Un'introduzione alla neurobiologia dello sviluppo

An Introduction to Developmental Neurobiology

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Neuroscience

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An Introduction to Developmental Neurobiology

1.12: Neuronal Transfection Methods

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09:24 min

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April 30, 2023

Overview

Le neuroscienze dello sviluppo sono un campo che esplora come si forma il sistema nervoso, dalle prime fasi embrionali fino all’età adulta. Sebbene sia noto che le cellule progenitrici neurali seguono stadi prevedibili di proliferazione, differenziazione, migrazione e maturazione, i meccanismi che controllano la progressione attraverso ogni stadio non sono completamente compresi. Studiare lo sviluppo non è importante solo per capire come vengono assemblate le strutture complesse, ma anche per caratterizzare e trattare i disturbi dello sviluppo. Poiché i processi di riparazione delle lesioni sono simili a quelli che si verificano nello sviluppo, questo campo è anche una promettente fonte di informazioni su quando e come i tessuti del sistema nervoso si rigenerano.

Questo video fornisce una breve panoramica del campo delle neuroscienze dello sviluppo, compresi alcuni esperimenti chiave che hanno fatto avanzare la nostra comprensione dei meccanismi che controllano la formazione del tessuto neurale precoce e l’ulteriore specializzazione di quelle cellule in sottoinsiemi discreti di neuroni. La discussione si concentra su domande importanti che i biologi dello sviluppo stanno ponendo e quindi dimostra alcuni dei metodi che usano per indagare su queste domande. Infine, vengono presentate le applicazioni delle tecniche per fornire informazioni su cosa significhi essere un neuroscienziato dello sviluppo oggi. La gamma di esperimenti dimostrati include la manipolazione genetica di cervelli embrionali intatti, la differenziazione mirata delle cellule staminali in cellule del sistema nervoso e tecniche di colorazione che consentono la quantificazione di specifici eventi di sviluppo, come la formazione di nuove connessioni tra i neuroni.

Procedure

La neurobiologia dello sviluppo esplora come alcune cellule embrionali precoci possono trasformarsi in un sistema nervoso organizzato in modo complesso che controlla un intero organismo.

Gli scienziati in questo campo sono interessati a come le cellule assumono identità specifiche, migrano in regioni definite e si connettono per formare un sistema funzionale. Questi processi sono importanti per capire come funziona il sistema nervoso, nonché la diagnosi e il trattamento di una vasta gamma di malattie neurologiche radicate in uno sviluppo anormale.

Questo video ti porterà in un breve tour della storia della neurobiologia dello sviluppo, delineerà le domande chiave nel campo ed esplorerà i metodi di spicco utilizzati per rispondere a tali domande. Infine, daremo un’occhiata ad alcune applicazioni pratiche della ricerca sul neurosviluppo.

Iniziamo con alcuni studi di riferimento dalla storia della neurobiologia dello sviluppo.

La prima ricerca sullo sviluppo neurologico risale al 19 ° secolo. Nel 1880, Wilhelm His stabilì lo studio dell’istogenesi, o delle origini embrionali del tessuto. È stato una delle prime persone a guardare lo sviluppo di neuroni estendere processi come assoni e dendriti.

Nel 1924, gli embriologi Hans Spemann e Hilde Mangold studiarono la funzione di un gruppo di cellule noto come l’organizzatore di Spemann. Hanno scoperto che il trapianto dell’organizzatore su un altro embrione ha indotto la formazione di tessuto neurale secondario.

Poi, nel 1950, Rita Levi-Montalcini e Stanley Cohen osservarono che il trapianto di pezzi di tumori sullo sviluppo di embrioni di pollo portava a una rapida crescita dei neuroni. Hanno ipotizzato che il tumore secernesse una sostanza che ha causato questa crescita e presto hanno identificato quella proteina come fattore di crescita nervosa, o NGF, che è essenziale per la sopravvivenza dei neuroni.

In un altro studio sui trapianti, Nicole Le Douarin ha sostituito parti di embrioni di pulcino con quelli di quaglie. Seguendo le cellule di quaglia attraverso lo sviluppo, ha dimostrato che un gruppo altamente migratorio di cellule, noto come cresta neurale, dà origine a nervi periferici maturi.

