Name: Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Scopri come identificare siti di interazione proteina-proteina utilizzando peptide array con le proteine still e CHFR. Questo metodo ad alto rendimento aiuta a mappare le interazioni per la ricerca sul cancro.

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AF è stato sostenuto da una borsa di studio a partire dal Consiglio europeo della ricerca nell&#39;ambito del Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7 / 2007-2013) / accordo di sovvenzione del CER n ° 203.413 e dal Centro Minerva per la Bio-ibrido systems.HA complesso e AI sono supportati dal Dalia e Dan Maydan Fellowship per gli studenti di laurea specialistica presso l&#39;Università Ebraica di Gerusalemme.

1. Progettazione di un array di peptidi <ol><li> Dividere la sequenza della proteina bersaglio in parte si sovrappongono 10-20 residui peptidi. Variare la quantità di sovrapposizione sulla esperimento specifico e le risorse del laboratorio esecuzione, ma in linea di principio più lunga è la sovrapposizione meglio. Nel progettare i peptidi tengono conto noto elementi della struttura secondaria della proteina che può essere responsabile per l&#39;interazione. </li><li> Ordinare l&#39;array peptide progettato presso i rivenditori commerciali. Qui, uso peptidi legati covalentemente alla matrice attraverso il C-terminale. </li></ol> 2. Blocco legame non specifico <ol><li> Effettuare una soluzione tampone Tris 50 mM o fosfato contenente 0,05% di Tween 20 (TBST / PBST) e regolare il pH desiderato con una quantità misurata di HCl o NaOH (per conoscere la forza ionica precisi) e la forza ionica desiderato con NaCl . Qui, utilizzare un pH di 7,5 ed una forza ionica di 150 mM. </li><li> Fare una soluzione di saturazione di2,5% (w / v) di latte scremato in polvere in TBST / PBST. </li><li> Per prevenire il legame non specifico, immergere la matrice in 5 ml di soluzione bloccante. Incubare la matrice per 2-4 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C su un agitatore. </li></ol> 3. Incubare con la proteina <ol><li> Lavare la matrice prima con 5 ml di soluzione di blocco per 30 sec e poi due volte con 5 ml di TBST / PBST per 5 minuti su un agitatore a temperatura ambiente. </li><li> Incubare la matrice lavato con 5 ml di His-tag soluzione proteica contenente 2,5% (w / v) di latte scremato in polvere per impedire legame non specifico. Qui, utilizzare 4,5 mM di soluzione proteica (STIL 500-650) disciolto nella soluzione di blocco descritto. NOTA: Generalmente 5-10 mM proteine ​​sono utilizzati per lo screening, ma la concentrazione di proteina può essere ancora a partire da 2-3 micron, a seconda della affinità di legame e le concentrazioni locali di peptidi che delimitano sulla matrice (efficienza del sintesi). Il buffer in cui la proteinaviene disciolto può variare ma è comune per diluire la proteina utilizzando la stessa soluzione di saturazione sopra descritto. </li><li> Incubare la matrice nella soluzione proteica per 3-8 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. </li></ol> 4. Incubare con l&#39;anticorpo <ol><li> Lavare l&#39;array tre volte con 5 ml di TBST / PBST. Il primo lavaggio è di 30 secondi seguito da due lavaggi 5 min su agitatore a temperatura ambiente. </li><li> Incubare la matrice lavato con 5 ml di anticorpo HRP-coniugato diluito (1: 1.500) in un tampone di incubazione che contiene gli stessi ingredienti alle stesse concentrazioni come la soluzione di saturazione, per 1 ora su un agitatore a temperatura ambiente. L&#39;anticorpo può legarsi sia alla proteina bersaglio o il tag. </li><li> Eseguire esperimenti di controllo testare l&#39;interazione dell&#39;anticorpo con peptidi sull&#39;array, specialmente se l&#39;array contiene peptidi dalla proteina bersaglio (ad esempio, per oligomerizzazione studi) ripetendo lo stesso protocollo senza step 3, incubando con la proteina. </li><li> Lavare l&#39;array tre volte con 5 ml di TBST / PBST. Il primo lavaggio è di 30 secondi seguito da due lavaggi 5 min su agitatore a temperatura ambiente. </li></ol> 5. Lettura del Array <ol><li> Effettuare sviluppo chemiluminescenza con un kit di substrato western blotting ECL. </li><li> Eseguire il rilevamento con un analizzatore di immagini luminescenti. </li><li> Analizzare i risultati. Assicurarsi che entrambi i duplicati su matrice mostrano gli stessi segnali, quindi i risultati sono affidabili. Se la struttura del partner proteina è noto, la ricerca sulla struttura dei peptidi leganti e cercare i siti di legame. Anche i peptidi che sono molto nella sequenza possono essere vicini nella struttura terziaria e creare un sito di legame. </li></ol>

