Stimolazione optogenetic del nervo uditivo
8 ottobre 2014
Gli impianti cocleari (IC) consentire l'udito attraverso la stimolazione elettrica diretta del nervo uditivo. Tuttavia, la scarsa frequenza e la risoluzione intensità limita la qualità di ascoltare con IC. Qui si descrive la stimolazione optogenetic del nervo uditivo nei topi come una strategia alternativa per la ricerca e lo sviluppo uditivo futuri CI.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stimolare otticamente il nervo uditivo degli animali con neuroni gangliari spirale optogeneticamente modificati. Ciò si ottiene preparando prima un micro stimolatore LED blu o una fibra ottica accoppiata a un laser blu. Il passo successivo della procedura consiste nel valutare la coclea utilizzando un approccio microchirurgico retroauricolare.
Il terzo passo consiste nel posizionare lo stimolatore ottico per registrare le risposte del tronco encefalico evocate otticamente. Il passaggio finale consiste nell'accedere al colus inferiore per registrare l'attività evocata otticamente. In definitiva, i risultati possono mostrare una stimolazione efficace del sistema uditivo attraverso registrazioni delle risposte uditive del tronco encefalico e dei potenziali di campo locale.
Nel collicolo inferiore Stimolazione optogenetica del nervo auditor. In alternativa all'elettrico, gli impianti cocleari promettono una migliore risoluzione della frequenza e dell'intensità. Questo è di grande interesse per la ricerca degli auditor, ma le implicazioni di questa tecnica si estendono verso un migliore ripristino dell'udito nei sordi.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca uditiva, come il ruolo dell'attività del pattern per il perfezionamento dello sviluppo ortopedico, il requisito dell'integrazione spettrale nella localizzazione cellulare e l'entità dell'interazione tra le proiezioni di frame specifiche per frequenza. Nel sistema uditivo centrale, la dimostrazione visiva della procedura è fondamentale poiché il posizionamento e l'orientamento appropriati del micro LED o della fibra ottica sono difficili da imparare. Il micro stimolatore LED utilizza un LED blu con una superficie attiva di 200 micron quadrati per saldare prima i fili al micro LED.
Successivamente, utilizzando una resina epossidica incapsulare il LED e la sua connessione, lasciarlo asciugare durante la notte. Una volta induriti, far passare i fili attraverso un diametro esterno di un millimetro. Prendere in prestito il capillare in vetro silicato.
Il vetro garantisce stabilità meccanica e isolamento elettrico. Sigillare la giunzione del capillare e il LED rivestito di resina epossidica con più resina epossidica posizionare il capillare in modo che possa essere montato su un manipolatore. Ora controlla i collegamenti elettrici.
Per prima cosa, prepara tre fili di rame. Immergere un'estremità di ciascuna in un bagno di cloruro di sodio allo 0,9%. Quindi collegare le altre estremità a un amplificatore A BR.
Monitora il segnale con un oscilloscopio. Quindi, collega il micro LED allo stimolatore personalizzato per il test. Immergere il micro LED collegato allo stimolatore nella vasca da bagno e alimentare il LED per almeno 20 minuti.
Mentre stimola il LED, monitora l'oscilloscopio per gli artefatti. Eliminare eventuali LED difettosi. Anestetizzare un topo di età compresa tra quattro e 10 settimane.
Questo topo esprime l'opsina del canale due sotto la coscia 1,2 promotore 10 minuti. Dopo aver iniettato gli anestetici, controllare il riflesso di ritiro dell'animale per confermare un piano chirurgico di anestesia. Quindi applicare l'unguento sugli occhi e iniziare l'intervento chirurgico.
Innanzitutto, radere accuratamente l'area retroauricolare per avvicinarsi alla bullah, la cavità dell'orecchio medio piena d'aria. Posizionare il mouse su un termoforo sul lato chirurgico utilizzando una micro pinza. Sezionare attentamente i muscoli del collo, vale a dire il platisma, lo sternocleidomastoideo e gli scaleni.
Ora esponi la bolla. È una struttura ossea sferica con un anello sulla superficie dove si trova la membrana timpanica. Usando un ago da insulina, fai un foro appena sotto l'anello dal foro.
