Name: Campionamento e Isolamento di Nematodi entomopatogeni Suolo (Steinernematidae, Heterorhabditidae) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Scopri i metodi di campionamento del suolo e l'isolamento di nematodi entomopatogeni Steinernematidae e Heterorhabditidae. Queste tecniche includono l'esca con insetti e la trappola di White modificata per il recupero dei nematodi.

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Gli autori desiderano ringraziare i membri passati della Fotografico laboratorio: Sam-Kyu Kim, Kathryn Plichta e Victoria Miranda-Thompson per il loro contributo al miglioramento di molti di questi protocolli. Noi riconosciamo il sostegno della National Science Foundation (sovvenzioni IOS-0840932 e IOS-0.724.978) a SP Fotografici.

1. Soil Sample Collection <ol><li> Si consideri che copre una superficie minima di 2-4 m 2 per ogni sito di campionamento. </li><li> Raccogliere campioni di terreno a una profondità di almeno 15 cm (Figura 4). </li><li> Prendere almeno 5 campioni casuali all&#39;interno di questa area. </li><li> Prendere 3 sottocampioni per campione. Seconda dell&#39;obiettivo dello studio, sia combinare sottocampioni o mantenerli separati. </li><li> Collocare ogni campione in un sacchetto di plastica. Considerare doppio insaccamento per evitare perdite di campioni (Figura 4). </li><li> Campioni etichetta con un pennarello indelebile. Includere le seguenti informazioni da ogni sito di campionamento: Informazioni sul sito (compresi località / zona / nome e GPS informazioni coordinare posto), la data, l&#39;habitat, la vegetazione associata, temperatura, altitudine, ecc NOTA: Se necessario, raccogliere e / o registrare la presenza di insetti o altri invertebrati raccolti con il campione per la successiva identificazione. Essi possono rappresentare potenziali naturpadroni di casa al EPN. </li><li> Strumenti di raccolta Pulire accuratamente tra i campioni di lavaggio con acqua e / o disinfezione con il 70% di etanolo o soluzione di candeggina allo 0,5%. </li><li> I campioni in un dispositivo di raffreddamento (8 - 15 ° C) durante il trasporto al laboratorio. </li><li> Prendete una porzione del campione di suolo per l&#39;analisi per ottenere informazioni sulla composizione del suolo, tessitura, umidità, conducibilità elettrica o di altri parametri pedologici desiderati. </li></ol> . 2 Isolamento Nematode da campioni di suolo: Tecnica Insect-baiting <ol><li> Rimuovere eventuali detriti (per esempio., Pietre, pezzi di legno o di corteccia, foglie, ecc.) Raccolti con i vostri campioni per evitare la contaminazione con microrganismi saprobico. </li><li> Aggiungere acqua per inumidire il terreno e agevolare la circolazione dei nematodi. NOTA: Utilizzare un flacone spray per aumentare lentamente il livello di umidità del suolo. </li><li> Posizionare circa 200 a 250 ml di terreno umido in un contenitore di plastica pulito con un coperchio. </li><li> Aggiungi esche insetti. Considerare 5 a 10 insetti alla superficie del suolo di ciascun campione (Figura 5). </li><li> Coprire il contenitore con un coperchio e girare contenitori a testa in giù. </li><li> Mantenere contenitori in un luogo buio a RT (solito, la 22 - 25 ° C). </li><li> Controllare contenitori ogni 2-3 giorni, e rimuovere gli insetti morti. NOTA: aggiungere altri insetti sani per ogni contenitore per un ulteriore adescamento del campione di terreno. </li><li> Rimuovere gli insetti morti dai contenitori. NOTA: Cadavers con un marrone o ocra colorazione di solito sono parassitati da steinernematids, mentre il rosso di cadaveri viola scuro mattoni sono parassitato da heterorhabditids. </li><li> Sciacquare cadaveri in acqua sterile. </li><li> Mettere cadaveri in una trappola bianco modificato per il recupero del nematode progenie (vedi procedura riportata di seguito). </li></ol> 3. Nematode Recovery da cadaveri infetti: Modificato Trappola bianca <ol><li> Posizionare la parte superiore di un diametro di 50 (o 60) mm. Capsula Petri all&#39;interno di una parabola più grande (100 mm). </li><li> Impostare un peccatocarta da filtro circolare gle (Whatman # 1) all&#39;interno del piatto più piccolo. </li><li> Posizionare cadaveri sulla carta da filtro del piatto più piccolo assicurandosi cadaveri non si toccano a vicenda per evitare qualsiasi contaminazione. </li><li> Riempire l&#39;esterno (grande) Scatola di Petri con ca. 20 ml di acqua distillata sterile. Non aggiungere acqua nel piatto che contiene i cadaveri. </li><li> Coprire il grande piatto Petri e il suo contenuto con il coperchio (Figura 6). </li><li> Etichettare i piatti di conseguenza. Aggiungere le seguenti informazioni: nome Nematode (specie / isolato), la data di infezione (infezione data è stata fissata) e quella trappola (questa è la data della trappola è impostato). </li><li> Tenere trappola a RT finché non si verifica emergere di stadi giovanili infettive (IJ). Questo processo può richiedere tra i 10 - 25 giorni a seconda delle specie e / o varietà considerata nematodi. </li><li> Acqua raccolta con IJs rimuovendo il più grande piatto della trappola e versando acqua con nematodi in un bicchiere. </li><li> Consentire nematodi decantare sul fondo della bEaker. Questo processo può richiedere alcuni minuti. </li><li> Versare acqua accuratamente, assicurandosi nematodi rimangono nel fondo del bicchiere. </li><li> Risciacquare nematodi con l&#39;aggiunta di più acqua e permettendo nematodi a decantare. Questa fase può essere ripetuta 2 - 3 volte finché l&#39;acqua è pulita. </li><li> Posizionare sospensione nematode in un pallone di coltura tissutale (250 ml). Mantenere la concentrazione della sospensione di 1.000 - 3.000 nematodi / ml. </li><li> Boccetta Store con sospensione nematode in una stanza fredda o in incubatrice tra i 10 - 20 ° C. NOTA: controllare boccette memorizzati periodicamente durata di EPN è variabile. Di solito steinernematids possono essere conservati per 6-12 mesi senza il bisogno di subcoltura, che heterorhabditids possono richiedere più controlli periodici. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questa manifestazione è la prima delle due presentazioni che descrivono una serie di tecniche che sono comunemente usati per lo studio EPN e dei loro batteri simbionti. Queste tecniche rappresentano passaggi fondamentali per la creazione di successo delle culture EPN in laboratorio e costituiscono anche la base per altri biotest che impiegano EPN come organismi modello per la ricerca. Vari sondaggi del terreno di EPN hanno dimostrato che la loro abbondanza e la distribuzione può variare tra ...

