Su larga scala Zebrafish embrionali Cuore dissezione per l'analisi trascrizionale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di raccogliere i cuori mediante dissezione manuale rapida da embrioni vivi di zebrafish per ottenere Mr.NA specifico per il cuore. Ciò si ottiene mediante il primo pipettaggio, molti embrioni anestetizzati su e giù attraverso una punta di pipetta stretta per rilasciare contemporaneamente i cuori dai corpi embrionali. Successivamente, i cuori sezionati vengono separati dai detriti embrionali in due rapide fasi di filtrazione. Quindi i cuori etichettati in fluorescenza vengono selezionati manualmente dai detriti rimanenti.

Infine, l'RNA specifico cardiaco viene estratto dai cuori raccolti. In definitiva, il protocollo di dissezione cardiaca viene utilizzato per raccogliere quantità sufficienti di cuori embrionali per eseguire l'analisi del trascrittoma. Questo metodo aiuterà a porre domande chiave nel campo dello sviluppo del cuore del pesce d'argento, ad esempio quali trascritti sono espressi all'interno del cuore in diversi stadi di sviluppo, e anche a confrontare le espressioni cardiache selvatiche e mutanti Per ottenere embrioni di pesce zebra per l'estrazione del cuore, incrociare pesci transgenici adulti che esprimono una proteina fluorescente nel cuore, come il transgenico miglio sette EGFP al microscopio stereo.

Monitorare lo sviluppo degli embrioni. Verificare che i cuori siano effettivamente etichettati in modo fluorescente e decapare manualmente gli embrioni quando gli embrioni hanno raggiunto lo stadio desiderato. Trasferire circa 100 embrioni in una provetta da 1,5 millilitri e aggiungere 16 milligrammi per millilitro di trica in un mezzo E tre per anestetizzarli.

Metti il tubo sul ghiaccio. Rimuovere la soluzione di trica e utilizzare un millilitro di terreno L 15 10%FBS ghiacciato per lavare gli embrioni, tenendoli in ghiaccio. Dopo aver rimosso questo lavaggio, aggiungere un millilitro di L 15 FBS e utilizzare una punta rotonda di caricamento in gel per pipettare gli embrioni su e giù da cinque a otto volte in modo da interrompere completamente i tuorli, pipettare gli embrioni goccia a goccia sulla superficie della soluzione in modo che la goccia scoppi e gli embrioni vengano delicatamente disgregati.

Per questo primo lotto di embrioni sezionati al microscopio stereoscopico, valutare la loro integrità e la proporzione di cuori sezionati e regolare di conseguenza le modalità di pipettaggio. Per i lotti successivi, posizionare un filtro da 100 micrometri su una provetta da centrifuga da 50 millilitri e applicare il campione embrionale. Quindi utilizzare un millilitro di L 15 FBS per ravvitare il tubo di fuge e applicare la soluzione al filtro per eliminare i cuori rimasti nel filtro.

Utilizzare L 15 FBS per lavarlo due volte. Quindi, posizionare un filtro da 30 micrometri su una provetta da centrifugazione da 15 millilitri e applicare il flusso attraverso i cuori. Utilizzare L 15 FBS per risciacquare questo filtro, che trattiene i cuori e lava via i detriti più piccoli.

Quindi capovolgere il filtro da 30 micrometri su una piastra di Petri rivestita di agros e applicare tre lavaggi da un millilitro di terreno L 15 FBS per eliminare i cuori dal filtro Sotto un microscopio a fluorescenza, utilizzare un paio di pinze per separare manualmente i cuori positivi alla GFP dai tessuti non fluorescenti, concentrandoli al centro della piastra. La fisiologia dei cuori appare normale in quanto battono ancora dopo la dissezione. Procedimento. Per isolare l'mRNA dai cuori, raccoglierli nel minor volume possibile di terreno e pipettarli in una provetta da 1,5 millilitri su ghiaccio contenente 0,75 millilitri di RNA.