Eliminate l'osso che ricopre la bolla. Usa Ron fini e micro pinze esponendo l'auditorium professionale della coclea nel processo. Quindi, inizia la coclea. Stomia.
Per prima cosa rasare la capsula ossea senza interrompere il labirinto membranoso. Ora apri una piccola finestra da 500 a 800 micron sul secondo giro cocleare, lontano dall'arteria stagnata e dall'apertura dell'apice. L'apice potrebbe rompere la coclea e fratturare il modis.
Preparati a misurare le risposte uditive optogenetiche del tronco encefalico o OABR. Innanzitutto, inserire gli elettrodi ad ago nelle seguenti posizioni sotto il padiglione auricolare, sul vertice e sul retro vicino alle gambe con gli elettrodi collegati a un amplificatore. Amplifica il potenziale di differenza tra il vertice e l'ago sottocutaneo mastoideo.
Campionare a 50 kilohertz e filtrare le risposte tra uno e 10.000 hertz per la stimolazione transcocleare. Monta un micro LED o una fibra, accoppiato al micro LED afferrato da un manipolatore meccanico. Posizionarlo con cura in posizione.
Visualizza il potenziale di differenza su un oscilloscopio. Posizionarlo vicino alla configurazione di registrazione in modo che sia facile ottimizzare la posizione dello stimolatore ottico. Utilizza la media del segnale e memorizza i dati su un computer per l'analisi offline.
Ora ottimizza la posizione e l'orientamento del micro LED utilizzando le risposte a impulsi di corrente da tre a 10 millisecondi da uno a cinque hertz. Un'altra opzione è la stimolazione laser con un laser a onda continua da 473 nanometri collegato a una fibra ottica da 250 micrometri. Ciò richiede un rapido controllo analogico della potenza del laser o di un dispositivo ottico attivo.
Con un otturatore rapido, posizionare la fibra con un micro manipolatore direttamente sulla stomia della coclea e fissarla con cemento dentale per la stimolazione intracocleare. Inserire la fibra attraverso la finestra rotonda nella s Scala.Tempe. Ottimizza la posizione e l'orientamento della fibra suscitando risposte con impulsi da tre a 10 millisecondi da 10 a 30 milliwatt da uno a cinque hertz.
Il posizionamento dello stimolatore è il passaggio più critico del protocollo. Il micro ED o la fibra ottica devono essere pazientemente riposizionati fino a quando l'OABR non è evidente. Una volta ottenute buone risposte optogenetiche e uditive del tronco encefalico, fissare la fibra con colla cianoacrilica o con cemento dentale.
Per questo protocollo, utilizzare un telaio stereotassico e preparare un topo aprendo il cranio sopra il colono inferiore. Utilizzando un microscopio, posizionare una sonda di registrazione sul colono inferiore e inserirla in modo che il canale più in alto sia appena visibile in superficie. Ora, amplifica il potenziale di differenza tra i singoli canali dell'array di registrazione e la vite di riferimento e l'osso parietale.
Utilizzare una frequenza di campionamento di 32 kilohertz, un filtro passa-basso da 300 hertz e salvare i dati. Una stomia ottimale per la coclea è fondamentale e aumenta la probabilità di successo dell'esperimento. Ciò significa che la finestra è piccola e regolare e non vi sono lesioni alle strutture cocleari interne.
Ad esempio, il sanguinamento indica un danno della SSIS STR utilizzando il canale Rodin due topi transgenici. Il canale Rodin 2 è espresso nei neuroni a spirale all'interno dell'illuminazione a luce blu della coclea tramite micro LED o laser suscita grandi A BR optogenetici, che differiscono dagli A BR acustici per ampiezza e forma d'onda optogenetica. Un BR ha ampiezze maggiori rispetto all'optogenetico acustico A BR.
Un BR è quindi più paragonabile all'A BR elettrico. Possono entrambi reclutare più neuroni gangliari spirale o suscitare un'attivazione più sincronizzata dei neuroni gangliari spirali. La propagazione dell'attività attraverso la via uditiva è stata verificata mediante registrazioni extracellulari nel sistema uditivo centrale. Ad esempio, la stimolazione optogenetica della coclea ha suscitato attività neurale nel mesencefalo uditivo.