Molti nematodi sono associati con gli insetti, e le loro interazioni ospite variano da vantaggioso per dannosa. Qui, ci concentriamo su un gruppo di nematodi che sono patogeni di insetti, noto anche come nematodi entomopatogeni (o EPN). Due famiglie di nematodi appartengono a questo gruppo di nematodi: Steinernematidae e Heterorhabditidae 11,13. Il loro effetto patogeno è infatti conferita dalla loro interazione con anaerobi facoltativi batteri enterici (batteri Xenorhabdus associano con steinernematids e batteri Photorhabdus associare a heterorhabditids) 2. I batteri sono vectored da un host ad un altro insetto da parte l&#39;unica tappa libero nematode vita, il giovane infettivo terzo stadio (noto anche come dauer giovanile, giovanile infettiva o IJ), che vive nel terreno. Una volta dentro l&#39;insetto, i nematodi rilasciano i batteri nella emolinfa dell&#39;insetto, che uccidono l&#39;insetto ospite da una massiccia setticemia. I batteri anchedegradare i tessuti dell&#39;insetto e diventano fonte di cibo dei nematodi &#39;, consentendo loro di maturare e moltiplicarsi. Di solito, una o due generazioni di nematodi adulti sono prodotte all&#39;interno del cadavere insetto. La progenie degli ultimi riassocia generazione adulta con poche cellule batteriche in più specializzarsi modo che il loro precedente rapporto nutrizionale, e coltivare queste cellule nei loro intestini mentre si muovono fuori dalla carcassa insetti nel terreno dove potranno attendere un altro insetto di parassitare 6,11,14 (Figura 1). Sin dalla loro scoperta nel 1927, EPN sono stati considerati importanti alternative ai pesticidi chimici in quanto possono parassitare una vasta gamma di insetti che sono parassiti agricoli 3,4,5. Tuttavia, negli ultimi due decenni, questi nematodi e dei loro batteri simbionti sono stati riconosciuti come sistema modello malleabile per studiare aspetti biologici, ecologici ed evolutivi di ospite-microbo interactions 14. L&#39;obiettivo di questa presentazione è quello di mostrare i metodi e le tecniche più comunemente utilizzate per il campionamento del suolo e l&#39;isolamento di EPN. Una varietà di strumenti è disponibile e può essere utilizzato per raccogliere campioni di terreno, tra cui: defittonatrici suolo, cazzuole, trivelle, trivelle, tubi di campionamento, pale a mano, tra gli altri (Figura 2). A seconda dello scopo dello studio, due strategie di campionamento possono essere considerati: a) stratificato, b) campionamento casuale (Figura 3). Il campionamento stratificato è solitamente utilizzato come parte di uno studio intensivo in una zona specifica o demarked in un determinato periodo di tempo. In generale, un transetto è demarked e campioni di suolo sono presi a intervalli stabiliti nel transetto per un periodo di tempo (Figura 3A) 15. Il campionamento casuale viene generalmente impiegato quando concentrandosi su una vasta area. Questa strategia di campionamento è stato utilizzato per studiare la diversità di EPN fROM una vasta area geografica o regione (Figura 3B) 12. Una serie di fattori può essere considerato in funzione del focus dello studio tra cui una vasta gamma di altezze, texture del suolo e degli habitat (ad es., Campi coltivati, boschi, pascoli, parchi, spiagge, aree ripariali, ecc.) Mostriamo la tecnica dell&#39;insetto adescamento, che è stato originariamente descritto da biancheria da letto e Akhurst 1 e rappresenta un semplice e selettivo alternativa per il recupero EPN da campioni di suolo. Questa è una procedura selettiva che si basa sul presupposto che i nematodi (fase IJ) saranno attratti a un host insetto e parassitano esso. Questa tecnica può anche essere considerato per l&#39;isolamento di altri patogeni insetti quali funghi e batteri 8,10. Abbiamo anche dimostrare la tecnica trappola bianco modificato, che viene utilizzato per il recupero nematode progenie di insetti infetti padroni di casa 7,14. Si tratta di un sforzo incontratohod che offre il vantaggio di recuperare un &#39;clean&#39; nematode progenie priva di detriti dai cadaveri di insetti degradanti. Infine, le tecniche descritte ed illustrate in questo articolo corrispondono a quelli concepiti e / o eseguite nel nostro laboratorio così come quelli descritti da vari colleghi e collaboratori.