Alcuni anni dopo, Pasko Rakic ha studiato come le cellule del sistema nervoso centrale si dispongono in strutture altamente ordinate durante lo sviluppo. Rakic ha etichettato le cellule in divisione nello sviluppo di feti con nucleotidi radioattivi, permettendogli di determinare quando sono nate le cellule cerebrali e dove la loro destinazione finale era nel cervello maturo.

Durante gli ultimi decenni del 20 ° secolo, è emersa una nuova era di ricerca che si è concentrata sui segnali cellulari e molecolari che guidano lo sviluppo del sistema nervoso.

Ad esempio, a metà degli anni ’90, Tom Jessell ha dimostrato che alcuni fattori di trascrizione, o proteine che aiutano a controllare l’espressione genica, hanno influenzato lo sviluppo di sottotipi unici di neuroni nel midollo spinale del topo in via di sviluppo. A seguito di questo lavoro, i ricercatori di oggi stanno ancora identificando nuovi geni che controllano lo sviluppo neurale.

Ora che hai visto alcuni punti salienti storici, esaminiamo alcune domande chiave nella moderna neurobiologia dello sviluppo.

Molti ricercatori studiano il pattern e le specifiche del destino delle cellule del sistema nervoso. Ad esempio, sono interessati alla programmazione genetica che guida le prime cellule staminali a differenziarsi in neuroni o glia, che sono le cellule di supporto del sistema nervoso. Possono anche studiare segnali secreti che influenzano identità più specializzate all’interno di una classe di cellule o in luoghi specifici.

Un altro obiettivo importante è come i neuroni in via di sviluppo e la glia sono in grado di organizzarsi e assemblarsi nel sistema nervoso maturo. Alcuni ricercatori studiano la dinamica citoscheletriche delle cellule che migrano dalla loro origine al sito in cui funzionano. Altri sono interessati a come i segnali provenienti dall’ambiente extracellulare influenzano il comportamento migratorio.

I neuroscienziati dello sviluppo valutano anche come le connessioni tra le cellule si formano e si perfezionano nel corso dello sviluppo. Alcuni studi si concentrano sulla funzione dei recettori di guida degli assoni, che sono proteine di superficie cellulare che rilevano segnali esterni e guidano gli assoni in via di sviluppo, o neuriti, alle loro cellule bersaglio. Un altro focus è lo studio delle connessioni fisiche e chimiche coinvolte nella sinaptogenesi, che è la formazione di nuove connessioni di segnalazione, o sinapsi, tra le cellule.

Ora, diamo un’occhiata ad alcuni metodi importanti utilizzati per rispondere ad alcune di queste domande sul neurosviluppo.

Per studiare il controllo genetico dell’identità cellulare e del pattern del sistema nervoso, è utile manipolare l’espressione di geni specifici nello sviluppo degli embrioni. Un metodo popolare è l’elettroporazione in utero, in cui il DNA esogeno viene consegnato nel cervello dei roditori in via di sviluppo. Esponendo l’utero di un DNA di topo anestetizzato e gravido può essere iniettato nel cervello embrionale e la corrente applicata per forzare il DNA nelle cellule circostanti. A seconda dell’esperimento, il materiale elettroporated può essere utilizzato per promuovere l’espressione genica o prevenirla, consentendo ai ricercatori di esaminare l’impatto delle singole proteine sullo sviluppo del cervello.

Il tessuto del sistema nervoso centrale espiantato è comunemente usato per studiare la migrazione cellulare durante lo sviluppo. Questa tecnica prevede la dissezione di piccoli pezzi di cervello o midollo spinale e la loro coltura in vitro. Uno dei principali vantaggi di questo approccio è che il tessuto è altamente accessibile per catturare i movimenti cellulari tramite l’imaging time-lapse. Inoltre, gli effetti di molecole specifiche sulla migrazione possono essere facilmente studiati negli espianti attraverso l’applicazione di fattori di crescita o inibitori farmacologici ai mezzi di coltura.