<ol><li>Benyamini, H., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+peptides+to+study+protein%E2%80%93protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using peptides to study protein–protein interactions.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).</li>
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<li>Chaturvedi, P., Sudakin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chfr+regulates+a+mitotic+stress+pathway+through+its+RING-finger+domain+with+ubiquitin+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity.</a> Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).</li>
<li>Olaussen, K. a, Commo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+proapoptotic+effects+of+the+two+tyrosine+kinase+inhibitors+pazopanib+and+lapatinib+on+multiple+carcinoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines.</a> Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).</li>
<li>Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Vif%E2%80%93A3G+interaction+using+peptide+arrays%3A+A+basis+for+anti-HIV+lead+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).</li>
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<li>Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Basis+of+the+Interaction+between+Proapoptotic+Truncated+BID+%28tBID%29+Protein+and+Mitochondrial+Carrier+Homologue+2+%28MTCH2%29+Protein%3A+KEY+PLAYERS+IN+MITOCHONDRIAL+DEATH+PATHWAY%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).</li>
<li>Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+characterization+of+myosin+IIC+tailpiece+and+its+effect+on+filament+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo screening matrice Peptide è un ottimo strumento per identificare i siti di legame di una proteina bersaglio nei suoi partner. Questo test è veloce e facile da eseguire e il risultato può essere ottenuto in uno o due giorni lavorativi. Proiezione matrice Peptide è versatile e può essere utilizzato per vari scopi. Può essere usato per caratterizzare modifiche Traduzione successive come fosforilazione e identificare substrati di chinasi. Ad esempio: la chinasi FLT3, che è legato alla leucemia mieloide acuta, fosforila T...