<table><tbody><tr><td>Galleria mellonella</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>Per la tecnica di adescamento degli insetti</td></tr><tr><td>Carta da filtro, 55 mm Cellulosa di grado 1</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-048</td><td>Camera di infezione e gruppo trappola bianca</td></tr><tr><td>60 x 15 mm Piastre di Petri</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>Camera di infezione e gruppo trappola bianca</td></tr><tr><td>Piastre di Petri 100 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Camera di infezione e trappola bianca</td></tr><tr><td>Sacchetti di plastica ZIPloc</td><td>Ace Hardware o negozio</td><td></td> di ferramenta locale <td>Campionamento del terreno</td></tr><tr><td>Pipettatore meccanico P1000, P200 ml</td><td>VWR</td><td>89130-562; 89130-566&nbsp;</td><td>Camera di infezione e gruppo trappola bianca</td></tr><tr><td>Punte Pippetor 1000ml, 200 ml</td><td>VWR</td><td>16466-004 ; 53510</td><td>Camera di infezione e assemblaggio trappola bianca</td></tr><tr><td>Candeggina</td><td>Ace Hardware o negozio di ferramenta</td><td></td> locale <td>Campionamento del suolo, disinfezione</td></tr><tr><td>Ipoclorito di sodio</td><td>Ace Hardware o negozio</td><td></td> di ferramenta locale <td>Campionamento del suolo, disinfezione</td></tr><tr><td>70% Ethyl alochol</td><td>AAPER</td><td>17212945</td><td>Campionamento del suolo, disinfezione</td></tr><tr><td>Pale</td><td>Ace Hardware o negozio di ferramenta locale</td><td>N/A</td><td>Campionamento del suolo</td></tr><tr><td>Campionatore tubolare del suolo</td><td>Accuproducts</td><td></td><td>Campionamento del suolo</td></tr><tr><td>Sonda del suolo, manico lungo</td><td>Nupla&nbsp;</td><td>PRB4T 69401 Classico</td><td>Campionamento del suolo</td></tr><tr><td>Nastro di misurazione</td><td>Ace Hardware o negozio</td><td></td> di ferramenta locale <td>Campionamento del suolo</td></tr><tr><td>Nastro per segnalazioni, vari colori</td><td>Ace Hardware o negozio di ferramenta</td><td></td> locale <td>Campionamento del suolo</td></tr><tr><td>Fiasche per coltura tissutale</td><td>VWR</td><td>Falcon, 29185-304&nbsp;</td><td>White trap, raccolta di EPN</td></tr><tr><td>Flaconi di lavaggio, polietilene, bocca larga</td><td>VWR</td><td>16650-107</td><td>Sifone bianca, raccolta di EPN</td></tr></tbody></table>