Successivamente al microscopio a fluorescenza. Visualizzare il puntale della pipetta per verificare che non rimangano cuori attaccati al puntale della pipetta. Dopo aver estratto i cuori da diversi cicli di isolamento nella provetta di RNA in seguito, secondo il protocollo di testo, centrifugare i campioni a 15, 700 G e quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Successivamente, sotto un microscopio a fluorescenza, raccogliere con cura quanto più sate possibile e trasferirlo in una capsula di Petri rivestita all'1% di agros contenente tre millilitri di terreno L 15 10% FBS. Successivamente, sotto una cappa chimica, aggiungere 0,5 millilitri di triolo alla provetta contenente i cuori sedimentati e tenere in ghiaccio Sotto il microscopio a fluorescenza, trasferire i cuori rimasti nel surnatante in un piatto fresco rivestito all'1% di agros con L 15 10% FBS per diluire l'RNA in seguito, che è molto viscoso. Quindi raccogli i cuori in un piccolo volume e trasferiscili nel tubo di cuori sedimentati in triolo per distruggere i cuori, agitare il tubo e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.

Quindi, sotto una cappa chimica, aggiungere accuratamente 100 microlitri di miscela di cloroformio e trasferire la soluzione in una provetta PrepU e PLG da 1,5 millilitri Incubare per tre minuti a temperatura ambiente, centrifugare un campione a 15, 700 g e quattro gradi Celsius per 15 minuti e trasferire la fase acquosa in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere da cinque a 10 microgrammi di glicogeno e 250 microlitri di isopropanolo pre-raffreddato. Mescolare bene e incubare per una notte a meno 20 gradi Celsius il giorno successivo.

Centrifugare i campioni a 15, 700 g e quattro gradi Celsius per 30 minuti e scartare lo snat. Applicare un millilitro di etanolo al 75% per lavare la centrifuga a palette e scartare lo snat. Lasciare evaporare l'etanolo rimanente dal pellet a temperatura ambiente fino a quando il pellet diventa bianco.

Aggiungere 20 microlitri di acqua distillata doppia priva di RNA al pellet e incubare a 55 gradi per 10-15 minuti per sciogliere l'RNA. Quindi posizionare i tubi sul ghiaccio. Utilizzare uno spettrofotometro per determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA ed eseguire un campione su un gel all'1% di agros per valutare l'integrità del confronto dell'RNAA dei campioni di cuore prima della selezione dai detriti embrionali a 56 ore dopo la fecondazione rispetto a 36 ore dopo la fecondazione.

Gli embrioni a 56 ore dopo la fecondazione hanno prodotto più detriti embrionali rispetto a 36 ore dopo la fecondazione dopo la filtrazione per determinare la purezza del campione di cuore di 56 HPF, i livelli di espressione dei trascritti cardiaci rispetto a quelli extra cardiaci sono stati confrontati mediante R-T-Q-P-C-R. Questo gel mostra l'RNA estratto dai cuori isolati e dagli embrioni distrutti senza cuore. Le misurazioni dell'assorbanza hanno rivelato che 300 cuori hanno prodotto circa 660 nanogrammi di RNA.

Si tratta di 33 nanogrammi per microlitro in un volume finale di 20 microlitri. I livelli relativi di espressione genica sono stati calcolati mediante esperimenti R-T-Q-P-C-R per i marcatori mostrati qui. Come previsto, il settimo miglio è stato altamente arricchito nel campione di cuore rispetto all'embrione senza campione di cuore, come si vede qui.

Il marcatore delle cellule endoteliali, KDRL, era moderatamente arricchito nel cuore. Il marcatore eritrocitario emoglobina beta embrionale 1.1 era sovrarappresentato nel campione di cuore, anche se i cuori stavano ancora battendo dopo la dissezione, il che dovrebbe espellere i globuli rossi dal cuore. Nel contrasto, i livelli del marcatore cristallino alfa A del cristallino e del marcatore del SNC, GFAP, sono risultati notevolmente ridotti nel campione di cuore.

Questi risultati mostrano che il protocollo di dissezione cardiaca produce RNA specifico cardiaco di alta qualità da embrioni interi di zebrafish. Per questo esperimento, è importante monitorare il campione per evitare di perdere i cuori durante la procedura di dissezione.