Le interazioni proteina-proteina mediano maggior parte dei processi nella cellula vivente. Proteina deteriorate possono provocare malattie, rendendo le interazioni proteina importanti bersagli farmacologici. È quindi estremamente importante capire queste interazioni a livello molecolare. Interazioni proteine ​​sono studiate utilizzando una varietà di tecniche che vanno da saggi cellulari e biochimici per saggi biofisici quantitative, e questi possono essere eseguite sia con proteine ​​integrali, con domini proteici o peptidi. Peptidi servono come ottimi strumenti per studiare le interazioni delle proteine. Questo perché i peptidi possono essere facilmente sintetizzati e consentono la messa a fuoco su un sito di interazione specifica su un lato e più bersagli proteici in maniera elevata produttività dall&#39;altro 1,2 mano. Proiezione matrice Peptide è un veloce, facile da eseguire metodo per ottenere una grande quantità di dati sulle interazioni di una proteina bersaglio con numerosi partner in breve tempo 3. A differenza di altri metodi biochimici o biofisici per la rilevazione e l&#39;analisi di interazioni proteina-proteina, lo screening matrice peptide richiede una concentrazione molto bassa di proteine ​​e può rilevare molto debole legame. Array di peptidi possono essere utilizzati per molte applicazioni nelle interazioni peptide-proteina come la mappatura della proteina-proteina o recettore-ligando siti di interazione 4, interfacce omo- o etero-oligomerizzazione, anticorpi che caratterizzano epitopi 5, studiando attività enzimatiche 6 e throughput elevato struttura- rapporto di attività (SAR) studia 7. Per un esame approfondito circa lo screening gamma peptide vedere Katz et al. 4 Attualmente esistono diversi tipi di matrici di peptidi. Ci sono due principali strategie sintetiche per la preparazione di matrici peptide: sintesi dei peptidi prima di essere esposti al supporto solido, o per la sintesi di peptidi direttamente sul supporto solido, principalmente con la tecnica SPOT 4,8. Lapeptidi sono sintetizzati sul supporto solido solito da 9-fluorenilmetilossicarbonil (Fmoc) chimica 8. Tra gli schemi sintetici comuni sono allegati peptide attraverso il terminale N (ad esempio, JPT array pepstar 9) e l&#39;attaccamento peptide attraverso il terminale C (ad esempio, PEPSCAN array pepchip 10, JPT array pepspot 9 e INTAVIS array celluspot 11) 4. Il supporto solido può variare e così fa la chimica dell&#39;accoppiamento peptide ad esso. Peptidi Cys-terminati possono essere allegati ai vetrini tramite il gruppo tiolo 12. Il terminale N di un peptide può essere legato covalentemente ad un gruppo ossidrile sulla membrana di cellulosa attraverso esterificazione degli aminoacidi allegato 8. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per lo screening array di peptidi come metodo per lo studio delle interazioni proteina-proteina. L&#39;array che abbiamo usato è l&#39;array Celluspots, che è un micro-array che contiene grandi amount di macchie (duplicati fino a 384 punti) su una piccola membrana di cellulosa supportati da un vetrino. In questo modo si lavora con bassi volumi di proteine ​​e anticorpi e di ottenere significative quantità di dati per ogni singolo esperimento. Questa matrice contiene anche ad alta densità peptide che permette la rilevazione di bassa affinità di legame. L&#39;array è stato utilizzato per mappare l&#39;interazione STIL-CHFR, che è molto importante per il controllo della proliferazione delle cellule normali 13. Interazione incontrollata tra le due proteine ​​può portare allo sviluppo del cancro. Con la mappatura questa interazione abbiamo trovato il sito di legame specifico e residui 14 vincolanti. Questo spiana la strada per la progettazione di inibitori razionali che inibiscono questa interazione proteina-proteina.

<table><tbody><tr><td>Array di peptidi</td><td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>His-probe Antibody (H-3) HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8036 HRP</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ECL Kit</td><td>Industrie biologiche</td><td>20-500-120</td><td></td></tr><tr><td>Latte scremato</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>LAS-3000 fotocamera&nbsp;</td><td>Pellicola</td><td></td><td></td> FUJI</tr></tbody></table>