campionamento e isolamento di nematodi entomopatogeni suolo (steinernematidae, heterorhabditidae)

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Nematodi entomopatogeni (aka EPN) rappresentano un gruppo di nematodi del suolo abitare che parassitano una vasta gamma di insetti. Questi nematodi appartengono a due famiglie: Steinernematidae e Heterorhabditidae. Fino ad oggi, più di 70 specie sono state descritte nel Steinernematidae e ci sono circa 20 specie in Heterorhabditidae. I nematodi hanno una collaborazione mutualistica con i batteri Enterobacteriaceae e insieme agiscono come un complesso potente insetticida che uccide una vasta gamma di specie di insetti. Qui, ci concentriamo sulle tecniche più comuni considerati per la raccolta EPN dal suolo. La seconda parte di questa presentazione si concentra sulla tecnica insetti adescamento, un approccio ampiamente utilizzato per l&#39;isolamento di EPN dai campioni di suolo, e la tecnica trappola bianco modificato che viene utilizzato per il recupero di questi nematodi da insetti infetti. Questi metodi e le tecniche sono passaggi fondamentali per la creazione di successo di culto EPNUres in laboratorio e anche la base per altri testi biologici che considerano questi nematodi come organismi modello per la ricerca in altre discipline biologiche. Le tecniche mostrate in questa presentazione corrispondono a quelle eseguite e / o creazione di membri della SP Archivio laboratorio così come quelli descritti da vari autori.

Soil Sample Collection Terza fase larve infettive di EPN sono le uniche fasi di vita liberi nel ciclo di vita di questi nematodi ', che risiedono nel terreno (Figura 1). Pertanto, la raccolta di campioni di suolo è un metodo molto efficace per il recupero di questi nematodi. Figura 4 mostra un profilo del terreno che indica la profondità alla quale devono essere prelevati campioni. Preservare l'umidità di un campione è un fattore chiave per la sopravvivenza ...

Nematodi entomopatogeni sono nematodi del suolo abitare che parassitano una vasta gamma di insetti. Dimostriamo metodi di campionamento utilizzati per l&#39;isolamento di questi nematodi dal terreno utilizzando due tecniche: l&#39;adescamento insetto e la trappola bianco modificato, per il recupero dei nematodi dai campioni di suolo e cadaveri insetti infetti, rispettivamente.

Campionamento e Isolamento di Nematodi entomopatogeni Suolo (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Lo scopo di questa procedura è quello di dimostrare i metodi e le tecniche comunemente utilizzati per il campionamento del suolo e l'isolamento dei nematodi enteropatogeni. Ciò si ottiene raccogliendo prima campioni di suolo con un approccio transetto o, come dimostrato, con un approccio di campionamento casuale. Successivamente, i campioni di terreno sono stati abbattuti con insetti per recuperare selettivamente i nematodi enteropatogeni.Il passaggio finale consiste nel raccogliere i nematodi dagli insetti infetti utilizzando una trappola bianca modificata. In definitiva, queste tecniche rappresentano passaggi chiave per il successo dell'istituzione di colture di nematodi enteropatogeni in laboratorio e costituiscono la base per i biotest a valle. Il vantaggio della tecnica di campionamento del suolo è che possiamo andare sul campo e raccogliere gli stadi maturi dei nematodi patogeni.Piuttosto che campionare gli insetti che sono infettati da questi nematodi, che sono raramente incontrati. La strategia del campione casuale che impieghiamo è comunemente utilizzata per valutare la diversità dei nematodi patogeni provenienti da un'ampia regione o area geografica. Questa tecnica è stat

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L'obiettivo di questa presentazione è quello di dimostrare in vivo e in vitro tecniche per l'allevamento di nematodi entomopatogeni. Metodi in vivo considerano l'allevamento di questi nematodi con un host insetto, mentre i metodi in vitro utilizzano rich media agar.