Per studiare le molecole essenziali per la formazione delle reti neuronali, è possibile utilizzare l’immunoistochimica. Questa tecnica sfrutta la specificità degli anticorpi per marcare la posizione di proteine specifiche nelle cellule e nei tessuti. La visualizzazione della localizzazione delle proteine utilizzando la microscopia fluorescente può aiutare i ricercatori a fare ipotesi su come queste molecole influenzano la formazione e la funzione di strutture come la sinapsi.

Ora che hai familiarità con alcuni approcci allo studio delle neuroscienze dello sviluppo, diamo un’occhiata alle applicazioni di questa ricerca nei laboratori di oggi.

Uno degli obiettivi principali dello studio del neurosviluppo è capire come vengono determinate l’identità e la morfologia cellulare. Per studiare il controllo genetico dello sviluppo dei neuroni, questi ricercatori hanno fornito costrutti di knockdown genico nel sistema nervoso del pulcino in via di sviluppo tramite elettroporazione. I neuroni elettropoati all’interno del tubo neurale sono stati anche etichettati mediante iniezione di colorante, in modo che la morfologia degli assoni potesse essere confrontata tra il controllo e le cellule geneticamente modificate.

Per studiare come i neuroni stabiliscono connessioni, questi ricercatori hanno coltivato neuroni estratti da giovani cuccioli di ratto. Dopo diversi giorni in coltura, le cellule sono state fissate e colorate con anticorpi specifici per le proteine sinaptiche, consentendo la quantificazione della formazione di sinapsi in più condizioni sperimentali, come la sovraespressione genica o la coltura in mezzo di crescita modificato.

Utilizzando la loro conoscenza del programma che guida lo sviluppo neurale, i ricercatori di oggi possono ora forzare le prime cellule embrionali, come le cellule staminali, lungo specifici percorsi di differenziazione in vitro. Questi ricercatori hanno trattato le cellule staminali umane con il derivato della vitamina A, l’acido retinoico, che ha portato a una ridotta espressione dei fattori di trascrizione che mantengono l’identità delle cellule staminali e una maggiore espressione dei marcatori neuronali. Questa tecnica fornisce ai ricercatori una preziosa fonte di neuroni umani per studiare i meccanismi alla base delle malattie neurologiche.

Hai appena visto l’introduzione di JoVE alle neuroscienze dello sviluppo. Questo video ha esaminato i punti salienti storici, le domande chiave poste dai neuroscienziati dello sviluppo e alcune delle tecniche che usano.

Grazie per l’attenzione!

Transcript

Developmental neurobiology explores how a few early embryonic cells can transform into an intricately organized nervous system that controls an entire organism.

Scientists in this field are interested in how cells take on specific identities, migrate to defined regions, and connect to form a functional system. These processes are important for understanding how the nervous system functions as well as the diagnosis and treatment of a broad range of neurological diseases rooted in abnormal development.

This video will take you on a brief tour of the history of developmental neurobiology, outline key questions in the field, and explore prominent methods used to answer those questions. Finally, we’ll have a look at some practical applications of neurodevelopmental research.

Let’s begin with some landmark studies from the history of developmental neurobiology.

Early neurodevelopmental research dates back to the 19th century. In the 1880s, Wilhelm His established the study of histogenesis, or the embryonic origins of tissue. He was one of the first people to watch developing neurons extend processes like axons and dendrites.

In 1924, embryologists Hans Spemann and Hilde Mangold studied the function of a cluster of cells known as the Spemann organizer. They found that the transplantation of the organizer to another embryo induced the formation of secondary neural tissue.

Then in the 1950’s, Rita Levi-Montalcini and Stanley Cohen observed that transplanting pieces of tumors onto developing chicken embryos led to rapid neuron growth. They speculated that the tumor secreted a substance that caused this growth, and soon identified that protein as nerve growth factor, or NGF, which is essential to neuron survival.

In another transplant study, Nicole Le Douarin replaced parts of chick embryos with those from quails. By tracking the quail cells through development, she showed that a highly migratory group of cells, known as the neural crest, gives rise to mature peripheral nerves.

