Procedura per la safena umane Veins Ex Vivo Perfusione e rinforzo esterno

L'obiettivo generale del seguente esperimento è valutare l'influenza della pressione, dello stress puro e del rinforzo esterno sull'iperplasia intimale umana. Ciò si ottiene mediante perfusione simultanea ad alta pressione di due segmenti della stessa vena. Mentre un segmento è rinforzato da una rete esterna, i segmenti di vena vengono poi tagliati in sezioni per l'analisi istologica e molecolare.

Queste analisi sono utilizzate per valutare l'effetto di un rinforzo esterno sull'iperplasia intimale. I risultati mostrano che un rinforzo esterno può ridurre l'iperplasia intimale che normalmente si osserva dopo sette giorni di perfusione. L'innesto di bypass seno van è uno dei trattamenti di scelta nei pazienti affetti da arteriopatia periferica.

Tuttavia, lo sviluppo dell'iperplasia t che porta al fallimento del trapianto è il principale fattore limitante in tali mestieri. Questo rimodellamento è dovuto all'adattamento del furgone all'ambiente arterioso per sviluppare nuove terapie. La comprensione dei meccanismi molecolari coinvolti in questo fenomeno è essenziale.

Pertanto, abbiamo sviluppato un modello ex vivo di perfusione. Uno dei principali vantaggi del nostro sistema è che consente lo studio dei parametri emodinamici senza altri fattori immunitari o endocrini confondenti. Un dottorando in medicina del nostro laboratorio dimostrerà la tecnica.

I campioni di vene ecografiche umane sono ottenuti da pazienti sottoposti a intervento chirurgico di bypass degli arti inferiori. La vena viene raccolta e portata in laboratorio in condizioni sterili e posta sotto una cappa a flusso laminare. La dimensione minima di tali vene è lunga nove centimetri.

Il diametro interno è superiore a 2,5 millimetri e il diametro esterno superiore a quattro millimetri. La vena è divisa in tre. Anche i segmenti raccolti vengono conservati in terreni RPMI 1640 glut max ghiacciati integrati con il 12,5% di risciacquo FBS di un segmento in PBS.

È il controllo diviso ancora una volta in tre parti. Fissare una parte in Formin per morpho e congelare le altre due parti per l'analisi molecolare. L'EVPS deve essere realizzato in materiale impermeabile che non rilascia sostanze chimiche come polimetilacrilico, metilpoliossietilene e acciaio.

La camera di perfusione deve essere profonda almeno 2,5 centimetri per ridurre al minimo la flessione e la dilatazione del vaso e facilitare la sostituzione dei fluidi. Il supporto delle vene è un'asta d'acciaio collegata ad attacchi a forma di L dall'alto verso il basso. I condotti di collegamento sulla colonna di pressione consentono di regolare la pressione in entrata e in uscita dalla vena e di cambiare il fluido per determinare la direzione normale del flusso.

I due segmenti rimanenti per la perfusione vengono iniettati delicatamente con il terreno. Se il segmento ha valvole, il flusso sarà più lento. La vena deve essere invertita nell'EVPS in modo che le valvole non ostacolino il flusso.

Collegare la vena ai due cilindri metallici. Un capo alla volta. Fissare i cilindri con Vicryl tre oh attorno alle rientranze con un nodo stretto.

Quindi trasferire la vena nella camera di perfusione carica di terreno. Per il terzo segmento di vena, collegare un'estremità della vena al cilindro come mostrato in precedenza. Quindi far scorrere delicatamente la rete sulla vena.

Quindi fissare la rete e la vena sul cilindro con punti di sutura. Infine, regola la lunghezza della maglia e fissa l'altra estremità della vena e la rete al cilindro. Spostare il gruppo nella seconda camera di perfusione.

L'EVPS è assemblato in un circuito chiuso con tubi in silicone. Collegare ciascun cilindro di deflusso a uno splitter a Y utilizzando un segmento di tubo in silicone trattato con perossido. Fai lo stesso per ogni cilindro metallico in entrata.

Quindi, collegare il ripartitore di deflusso a un secondo divisore a Y. Da questo splitter a Y. Collegare un deflusso al tubo collegato al trasduttore di pressione e per collegare l'altro deflusso alla colonna di pressione, utilizzare un tubo da un metro per collegare la colonna di pressione alla pompa.

Completare la configurazione collegando la pompa allo splitter di afflusso a Y. Con un altro metro di tubo, collegare i tubi rimanenti alla colonna di pressione. Il condotto più basso serve per il cambio del fluido.

Dopo aver assemblato l'EVPS, riempire la colonna con il fluido fino a poco sotto il condotto di deflusso della vena. Ora, sposta il sistema nell'incubatrice, che è impostata a 37 gradi Celsius utilizzando l'anidride carbonica. Mantenere il pH a un valore costante di 7,4 all'esterno dell'incubatrice.

Fissare le teste degli ingranaggi della pompa alla trasmissione a ingranaggi per monitorare la pressione. Collegare l'uscita di pressione dell'EVPS al trasduttore di pressione. Verificare che il tubo sia completamente pieno e non presenti bolle.

Un segnale cardio ital pulsato a 60 impulsi al minuto con ampiezza costante viene impostato tramite il software del computer, che pilota in modo indipendente la pompa ad ingranaggi. Il flusso risultante è di circa 160 millilitri al minuto. La pressione viene impostata e regolata in modo indipendente da una pompa centrifuga in serie con un regolatore di pressione regolabile controllato dal computer.

Dopo tre-sette giorni, terminare la perfusione per ogni segmento perfuso. Rimuovere cinque millimetri da ciascuna estremità per scartare la parte legata delle vene. Quindi tagliare un anello di cinque millimetri per il fissaggio dalla sezione centrale della vena.

Congelare i frammenti rimanenti per l'analisi molecolare. Incorporare il terzo segmento nella formina per l'istologia e l'analisi molecolare. Dopo sette giorni di perfusione ad alta pressione, sono state preparate sezioni venose per l'analisi istologica.

Per tutte le condizioni, la colorazione h ed e ha rivelato nuclei di cellule endoteliali che rivestono il lume e nuclei di SMC nello strato mediale. Quando il tessuto è stato colorato con gel V per visualizzare l'elastina, le vene perfuse hanno mostrato un ispessimento dell'intima patologica verso l'esterno e un assottigliamento del mezzo era evidente. La colorazione dei tricomi di Masson mostra che solo uno dei tre strati muscolari persisteva, le cellule muscolari lisce si accumulavano nello strato interno.

Al contrario, il rinforzo esterno della vena ha preservato la distribuzione delle SMC e la struttura mediatica Questa tecnica richiede di lavorare in condizioni di sepsi rigorosa. Una volta padroneggiato, può essere eseguito in meno di due ore utilizzando questo sistema. Altre condizioni come il flusso turbolento possono essere testate per rispondere a ulteriori domande, come l'efficienza del rinforzo della rete nel flusso non lanare.