Name: Purificare lImpure: sequenziamento metagenomi e Metatranscriptomes da campioni complessi animali associate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Impara a purificare campioni complessi associati all'ospite come lo sputo di fibrosi cistica per studiare comunità microbiche e virali mediante approcci metagenomici e metatranscrittomici.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) assegnato a Forest Rohwer. Ringraziamo Epicentre, una società di Illumina per fornire accesso anticipato ai kit Ribo-Zero Epidemiologia. Ringraziamo Mark Hatay per la progettazione e la produzione del supporto tubo ultracentrifugazione. Ringraziamo Andreas Haas e Benjamin Knowles per letture critiche e le discussioni del manoscritto, e Lauren Paolo per assistere il processo di ripresa.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Metagenomica virali Particelle virali sono concentrati utilizzando polietilene glicole (PEG) precipitazione o piccoli concentratori di volume. In alcuni casi, la concentrazione può non essere necessario, ma pre-filtrazione o centrifugazione a bassa velocità passi sono usati per rimuovere le cellule eucariotiche e microbiche. Lisati virali saranno ulteriormente arricchite e purificati mediante gradiente di densità ultracentrifugazione 9,41 o filtri di piccole dimensioni (ad esempio, 0,45 micron) per rimuovere le cellule microbiche eucariotiche e grandi 25. Gradiente di densità ultracentrifugazione viene in genere effettuata con soluzioni dense ma inerti come saccarosio o di cesio cloruro di isolare e concentrare le particelle virali 41. La separazione fisica si basa sulla dimensione e densità di galleggiamento di particelle virali. Pertanto, la corretta scelta della dimensione dei pori del filtro e la rigorosa preparazione di gradienti sono essenziali per isolare comunità virali specifici, come il successo del recupero fisico diVLP determina la comunità isolata 41 (cioè particelle virali che non passano attraverso il filtro o rientrano la densità di estrazione non saranno rilevate nel metagenoma). Dopo isolamento virale e concentrazione, ci possono essere contaminanti non virale materiale genomico presente nel campione sia nella forma di acidi nucleici liberi e microbica e cellule eucariotiche. Pertanto, è fondamentale per verificare la purezza di particelle virali nei campioni (Figure 1A e 1B). Un trattamento cloroformio è comunemente utilizzato per lisare cellule rimanenti, seguito da un trattamento con nucleasi di degradare gli acidi nucleici liberi prima dell&#39;estrazione dell&#39;acido nucleico. Un avvertimento al flusso di lavoro presentato è stato l&#39;uso della separazione gradiente di densità per isolare le particelle virali come può escludere particelle virali con involucro che possono essere troppo positivo per inserire il gradiente di CsCl. Un&#39;alternativa &quot;catch-all&quot; metodo è quello di omettere la SEPAR gradiente di densitàzione e isolare il DNA comunità dalle 0,45 micron - filtrati trattati con cloroformio e DNasi I. Questo approccio è anche opportuno accogliere piccoli volumi di campione come quelli di tamponi o plasma sanguigno. Tuttavia, ciò può provocare la contaminazione batterica cloroformio-resistenti e superiori quantità di DNasi I-resistenti DNA extracellulare. Protocolli di sequenziamento attuali richiedono 1 ng a 1 mg di acidi nucleici per la preparazione biblioteca sequenziamento del DNA per cui i rendimenti più elevati offrono una scelta più ampia di opzioni di sequenziamento. La concentrazione di DNA viromes generati varia spesso da sotto del limite di rilevazione a più di 200 ng / ml. La quantità di acidi nucleici virali recuperati può essere insufficiente per la preparazione diretta biblioteca sequenziamento. In tali casi, l&#39;amplificazione dell&#39;acido nucleico è essenziale. Amplificazione fucile librerie Linker (LASLs) 2,42,43 e tutta l&#39;amplificazione del genoma basata su più spostamenti di amplificazione (MDA) sono i duemetodi più comunemente utilizzati per generare DNA sufficiente per sequenziamento. MDA metodi come quelli basati su Phi29 DNA polimerasi sono noti a soffrire di pregiudizi amplificazione, e possono amplificare preferenzialmente ssDNA e DNA circolare, con conseguente tassonomico non quantitativa e caratterizzazione funzionale 44,45. Una versione ottimizzata dell&#39;approccio LASLs ha dimostrato introdurre solo distorsioni minime, promuove maggiore sensibilità (per piccole quantità di materiale di partenza), ed è facilmente adattato per diverse piattaforme 43 sequenziamento. Tuttavia, l&#39;approccio ha molti passaggi, richiede attrezzature specializzate per ridurre al minimo la