La stabilità meccanica e l'isolamento elettrico sicuro degli stimolatori micro LED, nonché l'evitare un flusso eccessivo di carbonio, sono tutti fattori critici per il successo dell'uso dell'optogenetica della coclea. Mentre si tenta questo professionista, è importante ricordare di evitare di ferire l'arteria distro nell'Ebola. Una volta masterizzate, le registrazioni dal collicolo inferiore possono essere eseguite in circa tre ore se eseguite correttamente.
Seguendo questa procedura a, è possibile eseguire metodi come le registrazioni di singole unità nel collicolo inferiore. La stimolazione optogenetica della via uditiva aprirà la strada alle ricerche nel campo delle neuroscienze uditive per porre domande che in precedenza non potevano essere affrontate con la stimolazione acustica o elettrica. Speriamo anche che questa tecnica si traduca nella riabilitazione clinica della disabilità uditiva.
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Panoramica
In questo articolo si discute l'uso della stimolazione optogenetica del nervo uditivo nei topi come approccio innovativo per la ricerca uditiva. Il metodo mira a superare i limiti degli impianti cocleari fornendo una migliore risoluzione in frequenza e intensità.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Ricerca uditiva
- Optogenetica
Sfondo
- Gli impianti cocleari stimolano il nervo uditivo ma presentano delle limitazioni.
- L'optogenetica consente un controllo preciso dell'attività neuronale.
- Questo studio esplora un nuovo metodo per la stimolazione uditiva.
- Per gli esperimenti vengono utilizzati modelli animali, in particolare topi.
Scopo dello studio
- Stimolare otticamente il nervo uditivo mediante neuroni modificati.
- Valutare l'efficacia delle tecniche optogenetiche nella ricerca uditiva.
- Migliorare la qualità della stimolazione uditiva rispetto ai metodi tradizionali.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di un microstimolatore LED blu o di una fibra ottica con laser blu.
- Valutazione della coclea mediante un approccio microchirurgico retroauricolare.
- Posizionamento dello stimolatore ottico per la registrazione delle risposte del tronco encefalico.
- Accesso al collicolo inferiore per la registrazione dell'attività evocata otticamente.
Risultati principali
- È stata raggiunta una stimolazione ottica efficace del sistema uditivo.
- Sono stati ottenuti registrazioni delle risposte uditive del tronco encefalico.
- Sono stati registrati potenziali di campo locali, indicativi di una stimolazione efficace.
- Il metodo mostra potenzialità per la ricerca futura nell'ambito dell'udito e lo sviluppo di protesi cocleari.
Conclusioni
- La stimolazione optogenetica può migliorare le metodologie di ricerca nell'ambito uditivo.
- Questo approccio potrebbe portare a tecnologie per impianti cocleari più avanzate.
- Sono necessari ulteriori studi per esplorarne appieno il potenziale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale per gli Esperti
La stimolazione optogenetica del nervo uditivo affronta un limite fondamentale degli impianti cocleari—una scarsa risoluzione in frequenza e intensità dovuta alla diffusione ampia della corrente—permettendo un'attivazione spazialmente confinata dei neuroni del ganglio spirale. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistica nelle neuroscienze uditive consentendo un'analisi precisa dei modelli di codifica neuronale e dei contributi specifici dei percorsi alla percezione uditiva. Per la ricerca e sviluppo in biotecnologie e farmaceutica, fornisce un sistema rilevante per la patologia per valutare l'interazione con il bersaglio e gli esiti funzionali in modelli preclinici di perdita dell'udito, migliorando la capacità predittiva nello sviluppo terapeutico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando il ruolo di specifiche popolazioni neuronali nell'attivazione e nel perfezionamento del percorso uditivo.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico mediante il controllo specifico per tipo cellulare dei neuroni del ganglio spirale, riducendo gli effetti fuori bersaglio negli studi di validazione del target.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nel target collegando l'attivazione optogenetica a risposte misurabili a valle nel mesencefalo uditivo, fornendo indicazioni per decisioni di avanzamento o interruzione del progetto.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera risposte uditivo-troncoencefaliche optogenetiche (oABR) e potenziali di campo locali come output standardizzati per lo screening di composti o genetico.