In vivo e in vitro Allevamento di Nematodi entomopatogeni (Steinernematidae e Heterorhabditidae)

Qui presentiamo un protocollo basato sul sistema di esca del verme della farina (Tenebrio molitor) che è stato utilizzato per isolare e selezionare funghi entomopatogeni (EPF) da campioni di suolo. Una formula efficace del numero di conidi (ECN) viene utilizzata per selezionare EPF ad alta tolleranza allo stress in base alle caratteristiche fisiologiche per il controllo microbico dei parassiti sul campo.

Isolamento e selezione di funghi entomopatogeni da campioni di suolo e valutazione della virulenza fungina contro gli insetti nocivi

Questo protocollo delinea un metodo per estrarre in modo efficiente nematodi vivi da substrati naturali sul campo.

Rapido isolamento dei nematodi selvatici di Baermann Funnel

Le colonie fungine entomopatogene sono isolate da campioni di terreno tropicale utilizzando l'esca Tenebrio , l'esca Galleria e il mezzo artificiale selettivo, cioè l'agar destrosio di patate arricchito con estratto di lievito integrato con cloramfenicolo, tiabendazolo e cicloeximide (mezzo CTC).

Confronto dei metodi per isolare i funghi entomopatogeni da campioni di suolo

Questo protocollo può essere utilizzato per eseguire indagini ecologiche su larga scala dei nematodi Caenorhabditis selfing. Il vantaggio principale di questo metodo è l'organizzazione efficiente e l'analisi dei dati ecologici e molecolari associati ai nematodi raccolti dalla natura.

Un approccio altamente scalabile per eseguire indagini ecologiche sui nematodi della caenorhabdite selfing

I nematodi entomopatogeni vivono in simbiosi con i batteri e insieme infettano con successo gli insetti minando il loro sistema immunitario innato. Per promuovere la ricerca sulle basi genetiche dell'infezione da nematodi, vengono descritti metodi per il mantenimento e la manipolazione genetica dei nematodi entomopatogeni.

Coltivare e manipolare geneticamente i nematodi entomopatogeni

Caenorhabditis elegans è una delle principali specie modello in biologia, ma quasi tutte le ricerche vengono eseguite in assenza dei suoi microbi naturalmente associati. I metodi qui descritti aiuteranno a migliorare la nostra comprensione della diversità dei microbi associati come base per la futura ricerca funzionale di C. elegans.

Isolamento e caratterizzazione del microbiota naturale del nematode modello Caenorhabditis elegans

Presentiamo due metodi per gli agricoltori per propagare in massa nematodi entomopatogeni come bio-insetticidi. Il primo metodo utilizza gel di poliacrilammide come substrato per la coltura del nematode, mentre il secondo utilizza il filone rivestito di polimero come substrato di coltura. Entrambi i metodi si basano sulla propagazione in vivo dei nematodi all'interno di cadaveri di insetti.

Propagazione in vivo basata sul coltivatore di nematodi entomopatogeni

Questo metodo spiega come costruire e gestire un continuo 13 C e 15 N isotopo camera di etichettatura uniforme o l'etichettatura tessuti vegetali differenziale. I risultati rappresentativi da metabolico e l'etichettatura strutturale gerardii Andropogon sono discussi.

Progettazione e funzionamento di un continuo<sup&gt; 13</sup&gt; C e<sup&gt; 15</sup&gt; N Etichettatura Camera di Uniform o differenziale, metaboliche e strutturali, Flora Isotope Labeling

Campo lysimetry e campionamento porewater permettono ai ricercatori di valutare il destino di sostanze chimiche applicate al suolo e alla vegetazione stabilita. L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare come installare la strumentazione necessaria e raccogliere campioni per l'analisi chimica durante lysimetry campo integrato ed esperimenti di campionamento porewater.

Integrato Campo Lysimetry e Porewater campionamento per la valutazione della chimica Mobilità nel suolo e alla vegetazione Fondata

Scopri i metodi di campionamento del suolo e l'isolamento di nematodi entomopatogeni Steinernematidae e Heterorhabditidae. Queste tecniche includono l'esca con insetti e la trappola di White modificata per il recupero dei nematodi.

Campionamento e Isolamento di Nematodi entomopatogeni Suolo (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

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