perdita di DNA, ed è limitata ai modelli dsDNA. Nel nostro laboratorio, questo approccio è stato adattato con successo per amplificare quantità rilevabile e non rilevabili di DNA estratto da lavage- broncoalveolare, VLP-derivati ​​acqua coralline e mare (inediti e Hurwitz et al. 46). Lo sviluppo di gasdotti di analisi dei dati ha classically stato uno degli aspetti più impegnativi di analisi metagenomica virale a causa della natura altamente diversificata e in gran parte sconosciuti delle comunità virali. Mentre ci sono circa 10 8 genotipi virali nella biosfera, ad oggi attuali banche dati virali contenere ~ 4.000 genomi virali, che è circa 1 / 100.000 di questa diversità virale totale approssimativa. Pertanto, le ricerche basate similarità (come BLAST 47) per l&#39;assegnazione tassonomica e funzionale in metagenomi virali possiedono sfide inerenti. Molte sequenze non avere analogie significative genomi nel database, e di conseguenza, sono classificati come sconosciuti. Anche se le ricerche basate omologia-sono le applicazioni più importanti per l&#39;assegnazione di tassonomia e la funzione per la sequenza di dati, metodi alternativi basati su analisi indipendente dal database sono stati sviluppati 48- 50. Fancello et al. 51 forniscono una revisione completa di strumenti di calcolo e gli algoritmi utilizzati in Virametagenomica l. Microbica Metagenomica Tipicamente, la quantità totale di DNA estratto da comunità ipotonici lisi trattati microbiche (HL-DNA) vanno da 20 ng a 5 mg. La resa è fortemente dipendente dallo stato di salute del paziente e la quantità di campione di espettorato raccolti, che spiega le variazioni visti nella resa totale di HL-DNA estratto in questo studio (Tabella 2). I passaggi critici per generare dati di sequenza buona qualità affidamento sulla qualità delle librerie sequenziamento generati. Figura 2 mostra un intervallo tipico dimensioni per le librerie sequenziamento generati dal DNA microbico CF espettorato derivato utilizzando una procedura basata frammentazione del DNA enzimatica-. La dimensione ottimale biblioteca dipende dalla scelta della piattaforma sequenziamento e l&#39;applicazione, e di conseguenza, la procedura frammentazione può essere ottimizzata, se necessario, attraverso approcci alternativi come sonicazione e nebulizzazione. Inoltrei risultati rappresentativi presentati, il successo del metodo presentato su espettorato CF raccolti da più pazienti su più punti di tempo è anche illustrata in Lim et al. (2012) 9 e Lim et al. (2014) 10. Studi precedenti 9,10 suggeriscono che ogni paziente ospita un set unico di comunità microbica che sposta nel tempo, riflettendo così la persistenza dei principali attori all&#39;interno della comunità, mentre fluttuazioni sono probabilmente dovute a perturbazioni quali trattamenti antibiotici. Se queste fluttuazioni si verificano quotidianamente anche senza perturbazioni esterne oa causa di modalità di campionamento e trattamento del campione, è ancora in discussione. Basato sul metagenomic HL-DNA e l&#39;analisi amplicon 16S rDNA, il campionamento longitudinale 7 giorni mostra che la fluttuazione giornaliero di profili microbici senza perturbazioni antibiotico (giorno 1, 2 e 3) è minima (Figure 3A e 3B). Su introproduzione di antibiotici per via orale subito dopo il Day 3 di campionamento, i cambiamenti nel profilo di comunità divenne evidente il giorno 4. Mentre la ciprofloxacina antibiotico si rivolge a un ampio spettro di batteri patogeni noti come P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus e la polmonite, il trattamento aumentato la relativa abbondanza di P. aeruginosa mentre diminuendo il spp Streptococcus. e P. melaninogenica. By Day 6, la comunità lentamente recuperato alla struttura iniziale comunità di partenza. I risultati suggeriscono che le fluttuazioni dei profili microbici all&#39;interno di un singolo paziente è più probabile a causa di perturbazioni della comunità nelle vie aeree. Data la coerenza tra i profili microbici delle biblioteche 16S rDNA e metagenomi di DNA HL-derivato, abbiamo escluso i pregiudizi derivanti dai primer 16S rRNA utilizzati in questo studio. Una possibile spiegazione per le differenze viste attraverso 16S rDNA tassonomicaprofili AL generati dal DNA totale e DNA HL-derivato (Figura 3B) possono essere la presenza di elevate quantità di Pseudomonas spp. DNA extracellulare dopo il trattamento antibiotico. Questo è supportato dai risultati che queste differenze sono più evidenti a 7 ° giorno, tre giorni dopo il trattamento di antibiotici, che si rivolge Pseudomonas spp. oltre ad altri. La ciprofloxacina è comunemente usato come trattamento di prima linea nei