come una mappa di calore per identificare i batteri utilizzando il metodo basato sul coefficiente di somiglianza, creare un confronto e generare un rogramma basato sugli spettri di massa a livello di replica tecnica come eseguito per l'analisi dei cluster, salvare il rogramma per il confronto della somiglianza.Selezionate uno spettro di massa sconosciuto e fate clic sull'analisi. Identificare le voci selezionate. Viene visualizzata la finestra di dialogo di identificazione.Selezionare il tipo di classificatore basato sul confronto e fare clic su Avanti. Nella pagina successiva, scegli il grammo salvato come confronto di riferimento, quindi fai clic su Avanti. Scegli la somiglianza di base come metodo di identificazione e di nuovo, fai clic su Avanti, scegli la somiglianza massima come metodo di punteggio.Digitare i valori di soglia e i valori di differenza minima appropriati per ogni parametro, quindi fare clic su Avanti. Una volta completati i calcoli, nel pannello dei risultati viene visualizzata la finestra di identificazione. Vengono elencati i membri del database che corrispondono meglio all'ignoto.Un rogramma basato sull'analisi del clustering mostra una somiglianza tra ciascun isolato nel database. Il set di dati contiene spettri di 15 specie diverse con tre spettri compositi per ciascuna specie. L'analisi dei cluster a due vie può aiutare i ricercatori a identificare potenziali biomarcatori per una specie o ceppi all'interno di una specie.Qui, il picco di intensità è rappresentato dai colori, il verde significa bassa intensità e il rosso significa alta intensità. Infine, sulla base di queste analisi, lo spettro di massa di un'incognita può essere confrontato con il grammo e si ottiene un'identificazione basata sul coefficiente di somiglianza.

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L'applicazione di desorbimento laser assistita da matrice tempo / ionizzazione di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa (MS) direttamente emocoltura brodo velocizza l'identificazione dei batteri. Il metodo proposto è un metodo rapido e affidabile per l'identificazione dei batteri Gram negativi direttamente dalla cultura sangue brodo.

Rapida identificazione dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura Uso MALDI-TOF

La spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF MS) e le tecniche molecolari (sequenziamento genico dell'rRNA 16S) consentono l'identificazione di patogeni batterici rari nella diagnostica di routine. L'obiettivo di questo protocollo risiede nella combinazione di entrambe le tecniche che porta a dati più accurati e affidabili.

Identificazione di batteri patogeni rari da 16S rRNA sequenziamento del gene e MALDI-TOF MS

IDBac è una pipeline di bioinformatica a base di spettrometria di massa open source che integra dati provenienti da proteine intatte e spettri di metaboliti specializzati, raccolti su materiale cellulare raschiato da colonie batteriche. La conduttura consente ai ricercatori di organizzare rapidamente centinaia di migliaia di colonie batteriche in gruppi tassonomici putativi e di differenziarle ulteriormente in base alla produzione specializzata di metaboliti.

Utilizzo della pipeline OPEN-Source MALDI TOF-MS IDBac per l'analisi dei dati sulle proteine microbiche e sui metaboliti specializzati

Un protocollo di estrazione del genoma guidato dalla spettrometria di massa è stabilito e descritto qui. Si basa sulle informazioni sulla sequenza genomica e sull'analisi LC-MS/MS e mira a facilitare l'identificazione di molecole da complessi estratti microbici e vegetali.

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining come strumento per scoprire nuovi prodotti naturali

Qui presentiamo un protocollo per la rapida identificazione di proteine prodotte da batteri patogeni sequenziati genomicamente utilizzando la spettrometria di massa tandem MALDI-TOF-TOF e l'analisi proteomica top-down con software sviluppato internamente. Gli ioni proteici metastabili si frammentano a causa dell'effetto dell'acido aspartico e questa specificità viene sfruttata per l'identificazione delle proteine.

Identificazione di proteine immunitarie antibatteriche in Escherichia coli utilizzando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e analisi proteomica top-down

Viene dimostrato un nuovo metodo di preparazione del campione per l'analisi di macrocolonie batteriche a base di agar mediante spettrometria di massa con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice.

Studio della cooperazione microbica mediante spettrometria di massa per immagini Analisi di colonie batteriche cresciute su agar e nei tessuti durante l'infezione

Questo protocollo consente una valutazione rapida ed economica della composizione microbica nei prodotti lattiero-caseari combinando la culturromica con MALDI-TOF MS. Fornisce risultati di tassonomia paragonabili al sequenziamento dell'rRNA 16S con un tempo di risposta più breve rispetto ai metodi di coltura tradizionali.

Valutazione della Sicurezza Microbica dei Caseifici mediante Profilazione Proteomica Batterica tramite Approccio MALDI

Questo video dimostra la preparazione di un ultra-sottile matrice / analita strato per l'analisi dei peptidi e proteine ​​da Matrix-Assisted Laser ionizzazione di desorbimento spettrometria di massa (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

Ridotta espressione / assenza di PMS2 e / o ERCC1 nelle cripte intero è un evento frequente nel raggio di 10 cm su ogni lato degli adenocarcinomi del colon, probabilmente in base ad un difetto del campo con elevata mutevolezza e la progressione del cancro. Carenza di Ku86 o CcOI è molto meno frequente in questi difetti del campo.

PMS2 carente, ERCC1, Ku86, CcOI in Difetti del campo durante la progressione a tumore del colon

Standard di isotopi stabili e cattura da anticorpi anti-peptide (SISCAPA) affinità arricchimento coppie di peptidi con diluizione degli isotopi stabili e spettrometria di massa (MRM-MS) per fornire la misura quantitativa di peptidi come surrogati per le loro rispettive proteine. Qui descriviamo il protocollo utilizzando particelle magnetiche in un formato parzialmente automatizzato.

Quantificazione delle proteine ​​Utilizzando Arricchimento Peptide immunoaffinità Accoppiato con spettrometria di massa

Scopri l'identificazione batterica rapida con MALDI-TOF MS e database personalizzato per batteri di ambienti cavernosi. Questo metodo consente analisi accurate tramite spettri di massa e analisi statistica.

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