identificare proteina-proteina siti di interazione uso peptide array

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Le interazioni proteina-proteina mediano maggior parte dei processi nella cellula e soggiorno di controllo omeostasi dell&#39;organismo. Proteina deteriorate possono provocare malattie, rendendo le interazioni proteina importanti bersagli farmacologici. È quindi estremamente importante capire queste interazioni a livello molecolare. Interazioni proteine ​​sono studiate utilizzando una varietà di tecniche che vanno da saggi cellulari e biochimici per saggi biofisici quantitative, e questi possono essere eseguite sia con proteine ​​integrali, con domini proteici o peptidi. Peptidi servono come ottimi strumenti per studiare le interazioni proteina da peptidi possono essere facilmente sintetizzati e consentire la messa a fuoco su siti specifici di interazione. Array peptidici permettono l&#39;identificazione dei siti di interazione tra due proteine ​​così come screening per peptidi che si legano alla proteina bersaglio per scopi terapeutici. Essi consentono inoltre ad alto rendimento studi SAR. Per l&#39;identificazione di siti di legame, un Typimatrice peptide cal solito contiene parzialmente sovrapposte 10-20 residui peptidi derivati ​​dalle sequenze complete di una o più proteine ​​partner della proteina bersaglio desiderato. Screening matrice per legare la proteina bersaglio rivela i peptidi leganti, corrispondenti ai siti di legame delle proteine ​​partner, in un modo semplice e veloce utilizzando solo piccole quantità di proteine. In questo articolo si descrive un protocollo per lo screening array di peptidi per la mappatura dei siti di interazione tra una proteina bersaglio e dei suoi partner. L&#39;array peptide è stato progettato sulla base delle sequenze delle proteine ​​partner, tenendo conto delle loro strutture secondarie. Gli array utilizzati in questo protocollo sono stati Celluspots array preparati da INTAVIS bioanalitici Instruments. L&#39;array è bloccato per impedire il legame aspecifico e quindi incubate con la proteina studiata. Rilevamento utilizzando un anticorpo rivela i peptidi di legame corrispondenti ai siti specifici di interazione tra le proteine.

STIL è una proteina molto importante centrosomica. Controlla normale divisione cellulare e la proliferazione delle cellule 13,15 - 19. STIL interagisce con numerose proteine ​​18,20,21, e la maggior parte delle interazioni si verificano attraverso la sua parte centrale, che è una regione intrinsecamente disordinati (IDR) 14. Abbiamo progettato un array costituito da peptidi derivati ​​dalla proteina legante STIL CHFR. CHFR è un soppressore del tumore che è indotta in risposta a sollecita...

Lo screening dell'array di peptidi è un test ad alto rendimento per identificare i siti di interazione proteina-proteina. Ciò consente di mappare più interazioni di una proteina bersaglio e può servire come metodo per identificare i siti per gli inibitori che prendono di mira una proteina. Qui descriviamo un protocollo per lo screening e l'analisi degli array di peptidi.

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mappare l'interazione tra due proteine o domini proteici. In questo caso, vengono ancora studiati i domini proteici correlati al cancro e il CHFR. L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mappare l'interazione tra due proteine o domini proteici.In questo caso, vengono ancora studiati i domini proteici correlati al cancro e il CHFR. Il secondo passo consiste nell'incubare l'array di peptidi CHFR con il suo partner di legame, la proteina still. Successivamente, l'array viene lavato e incubato con perossidasi di rafano, anticorpo coniugato.L'array viene quindi sottoposto a rilevamento di luminescenza chimica per rilevare il legame. Il passo finale consiste nell'analizzare i risultati e identificare i siti di legame tra le proteine. Questo studio apre la strada alla progettazione di inibitori razionali del legame ancora CHFR, la cui interazione incontrollata può portare allo sviluppo del cancro.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella ricerca sull'interazione proteica, come ad esempio quali sono le regioni specifiche che meditano Un'interazione tra due proteine, dividere la sequenza della proteina ber

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Biologia

Tandem purificazione per affinità è un valido approccio per l'individuazione di partner di legame proteico. Come prova di concetto, questa metodologia è stata applicata al ben caratterizzato eIF4E fattore di inizio traduzione di co-precipitato i fattori coinvolti in cellule ospiti di inizio di traduzione. Questo metodo è facilmente adattabile a qualsiasi proteina cellulare o virale.

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

Questo video mostra una tecnica che utilizza peptidi biotinilati che penetrano nelle cellule per rilevare le interazioni intracellulari proteina-proteina. I peptidi che penetrano nelle cellule facilitano l'ingresso del peptide coniugato in una cellula e si legano specificamente alle sue proteine interagenti. La biotina, dopo essersi legata all'avidina, permette la purificazione del complesso proteico interagente da un lisato cellulare.