pazienti con FC e P. cronica infezione aeruginosa anche se il suo spettro di attività include la maggior parte patogeni CF-associate. Abbiamo ipotizzato che il trattamento antibiotico sradica le comunità a rischio, tra cui Streptococcus spp. e quindi la creazione di una nicchia riempito da resistente P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa può ottenere aumentando la resistenza sue comunità biofilm e DNA extracellulare ha dimostrato di essere il principale sostegno strutturale della sua architettura biofilm 52. Anche se tegli struttura della comunità recuperato, DNA extracellulare può stare nella CF sputo. Pertanto, questi dati suggeriscono che la lisi ipotonica e le fasi di lavaggio presentati in questo flusso di lavoro potenzialmente beneficiare non solo rimuovere il DNA di derivazione umana, ma il DNA extracellulare anche microbica derivato che possono falsare i profili microbici reali. Metatranscriptomics Un&#39;alta qualità metatranscriptome deve contenere relativamente poche sequenze di RNA ribosomiale (rRNA) e rappresentano un campione imparziale delle trascrizioni comunità (mRNA). A causa della breve emivita e quantità limitata di mRNA, è fondamentale che il protocollo, come presentato qui, riduce al minimo la manipolazione del campione per massimizzare il numero di trascrizioni recuperati. Negli ultimi anni, numerosi approcci per rRNA deplezione sono stati sviluppati e adattati in kit disponibili in commercio. Questi includono MicroB Enrich, Ribo-Zero, e specifici del campione sottrattiva hybridizations 53 che si basano sulla oligonucleotide ibridazione, e l&#39;mRNA SOLO kit che si basa sull&#39;attività enzimatica exonuclease RNA mira contenente un &#39;monofosfato 5. Inoltre, diversi approcci per arricchimenti mRNA come il MessageAmp Kit II-I batteri che polyadenylates preferenzialmente ed amplifica RNA lineari sono inoltre disponibili. Alcuni di questi metodi (ad esempio, di mRNA-ONLY, MicroB E Xpress e la MessageAmp) vengono utilizzati contemporaneamente per l&#39;efficienza ottimale. Tuttavia, l&#39;efficacia di tutti questi approcci sono limitati, in particolare quando si lavora con parzialmente degradata rRNA, come spesso osservato in RNA totale estratto da campioni CF. Poliadenilazione dipendente RNA amplificazione non può essere utilizzato per generare metatranscriptomes costituiti sia mRNA eucariotico e procariotica. Inoltre, il poli (A) coda aggiunto alle sequenze può ridurre la quantità di dati di sequenza utili. Regioni con tratti omopolimero tenderanno ad avere punteggi di qualità inferiori, causing un numero significativo di legge per essere filtrati dal sequenziamento e software di post-sequencing, e la durata media di lettura utile dopo il taglio off poly (A) code saranno ridotti significativamente 54. Trattare con le comunità microbiche complesse CF e RNA parzialmente degradati (Figure 4A e 4C), il nostro studio precedente ha mostrato che il metodo di ibridazione-capture dal kit oro Ribo-Zero è stato più efficace nella rimozione sia rRNA umana e microbica rispetto ai trattamenti combinare con altri kit 9 (tabella 3). I dati risultante permette l&#39;analisi simultanea di entrambi ospite umano e trascrizioni microbiche. A seconda della resa e la qualità dell&#39;RNA, nonché scelta definitiva della piattaforma di sequenziamento, molti di questi processi compreso sintesi passo cDNA possono essere semplificati con generazione librerie sequenziamento. Ad esempio, RNA trattato Ribo-Zero può essere usato per fare metatranscriptome sequenziamento libraRies utilizzando kit ScriptSeq RNA-Seq Biblioteca Preparazione. Analisi metagenomica di comunità animali associate fornisce una rappresentazione completa dell&#39;entità funzionale globale che comprende l&#39;host e le sue comunità associate. Il flusso di lavoro qui presentato è adattabile ad una varietà di campioni animali associata complesse, in particolare quelli che contengono muco denso, elevate quantità di detriti cellulari, DNA extracellulare, proteine ​​e complessi glicoproteici, così come cellule ospiti, oltre al microbica virale e desiderato particelle. Anche se le particelle virali e microbiche possono essere persi ad ogni passo, particelle isolamento e purificazione sono essenziali per minimizzare la quantità di DNA ospite. Mentre i dati metagenomica offre potenzialità metaboliche delle comunità esaminati, metatranscriptomics completare tale rivelando l&#39;espressione differenziale delle funzioni codificate 9. Una valutazione completa dei dati genomica e trascrizioni ha dato nuove insIRITTI alla dinamica delle interazioni nelle comunità e facilita lo sviluppo di migliorare terapie 9,10,55.