A few years later, Pasko Rakic studied how cells of the central nervous system arrange themselves into highly ordered structures during development. Rakic labeled dividing cells in developing fetuses with radioactive nucleotides, allowing him to determine when brain cells were born and where their final destination was in the mature brain.

During the last decades of the 20th century, a new era of research emerged that focused on the cell and molecular signals guiding nervous system development.

For example, in the mid ‘90s, Tom Jessell showed that certain transcription factors, or proteins that help control gene expression, influenced the development of unique subtypes of neurons in the developing mouse spinal cord. Following on this work, today’s researchers are still identifying new genes that control neural development.

Now that you’ve seen a few historical highlights, let’s go over some key questions in modern developmental neurobiology.

Many researchers study patterning and fate specification of nervous system cells. For example, they are interested in the genetic programming that guides early stem cells to differentiate into either neurons or glia, which are the support cells of the nervous system. They may also investigate secreted signals that influence more specialized identities within a class of cells or in specific locations.

Another major focus is how developing neurons and glia are able to organize themselves and assemble into the mature nervous system. Some researchers study cytoskeletal dynamics of cells migrating from their origin to the site at which they function. Others are interested in how signals from the extracellular environment influence migratory behavior.

Developmental neuroscientists also evaluate how connections between cells are formed and refined over the course of development. Some studies focus on the function of axon guidance receptors, which are cell surface proteins that detect external cues and guide developing axons, or neurites, to their target cells. Another focus is the study of the physical and chemical connections involved in synaptogenesis, which is the formation of new signaling connections, or synapses, between cells.

Now, let’s look at a few prominent methods used to answer some of these neurodevelopmental questions.

To study the genetic control of cell identity and nervous system patterning, it is helpful to manipulate the expression of specific genes in developing embryos. One popular method is in utero electroporation, in which exogenous DNA is delivered into the brain of developing rodents. By exposing the uterus of an anesthetized, pregnant mouse DNA can be injected into the embryonic brains and current applied to force the DNA into surrounding cells. Depending on the experiment, electroporated material can be used to either promote gene expression or prevent it, allowing researchers to examine the impact of individual proteins on brain development.

Explanted central nervous system tissue is commonly used to study cell migration during development. This technique involves dissecting small pieces of brain or spinal cord and culturing them in vitro. A major advantage to this approach is that the tissue is highly accessible for capturing cell movements via time-lapse imaging. Additionally, the effects of specific molecules on migration can easily be studied in explants through application of growth factors or pharmacological inhibitors to the culture media.

To study the molecules that are essential to the formation of neuronal networks, immunohistochemistry can be used. This technique takes advantage of the specificity of antibodies to mark the location of specific proteins in cells and tissues. Visualization of protein localization using fluorescent microscopy can help researchers make hypotheses regarding how these molecules influence the formation and function of structures like the synapse.

Now that you’re familiar with some approaches to studying developmental neuroscience let’s look at applications of this research in labs today.

A major goal of the study of neurodevelopment is to figure out how cell identity and morphology are determined. To study the genetic control of neuron development, these researchers delivered gene knockdown constructs into the developing chick nervous system via electroporation. Electroporated neurons within the neural tube were also labeled by dye injection, so that axon morphology could be compared between control and genetically altered cells.

To study how neurons establish connections, these researchers cultured neurons extracted from young rat pups. After several days in culture, cells were fixed and stained with antibodies specific to synaptic proteins, allowing for quantification of synapse formation under multiple experimental conditions, such as gene overexpression, or culture in modified growth medium.

Using their knowledge of the program driving neural development, today’s researchers can now force early embryonic cells, like stem cells, down specific differentiation pathways in vitro. These researchers treated human stem cells with the vitamin A derivative, retinoic acid, which resulted in reduced expression of transcription factors that maintain stem cell identity and enhanced expression of neuronal markers. This technique provides researchers with a valuable source of human neurons for investigating the mechanisms behind neurological disease.

You’ve just watched JoVE’s introduction to developmental neuroscience. This video reviewed historical highlights, key questions asked by developmental neuroscientists and some of the techniques they use.

Thanks for watching!

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