Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mappare l'interazione tra due proteine o domini proteici. In questo caso, vengono ancora studiati i domini proteici correlati al cancro e il CHFR. L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mappare l'interazione tra due proteine o domini proteici.

In questo caso, vengono ancora studiati i domini proteici correlati al cancro e il CHFR. Il secondo passo consiste nell'incubare l'array di peptidi CHFR con il suo partner di legame, la proteina still. Successivamente, l'array viene lavato e incubato con perossidasi di rafano, anticorpo coniugato.

L'array viene quindi sottoposto a rilevamento di luminescenza chimica per rilevare il legame. Il passo finale consiste nell'analizzare i risultati e identificare i siti di legame tra le proteine. Questo studio apre la strada alla progettazione di inibitori razionali del legame ancora CHFR, la cui interazione incontrollata può portare allo sviluppo del cancro.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca sull'interazione proteica, come ad esempio quali sono le regioni specifiche che meditano Un'interazione tra due proteine, dividere la sequenza della proteina bersaglio in 10-20 peptidi residui. Ciò si sovrappone parzialmente. La quantità di sovrapposizione può essere variata, ma in linea di principio, più lunga è la sovrapposizione, meglio è.

Quando si progettano i peptidi, si tiene conto degli elementi noti della struttura secondaria nella proteina che possono essere responsabili dell'interazione. L'array di peptidi progettato può essere ordinato tramite fornitori commerciali. Per questo esperimento, i peptidi dei residui del dominio CHFR da 4 24 a 6 62 sono legati covalentemente all'array attraverso il terminale C.

Dopo aver ricevuto l'array progettato, prepararlo per l'esperimento bloccandolo prima per impedire l'associazione non specifica. Preparare una soluzione bloccante del 2,5% in peso per volume. Latte scremato in polvere in una soluzione tampone tris contenente lo 0,05% di Tween 20 o TBST per evitare legami aspecifici.

Immergere l'array in cinque millilitri di soluzione bloccante. Incubare l'array per due-quattro ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius su uno shaker. Lavare prima l'array con cinque millilitri di soluzione bloccante per 30 secondi.

Quindi lavare l'array due volte con cinque millilitri di TBST per cinque minuti su uno shaker a temperatura ambiente. Successivamente, incubare l'array lavato con cinque millilitri di soluzione proteica marcata con poliistidina contenente il 2,5% in peso per volume. Latte scremato in polvere per evitare legature aspecifiche.

In questo caso, viene utilizzata una soluzione 4,5 micromolare di residui proteici fermi da 500 a 60. Quindi incubare l'array nella soluzione proteica per tre-otto ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione nella soluzione proteica.

Lavare l'array con cinque millilitri di TBST per 30 secondi su uno shaker a temperatura ambiente, seguito da altri due lavaggi di cinque minuti. Ora incubare l'array lavato con cinque millilitri di anticorpo coniugato perossidasi di rafano diluito in un tampone di incubazione che contiene gli stessi ingredienti alle stesse concentrazioni della soluzione bloccante per un'ora su un agitatore a temperatura ambiente, l'anticorpo può legare la proteina bersaglio o il tag, eseguire esperimenti di controllo, testare l'interazione dell'anticorpo con i peptidi sull'array ripetendo lo stesso protocollo su un array separato Scivolare senza incubare con la proteina prima di leggere gli array. Lavateli come prima con cinque millilitri di TBST.

Eseguire lo sviluppo della chemiluminescenza con un kit di substrati di western blotting a chemiluminescenza potenziato. Eseguire il rilevamento con un analizzatore di immagini luminescenti come una fotocamera Fuji film LAS 3000. Analizza i risultati, assicurandoti che entrambi i duplicati sull'array mostrino gli stessi segnali in modo che i risultati siano affidabili.

Se la struttura del partner proteico è nota, cercare sulla struttura i peptidi leganti e cercare i siti di legame. Tieni presente che i peptidi che si trovano molto nella sequenza possono essere insieme nella struttura terziaria e creare un sito di legame. Nel nostro esempio, still è una proteina centro-somica molto importante che controlla la normale divisione cellulare e la proliferazione cellulare interagisce ancora con diverse proteine attraverso la sua regione intrinsecamente disordinata.

Utilizzando l'array di peptidi progettato, sono stati rivelati i siti ancora leganti nel soppressore tumorale CHFR. Ogni punto nero nell'array rappresenta un peptide derivato da A-C-H-F-R che si lega a notare che ogni peptide appare due volte poiché esiste in duplicato, il che verifica l'affidabilità dei risultati. Lo screening dell'array di peptidi ha rivelato sette peptidi derivati da CHFR che si legavano ai residui della regione ancora intrinsecamente disordinati da 500 a 60 50.

Questi risultati ci hanno permesso di mappare il sito di legame dell'alambicco su CHFR. Nonostante la distanza di questi sette peptidi sulla sequenza primaria CHFR. Creano un sito di legame ben definito per l'alambicco nella struttura terziaria CHFR.

Questo metodo è applicabile per caratterizzare ogni interazione proteina proteina Seguendo questa procedura. Metodi quantitativi come la fluorescenza e l'isotopo o l'ITC dovrebbero essere utilizzati per verificare, e quantificare, l'introduzione del peptide.