<html> Comunità virali e microbiche associate con il corpo umano sono stati studiati estesamente negli ultimi dieci anni attraverso l&#39;applicazione di tecnologie di sequenziamento 1,2. I risultati hanno portato al riconoscimento dei microbi importanza nella salute umana e la malattia. L&#39;importante iniziativa è venuto dal progetto umano microbioma che descrive i batteri (e alcuni archeobatteri) residenti sulla pelle umana, e all&#39;interno di cavità orale, vie respiratorie, del tratto urogenitale e gastrointestinale 3. Ulteriori studi microbioma di sane vie aeree umani attraverso lavaggio broncoalveolare (BAL) di 4,5 e tamponi nasofaringei 4 hanno dimostrato che il polmone può servire come strumento di campionamento ambientale, i risultati di colonizzazione microbica transitoria nelle vie aeree. Tuttavia, l&#39;impatto della colonizzazione microbica in superfici delle vie aeree con problemi può portare a infezioni polmonari gravi e croniche, come quelli visti in fibrosi cistica (CF) pazienti. t &quot;&gt; CF è una malattia genetica letale causata dalla mutazione in transmembrana della fibrosi cistica regolatore (CFTR) gene 6. Queste mutazioni generano proteine ​​CFTR difettosa che a loro volta influenzano il trasporto di ioni transepiteliale attraverso la superficie apicale dell&#39;epitelio. La malattia colpisce molteplici sistemi di organi, ma la maggior parte di mortalità e morbilità è imputabile a malattie polmonare FC 7. Il polmone CF fornisce un ecosistema unico per la colonizzazione microbica. Il difetto di trasporto di ioni provoca muco per costruire nelle vie aeree CF, creando microambienti, comprensivi di aerobica , microaerofili e scomparti anaerobici ancorati da una superficie mucosa ricca di nutrienti statico. Questo ambiente facilita la colonizzazione e la proliferazione di microbi, tra cui virali, batteri e funghi. acuta e le infezioni microbiche polmonari croniche portano a risposte immunitarie costanti ma inefficaci, con conseguente ampio rimodellamento delle vie aeree, perdita di capacità polmonare, e in ultima analisi pulmofallimento nario. Comunità batteriche associate al polmone CF sono stati ben descritti utilizzando approcci cultura-dipendenti e cultura indipendente, che includono uso 16S RNA ribosomiale (rRNA) gene sequenziamento 8 e metagenomica fucile 9,10. L&#39;approccio basato rRNA 16S è in grado di caratterizzare una vasta gamma di specie microbiche e catturare ampi cambiamenti nella diversità delle comunità. Tuttavia, è limitata nella sua risoluzione nella definizione comunità (riassunte Claesson et al. 2010 11) e le previsioni di potenziali metaboliche sono limitati a tali funzioni generali noti per il taxa identificati. Pertanto, 16S rRNA metodi di sequenziamento del gene sono insufficienti per il necessario tassonomica e funzionale la precisione analitica delle diverse comunità microbiche presenti nei polmoni CF. L&#39;approccio metagenomica descritto qui completa l&#39;approccio basato rRNA 16S, supera i suoi limiti, e consente un modo relativamente efficaceper analizzare sia la tassonomia comunità microbica e contenuto genetiche nei polmoni CF. DNA microbica isolato da campioni animale associato spesso contiene una grande quantità di DNA ospite. Campioni di espettorato o tessuto polmonare CF solito contengono una grande quantità di DNA umano rilasciata dai neutrofili nella risposta immunitaria, spesso superiore al 99% del DNA totale 12 - 14. Sebbene alcune cellule umane intatti possono essere presenti, la maggior parte di questo DNA è libero in soluzione o adsorbiti sulla superficie dei microbi. Inoltre, la presenza di tappi particolarmente viscosi muco, detriti cellulari e altri contaminanti sconosciuti complicare ulteriormente isolamento delle cellule microbiche. Diversi metodi sono stati testati per deplezione questi campioni di DNA umano, compresi Percoll a gradienti umana separata da cellule microbiche 15, il trattamento con DNasi I, bromuro di etidio monoazide a degradare selettivamente DNA umano 16, e il kit MolYsis, tutti con successo limitato.<html> Ad oggi la procedura di purificazione del DNA microbico più efficace per CF espettorato è una modificazione del processo descritto da Breitenstein et al. (1995) 17. Questo approccio, noto come metodo qui ipotonica lisi (HL), utilizza una combinazione di β-mercaptoetanolo per ridurre mucina legami disolfuro, lisi ipotonica delle cellule eucariotiche e trattamento DNasi I di DNA solubile 9. Nonostante la mancanza di alternative al metodo HL ha sollevato alcune preoccupazioni a causa di (i) eventuali pregiudizi derivanti dalla lisi indesiderato di microbi e (ii) se le fluttuazioni osservate nella composizione della comunità 9,10 sono un artefatto di variazioni associate con l&#39;elaborazione del campione. Oltre alla generazione di metagenomi fucile, abbiamo affrontare questi problemi confrontando i profili del gene 16S rRNA del DNA totale e DNA microbico estratto dal metodo HL utilizzando la stessa serie di campioni di espettorato raccolti da un singolo paziente in sette giorni consecutivi. ent &quot;&gt; Rispetto alla comunità microbiche, la caratterizzazione delle comunità virali associati con gli animali è limitato 18,19 Le comunità virali CF vie aeree sono state caratterizzate solo in minima parte 20 -.. 