Campionamento e Isolamento di Nematodi entomopatogeni Suolo (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Lo scopo di questa procedura è quello di dimostrare i metodi e le tecniche comunemente utilizzati per il campionamento del suolo e l'isolamento dei nematodi enteropatogeni. Ciò si ottiene raccogliendo prima campioni di suolo con un approccio transetto o, come dimostrato, con un approccio di campionamento casuale. Successivamente, i campioni di terreno sono stati abbattuti con insetti per recuperare selettivamente i nematodi enteropatogeni.

Il passaggio finale consiste nel raccogliere i nematodi dagli insetti infetti utilizzando una trappola bianca modificata. In definitiva, queste tecniche rappresentano passaggi chiave per il successo dell'istituzione di colture di nematodi enteropatogeni in laboratorio e costituiscono la base per i biotest a valle. Il vantaggio della tecnica di campionamento del suolo è che possiamo andare sul campo e raccogliere gli stadi maturi dei nematodi patogeni.

Piuttosto che campionare gli insetti che sono infettati da questi nematodi, che sono raramente incontrati. La strategia del campione casuale che impieghiamo è comunemente utilizzata per valutare la diversità dei nematodi patogeni provenienti da un'ampia regione o area geografica. Questa tecnica è stata descritta per la prima volta scommettendo su Accur nel 1975.

Si tratta di una procedura selettiva basata sulla premessa che gli stadi di vita libera saranno attratti dagli insetti ospiti e li parassitano. A dimostrare le procedure sarà lo studente laureato di Rue Orozco e il tecnico di ricerca Ming Mingle nel mio laboratorio. Laboratorio. Il sito per la raccolta dei campioni dovrebbe avere un'area minima di due metri quadrati e, se possibile, essere maggiore di quattro metri quadrati.

Per ogni campione di terreno, prelevare almeno tre sottocampioni più piccoli all'interno dell'area di campionamento DM a C. I sottocampioni possono essere combinati se soddisfa gli obiettivi dello studio. Raccogli i campioni di terreno a una profondità compresa tra zero e 15 centimetri.

Ogni campione dovrebbe essere compreso tra 250 grammi e un chilogrammo. Usa terriccio CORA, pale a mano o strumenti simili e raccogli da almeno cinque siti casuali all'interno di ciascuna area di campionamento selezionata. Ogni campione deve essere imbustato due volte ed etichettato con un pennarello impermeabile.

L'etichetta deve contenere informazioni sul sito, la posizione, l'altitudine, la data e le variabili ambientali come la descrizione dell'habitat con la vegetazione associata e la temperatura del sito. Prendi nota degli insetti locali e di altre specie di invertebrati. Raccogli le specie che non possono essere immediatamente identificate per una successiva identificazione in laboratorio tra i siti di raccolta, lava accuratamente gli strumenti di raccolta con acqua, quindi disinfettali usando etanolo al 70% o candeggina allo 0,5%.

Conservare i campioni di terreno in un frigorifero a una temperatura compresa tra 8 e 15 gradi Celsius per il trasporto. CES separa una parte del campione per analizzare le caratteristiche grossolane del suolo come la sua composizione, consistenza, conduttività e così via. Da ogni campione di terreno, rimuovere i detriti che potrebbero portare alla contaminazione da microbi seic.

Quindi inumidisci il terreno con acqua in modo che i nematodi in esso contenuti possano muoversi facilmente. Caricare da 200 a 250 grammi di terriccio umido in un contenitore di plastica con coperchio. Quindi aggiungi esche per insetti.

Da cinque a 10 insetti saranno sufficienti. Attacca il coperchio, capovolgi il contenitore e mettilo al buio. A temperatura ambiente ogni due o tre giorni, rimuovere gli insetti morti e, se necessario, sostituirli con insetti sani per un ulteriore peso.

Se il cadavere dell'insetto è marrone o ocra, questo suggerisce che Stein e Nema parassitano il parit. Mentre se il cadavere va dal rosso mattone al viola scuro, anticipa l'etero. Usa una trappola bianca modificata per raccogliere i nematodi che hanno parassitato le esche per insetti.

Per prima cosa, posiziona il coperchio di una capsula di Petri da 50 o 60 millimetri nella base di una piastra da 100 millimetri. Posizionare quindi un foglio di watman circolare. La carta da filtro numero uno nel piatto più piccolo.

Sciacquare i cadaveri degli insetti con acqua sterilizzata e trasferirli sulla carta da filtro. Stendere in modo che non siano in contatto tra loro. Riempite solo il piatto più grande con circa 20 millilitri di acqua distillata e coprite il gruppo con i piatti più grandi. Coperchio.

Etichetta i piatti con il nome del nematode, la data e la data dell'esca degli insetti. La trappola è pronta. Tenere le trappole a temperatura ambiente e monitorare la presenza di nematodi giovani infettivi o IJ che emergono dai cadaveri degli insetti.

Questo può richiedere da 10 a 25 giorni e dipende dalla temperatura e dal livello di umidità in cui è conservata la trappola. Se il livello dell'acqua nella trappola è evaporato, assicurarsi di riempirla su piastre con IJ. Raccogli l'acqua dal piatto più grande, che dovrebbe contenere nematodi.

Lasciare affondare i nematodi per qualche minuto e poi decantare lentamente l'acqua. Una volta che i nematodi rimangono in un piccolo volume d'acqua, sciacquateli ancora un paio di volte aggiungendo acqua e poi versandola con cura. Quindi effettuare diluizioni seriali per stimare la popolazione di nematodi.

In un pallone da 250 millilitri, regolare la concentrazione del nematode tra uno e 3000 nematodi per millilitro. Conservare questa sospensione a una temperatura compresa tra 10 e 20 gradi Celsius. Generalmente in natura, le probabilità di trovare insetti parassitati da nematodi enteropatogeni sono molto basse.

Pertanto, il protocollo delineato che utilizza le larve di melanoma G come esca è stato utilizzato per isolare tali nematodi a un ritmo molto più efficiente. Dopo cinque giorni, gli insetti erano infettati e avevano una colorazione rossa. Le trappole bianche modificate hanno mostrato tracce di nematodi.

Dopo 15 giorni da queste trappole, i nematodi raccolti in acqua, avevano un aspetto pulito ed erano privi di tessuti di insetti. Un singolo ciclo di estrazione con larve di gallio Melania può essere insufficiente per recuperare tutti i nematodi patogeni di Oma che si trovano in un campione di terreno. Quindi ti consigliamo di farlo più volte.

Inoltre, consigliamo agli utenti di considerare altri insetti piuttosto che Galleria, il che aumenterà anche le possibilità di recupero. Il dibattito di campioni di terreno con gli insetti è una tecnica che può essere presa in considerazione anche per l'isolamento di altri insetti patogeni come batteri o funghi.