Sonda peptidica biotinilata a penetrazione cellulare per rilevare le interazioni proteina-proteina

Questo video mostra una tecnica che applica la tecnologia dei microarray di peptidi per profilare la specificità degli anticorpi che riconoscono le modifiche post-traduzionali (PTM) sui peptidi istonici. Un vetrino di microarray contenente peptidi istonici immobilizzati coniugati con fluorofori con combinazioni note di PTM viene trattato con anticorpi specifici per PTM target. Questo processo aiuta a identificare la specificità dell'anticorpo per il bersaglio e la sua potenziale reattività...

Una tecnologia di microarray peptidici per la profilazione della specificità degli anticorpi

Tecniche di sezionare i meccanismi alla base della secrezione del virus HIV-1 Nef in exosomes sono descritti. Peptidi brevi specifici derivati ​​dalla Nef e trasfezione di proteine ​​sono stati sfruttati per determinare la struttura, la funzione, e partner di legame di di Nef secrezione Modification Regione. Queste procedure hanno rilevanza generale in molti studi meccanicistici.

Identificazione Peptide-based di Motivi funzionali e dei loro partner di legame

Esperimenti di immunoprecipitazione SILAC rappresentano un potente mezzo per scoprire nuova proteina: interazioni proteina. Consentendo l'accurata quantificazione relativa abbondanza di proteine ​​sia nel controllo e campioni di prova, veri interazione può essere facilmente distinto da contaminanti sperimentali e interazioni bassa affinità conservata attraverso l'uso di condizioni di buffer meno stringenti.

Identificazione delle proteine ​​partner di interazione in cellule di mammifero Uso SILAC-immunoprecipitazione quantitativi Proteomica

Utilizzando microarray proteici contenenti quasi tutta la S. cerevisiae proteoma è sondato per un rapido interrogatori imparziale di migliaia di interazioni proteina-proteina in parallelo. Questo metodo può essere utilizzato per la proteina-piccola molecola, modificazione post-traslazionale, e altri saggi in high-throughput.

Probing ad alta densità di microarrays della proteina funzionali per rilevare le interazioni proteina-proteina

Gli array di peptidi sintetizzati con il metodo SPOT possono essere utilizzati per analizzare la specificità del substrato delle proteine lisina metiltransferasi (PKMT) e per definire lo spettro del substrato delle PKMT per comprendere il loro ruolo biologico. Questo protocollo descrive come sintetizzare array di peptidi, metilarli con PKMT e analizzare i risultati.

Analisi Specificità di proteine ​​lisina metiltransferasi Utilizzando SPOT Peptide Array

Questo manoscritto descrive i metodi per applicare la tecnologia del microarray peptide alla profilazione di specificità degli anticorpi che riconoscono gli istoni e le loro modificazioni post-traslazionali.

Analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide

Qui, presentiamo un protocollo di microarrays della proteina extracellulare dello schermo per l'identificazione delle interazioni recettore-ligando romanzo in elevato throughput. Inoltre descriviamo un metodo per migliorare la rilevazione delle interazioni proteina-proteina transitoria utilizzando complessi proteina-Microperlina.

Tecnologia di Microarray di proteina extracellulare per il rilevamento di Throughput elevato di interazioni recettore-ligando bassa affinità

Qui, presentiamo un protocollo per consentire la cattura e l'identificazione di interazioni proteina-proteina specifiche della malattia da cellule e tessuti nativi utilizzando sonde chimiche e spettrometria di massa. I set di dati di interazione risultanti vengono analizzati attraverso una piattaforma web dedicata per rivelare disfunzioni dinamiche della rete e alterazioni del percorso legate alla malattia.

Mappatura delle interazioni disfunzionali proteina-proteina nella malattia

Scopri come identificare siti di interazione proteina-proteina utilizzando peptide array con le proteine still e CHFR. Questo metodo ad alto rendimento aiuta a mappare le interazioni per la ricerca sul cancro.

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

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