22 Il primo studio metagenomica caratterizza il DNA delle comunità virali in CF vie respiratorie hanno dimostrato che la maggior parte dei virus associati polmoni CF sono fagi 20. Il potenziale metabolico del fago in CF e individui non-CF è stata significativamente diversa. In particolare, le comunità dei fagi in individui CF effettuate geni riflettente di adattamenti ospitanti batteriche alla fisiologia del CF vie aeree, e batterici di virulenza. 20 studi metagenomiche successivi di virus nel tessuto polmonare CF dimostrato distinto eterogeneità spaziale delle comunità virali tra le regioni anatomiche 22. Inoltre, il tessuto polmonare CF ospitava la diversità virale più basse fino ad oggi in qualsiasi ecosistema 22. La maggior parte dei virus identificati erano fagicon la possibilità di infettare i patogeni CF. Tuttavia, sono state rilevate anche virus eucariotiche quali herpesvirus, adenovirus e virus del papilloma umano (HPV). In un caso in cui sono stati osservati cisti nel tessuto polmonare durante la dissezione, più del 99% di un genoma papillomavirus umano è stato recuperato, anche se il paziente non è mai stato diagnosticato un papilloma polmonare o carcinoma. Ciò indica che la diversità virale presente non solo riflette la gravità del danno tissutale, ma può anche esporre e spiegare una malattia non caratterizzato sottostante. I protocolli descritti forniscono un modo semplice, ma potente per isolare particelle virali (VLPs) da campioni che consistono di grandi quantità di muco denso, di accoglienza e di cellule microbiche, DNA libero, così come detriti cellulari. A complemento metagenomica, metatranscriptomics viene utilizzato per monitorare le dinamiche di espressione genica in tutta la comunità microbica e l&#39;host 9,23. In questo caso, sia microbica e host mRNA devono essere preferenzialmente selezionato. Poiché mRNA batteriche non sono poliadenilato, un metodo di pull-down mRNA basato oligo-dT non può essere sfruttata. Poliadenilazione dipendente RNA amplificazione non può essere utilizzato in campioni ospitanti associata se sono noti i campioni contengono grandi quantità di mRNA eucariotico. Molti campioni animali-associata, compresi CF espettorato, contengono un&#39;alta densità di cellule oltre a elevate quantità di detriti cellulari e nucleasi che includono RNasi. Pertanto, un altro compito impegnativo è quello di evitare una eccessiva degradazione dell&#39;RNA durante metatranscriptome lavorazione. Nella maggior parte dei casi, l&#39;RNA totale estratto da espettorato CF è parzialmente degradata, limitando le applicazioni a valle e l&#39;utilità del RNA derivato. Negli ultimi anni, numerosi approcci per rRNA deplezione sono stati sviluppati e adattati in kit disponibili in commercio. L&#39;efficacia di questi approcci è tuttavia limitata, soprattutto quando si lavora con parzialmente degradato rRNA 9,24. I metodi impiegati qui consentonoed per il recupero di RNA totale parziale degrado adatto per la rimozione efficiente rRNA totale valle. Confronto diretto della efficienza nella rimozione rRNA parzialmente degradata da RNA totale confrontando due diversi kit è stato illustrato da Lim et al. (2012) 9. In generale, lo scopo di questo manoscritto è quello di fornire un set completo di protocolli (figura 1) per generare metagenomi fucile virali e microbiche, e un metatranscriptome, da un singolo campione animale-associata, utilizzando campione di espettorato indotto come esempio. Flusso di lavoro di laboratorio molecolare dovrebbe includere zone pre e post-amplificazione separati per ridurre al minimo la contaminazione incrociata. I metodi sono facilmente adattabili ad altri tipi di campioni come il tessuto 22, nasofaringeo e orofaringei 25, lavaggio broncoalveolare (BAL) e corallo (dati non pubblicati). Ogni campione deve essere trattato immediatamente al momento della raccolta soprattutto quando metagenomica microbica e ha incontratoatranscriptomics studi sono desiderati. Se sono stati congelati i campioni, limita l&#39;isolamento di cellule microbiche intatte per metagenomi microbici come il congelamento potenzialmente compromettere l&#39;integrità delle cellule. Tuttavia, il congelamento non esclude metatranscriptomics e isolamento virale, ma la qualità di RNA e la quantità di particelle virali recuperati possono essere influenzati attraverso il processo di congelamento-scongelamento. È importante notare che espettorato indotto è servito come fonte primaria di campioni in molti studi associati pazienti CF adulti e altre malattie polmonari croniche come 26,27 BAL può essere troppo invasivo. Nei nostri studi, campioni di espettorato sono stati raccolti con un metodo di campionamento attenta e coerente, cioè, dopo collutorio e risciacquo della cavità orale con soluzione salina sterile per mantenere la contaminazione microbi orali nei campioni di espettorato al minimo.