- Riproducibilità: Permette una stimolazione affidabile e ripetibile mediante sistemi micro-LED o laser accoppiati a fibra ottica con parametri di impulso definiti (3–10 ms, 1–5 Hz) per un'acquisizione dati costante.
- Scalabilità: Compatibile con metodi di somministrazione sia mediante cocleostomia sia mediante finestra rotonda, consentendo l'adattamento attraverso diversi modelli sperimentali e l'integrazione nei flussi di lavoro.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Utilizza topi transgenici che esprimono la Channelrodopsina-2 nei neuroni del ganglio spirale, creando un modello che rispecchia la popolazione cellulare bersaglio della terapia con impianto cocleare.
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica dimostrando la propagazione dell'attività evocata optogeneticamente lungo il percorso uditivo fino al collicolo inferiore.
- Progressione con rischio calibrato: Fornisce informazioni meccanicistiche sulla sincronizzazione e il reclutamento delle popolazioni neurali, contribuendo a ridurre i rischi associati alle protesi uditive e alle strategie di neuromodulazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla valutazione preclinica, offrendo una piattaforma per valutare l'attivazione del percorso uditivo con precisione cellulare.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo un controllo preciso nel tempo e nello spazio dell'attività dei neuroni del ganglio spirale, per analizzare i meccanismi di codifica nel sistema uditivo.
- Screening: Fornisce letture neurofisiologiche quantitative pronte per saggi (ampiezza, forma d'onda e latenza dell'oABR) che permettono il confronto tra diverse modalità di stimolazione e condizioni genetiche.
- Analisi: Genera segnali elettrofisiologici (risposte uditive del tronco encefalico, potenziali di campo locali) adatti all'analisi statistica e al confronto tra gruppi in studi preclinici.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica verificando la propagazione dell'attività verso le strutture uditive centrali, in linea con misure di esito allineate ai biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per le neuroscienze uditive, applicabile in diversi studi sul ripristino dell'udito, sulla plasticità neuronale e sull'elaborazione sensoriale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica nella codifica neurale uditiva mediante stimolazione specifica per tipo cellulare.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione attraverso parametri definiti di stimolazione ottica e percorsi chirurgici di accesso (cochleotomia, finestra rotonda) per ottenere risultati riproducibili.
- Valore strategico: Informa decisioni più accurate su prosegui/non prosegui fornendo dati funzionali ad alta risoluzione che superano i limiti della stimolazione elettrica nella codifica di frequenza e intensità.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio dei candidati terapeutici uditivi validando l'interazione con il bersaglio e gli effetti specifici per via sin dall'inizio della fase scoperta.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in optogenetica, microchirurgia ed elettrofisiologia per il targeting virale o transgenico dei neuroni del ganglio spirale e l'accesso alla coclea.
- È dipendente da strumentazione specifica, tra cui micro-LED, laser accoppiati a fibra ottica, sistemi stereotassici e amplificatori in grado di rilevare segnali a livello di microvolt.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda le tecniche chirurgiche (ad esempio, dimensioni della cocleostomia, posizionamento) e i protocolli di stimolazione ottica, al fine di garantire la riproducibilità tra laboratori.
- Comporta considerazioni di adattamento nel passaggio da modelli murini a specie di dimensioni maggiori, in particolare per quanto riguarda l'efficienza della somministrazione della luce e la dispersione nei tessuti.
- È limitato dalla necessità di un accesso genetico ai neuroni del ganglio spirale, il che potrebbe richiedere l'uso di vettori virali o linee transgeniche non disponibili universalmente tra ceppi o specie.
Domande frequenti sul biotecnologico farmaceutico
Chapters in this video
0:05
Title
1:54
Preparing the μLED Stimulator
3:31
Cochleostomy for Transcochlear Stimulation
5:12
Implanting the Stimulator and Recording Optogenetic Auditory Brainstem Responses (oABR)
7:40
Recording Optically Evoked Local Field Potentials
8:21
Results: Comapring Auditory Brainstem Response and Signal Propagation from oABR
9:46
Conclusion