<table><tbody><tr><td>Tampone per lisi dell'RNA a base di isotiocianato di guanidina</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td>TRIzol LS Il reagente è stato utilizzato in questo studio</td></tr><tr><td>Perle di silice; da 0,1 a 0,15 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-36270-62</td><td>Perle di silicato di zirconio sono state utilizzate in questo studio</td></tr><tr><td>Ditiotreitolo, grado molecolare (polvere secca)</td><td>Promega</td><td>V3155</td><td>Può essere acquistato da qualsiasi altra azienda</td></tr><tr><td>Filtro per siringa sterile; 0,45 & micro; m dimensione dei pori membrana PVDF idrofila</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>enzima DNasi I&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Filtro sterile per siringa; 0,02 &; micro; m dimensione dei pori</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-13</td><td>Diametro: 25 mm</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga ultra-trasparenti</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 &frac12; in. (14 x 90 mm), adatto per rotore SW41 Ti e ultracentrifugazione a gradiente di densità VLP</td></tr><tr><td>Rotore SW41 Ti Rotore</td><td>Beckman</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 rotore ad angolo fisso</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA polimerasi</td><td>Monserate Biotech</td><td>4001</td><td>10 U/&micro; l</td></tr><tr><td>Phi29 Random Hexamer</td><td>Thermo Scientific</td><td>S0181</td><td>Precedentemente acquistato da Fidelity Systems</td></tr><tr><td>Filtro a matrice di allumina con anello di supporto anulare in polipropilene; 0,02 &; m dimensione dei pori</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-34</td><td>In questo studio sono state utilizzate membrane filtranti Whatman Anodisc; diametro 25 mm</td></tr><tr><td>SYBR Gold colorante in gel di acido nucleico</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DNasi priva di RNasi I&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>Può essere acquistato da qualsiasi altra azienda</td></tr><tr><td>Glicogeno, grado RNA</td><td>FisherScientific</td><td>FERR0551</td><td>Può essere acquistato da qualsiasi altra azienda</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga ad alta velocità Oak Ridge</td><td>FisherScientific</td><td>05-562-16B</td><td>Per la procedura di estrazione del DNA di grandi volumi, adatto per rotore ad angolo fisso SS-34</td></tr><tr><td>Kit di rimozione dell'rRNA totale</td><td>Epicentro</td><td>MRZE724</td><td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiologia) può essere utilizzato per accoppiare la rimozione dell'rRNA con la preparazione della libreria di sequenziamento</td></tr><tr><td>Cloruro di cesio</td><td>FisherScientific</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr><tr><td>Esadecitrimetil-ammonio bromuro (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

purificare l&#39;impure: sequenziamento metagenomi e metatranscriptomes da campioni complessi animali associate

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

L&#39;accessibilità di high-throughput sequencing ha rivoluzionato molti campi della biologia. Per comprendere meglio le comunità virali e microbiche ospite-associato, un flusso di lavoro completo per l&#39;estrazione di DNA e RNA è stato sviluppato. Il flusso di lavoro genera contemporaneamente metagenomi virali e microbiche, nonché metatranscriptomes, da un singolo campione per sequenziamento di prossima generazione. L&#39;accoppiamento di questi approcci fornisce una panoramica sia delle caratteristiche tassonomiche e le funzioni della community codificato. I metodi presentati usano fibrosi cistica (CF) espettorato, un tipo di campione problematica, poiché è estremamente viscoso e contiene elevata quantità di mucine, DNA neutrofili libera, e altri contaminanti sconosciuti. I protocolli descritti qui di mira questi problemi e con successo il recupero del DNA virale e microbico alla contaminazione minima DNA umano. Per completare gli studi metagenomica, un protocollo metatranscriptomics è stato ottimizzato per recuperare sia microbicae mRNA host che contiene relativamente pochi RNA ribosomiale (rRNA) sequenze. Una panoramica delle caratteristiche dei dati viene presentato per servire come riferimento per valutare il successo dei metodi. Altri campioni di espettorato CF sono stati raccolti per (i) valutare la consistenza dei profili microbioma in sette giorni consecutivi in ​​un solo paziente, e (ii) confrontare la coerenza di approccio metagenomica per un sequenziamento basato sui geni 16S RNA ribosomiale. I risultati hanno mostrato che la fluttuazione giornaliera dei profili microbici senza perturbazione antibiotico era minimo ei profili di tassonomia dei comuni batteri CF-associate sono stati molto simili tra le librerie 16S rDNA e metagenomi generati dalla lisi ipotonica (HL) DNA -derived. Tuttavia, le differenze tra i profili tassonomiche 16S rDNA generati dal DNA totale e HL-DNA derivato suggeriscono che lisi ipotonica e le fasi di lavaggio vantaggio non solo rimuovere il DNA di derivazione umana, ma anche extracellul microbica-derivatiDNA ar che possono travisare i profili microbici effettivi.

Utilizzando fibrosi cistica vie respiratorie come esempio, il manoscritto presenta un flusso di lavoro comprendente una combinazione di approcci metagenomiche e metatranscriptomic per caratterizzare la comunità microbiche e virali in campioni animali-associata.

Purificare l&#39;Impure: sequenziamento metagenomi e Metatranscriptomes da campioni complessi animali associate

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di raccogliere ed elaborare campioni associati all'ospite complesso come la fibrosi cistica, l'espettorato, per studiare le comunità virali e microbiche utilizzando approcci metagenomici e metatrascrittomici. Ciò si ottiene facendo prima inalare al soggetto una soluzione salina ipertonica al 7% tramite un nebulizzatore, e quindi raccogliendo campioni di espettorato indotto per un periodo di tempo di 30 minuti. Successivamente, il campione viene immediatamente omogeneizzato e distribuito equamente in quattro provette etichettate come metagenoma virale, metagenoma microbico, metatrascrittoma ed espettorato extra.Successivamente, la provetta del metatrascrittoma viene sigillata, posizionata orizzontalmente e l'espettorato omogeneizzato a velocità media per 10 minuti. Infine, le singole aliquote vengono elaborate separatamente per isolare e purificare le cellule virali o batteriche prima dell'isolamento dell'acido nucleico per gli studi metagenomici. In definitiva, gli acidi nucleici isolati vengono utilizzati per la preparazione di librerie di sequenziamento ad alto rendimento per generare librerie di metagenomica e metatrascrittomica.Il vantaggio principale di questa procedura è che fornisce un flusso di lavoro completo per elaborare campioni associati all'ospite complesso per lo studio delle comunità virali e batteriche a livello di DNA e RNA. La dimostrazione visiva di questa procedura è fondamentale in quanto le fasi di pretrattamento del campione sono importanti per garantire una corretta manipolazione del campione, mentre le fasi di purificazione delle cellule virali e microbiche sono difficili da apprendere a causa della complessità della procedura Prima della raccolta del campione, etichettare quattro provette da 15 millilitri per campione con le seguenti, la prima con metagenoma virale, il secondo come metagenoma microbico numero tre con metatrascrittoma e tubo numero quattro come espettorato extra. Aggiungere due millilitri di perle di silice da 0,1 millimetri nel metatrascrittoma marcato con la provetta, seguiti da sei millilitri di tampone di lisi dell'RNA a base di isotiocianato di guina, o tampone di lisi GITC.Seguendo la procedura di raccolta del campione descritta nel protocollo di testo e utilizzando coppette per campioni pre-wade, stimare il volume del campione pesando la tazza dopo la raccolta del campione e sottrarre il peso della tazza vuota. Per il peso rimanente, un grammo equivarrà a un millilitro di campione. Se il volume del campione è inferiore a otto millilitri, aggiungere il volume appropriato di 0,02 micrometri filtrato con un XPBS per portare il volume finale fino a otto millilitri.Quindi, utilizzare immediatamente una siringa da tre millilitri per omogeneizzare il campione fino a quando non rimangono grumi visibili all'interno dell'espettorato: utilizzando la stessa siringa, aspirare immediatamente due millilitri di espettorato e iniettarlo nella provetta del microtrascrittoma contenente perle di silice e tampone di lisi GITC. Chiudere il coperchio e utilizzare una pellicola para per sigillare saldamente il coperchio Per evitare perdite, utilizzare un vortice, signore per omogeneizzare immediatamente l'espettorato a velocità media per 10 minuti. Utilizzando la stessa aliquota della siringa, due millilitri di espettorato ciascuno nelle provette etichettate con metagenoma vira e metagenoma microbico, e trasferire l'espettorato rimanente dalla coppa dell'espettorato nella provetta etichettata come espettorato extra.Conservare tutte le provette a quattro gradi Celsius o su ghiaccio e trasportarle in laboratorio, se necessario, per generare un metagenoma virale. A seguire la preparazione di tamponi e soluzioni. Pretrattare i campioni aggiungendo un tampone di magnesio salino filtrato da 0,02 micrometri per un volume totale di sei millilitri.Per facilitare la dissoluzione del muco, aggiungere sei millilitri di 6,5 millimolari di DTT a ciascun campione. Agitare energicamente per mescolare e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Dopo un vigoroso vortice, i campioni ruotano nuovamente a 3056 Gs e 10 gradi Celsius per 15-20 minuti.Raccogliere ogni surnatante in un nuovo tubo da 15 millilitri. Successivamente, utilizzare un filtro a punta da 45 micrometri montato su una siringa per filtrare i surnatanti in nuove provette da 15 millilitri. Rimuovere 100 microlitri di campione in una provetta per microfughe e quindi eseguire il trattamento con cloroformio.Estrarre il surnatante ed eseguire il trattamento DN one. Aggiungere un volume uguale del 4% di formaldeide per fissare il campione. Per la microscopia a epifluorescenza, fare riferimento al protocollo di testo per un approccio di arricchimento di particelle virali catch-all.Altrimenti, utilizzando soluzioni di cloruro di cesio appena preparate, impostare un gradiente di cloruro di cesio caricando un millilitro di 1,7 grammi per millilitro di soluzione di cloruro di cesio in ciascuna provetta, seguito da un millilitro di 1,5 grammi per millilitro, un millilitro di un virgola 35 grammi per millilitro e, infine, un millilitro di 1,2 grammi per millilitro di soluzione di cloruro di cesio. Infine, caricare da sei a otto millilitri di campione in provette a gradiente individuale. Contrassegna i singoli livelli per indicare la posizione di ciascuna frazione.Quindi bilancia ogni coppia di due opposta entro un milligrammo. Bloccare con cura ciascun tubo nel secchio di centrifuga. Caricare sul rotore e centrifugare a 82, 844 Gs e quattro gradi Celsius per due ore.Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela le provette dal supporto senza interrompere i gradienti di densità con un ago calibro 18 collegato a una siringa da tre millilitri. Assicurarsi che l'estremità aperta dell'ago sia rivolta verso l'alto. Forare il tubo appena sotto lo strato di densità di 1,5 grammi per millilitro e aspirare lentamente circa 1,5 millilitri di soluzione nella siringa.Rimuovere lentamente l'ago e lasciare che la frazione rimanente nel tubo goccioli in un nuovo tubo da 15 millilitri attraverso la puntura. Etichettare come frazione superiore vita Trasferire la soluzione nella siringa contenente il V ps in due nuovi tubi per micro fuge. Una volta che i tamponi e le soluzioni sono stati preparati, secondo il protocollo di testo, aggiungere cinque volumi di punto 22 micrometrico filtrato un XPBS Per diluire ciascun omogenato sotto una cappa chimica, aggiungere beta MAR capta etanolo a una concentrazione finale del 2% in volume e agitare la miscela a temperatura ambiente per due ore dopo l'incubazione.Far girare il campione a 3056 GS e 10 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, utilizzare 10 millilitri di acqua di grado molecolare per risospendere il pellet e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti prima di ripetere il lavaggio. Dopo un giro finale, e una volta che la natina SUP è stata scartata, utilizzare cinque millilitri di un tampone XDNA per risospendere il pellet prima di aggiungere 15 microlitri di ds.Uno per millilitro di campione Incubare a 37 gradi Celsius mescolando ripetutamente per due ore. Dopo aver centrifugato i campioni e scartato lo snat, utilizzare 10 millilitri di tampone SE per risospendere il pellet. Quindi centrifugare il campione e ripetere il lavaggio.Utilizzare due millilitri di tampone SE per risospendere il pellet e trasferire la sospensione in due tubi micro fuge. Quindi centrifugare i tubi a 16.000 GS a temperatura ambiente per 15 minuti. Infine, dopo aver rimosso il surnatante, utilizzare un kit di estrazione del DNA genomico seguendo le istruzioni per i batteri gram-positivi.Per isolare il DNA, i risultati precedenti per generare metagenomi virali sono riassunti qui. I vironi contengono poche sequenze di derivazione umana con un solo campione contenente il 70% di campione di DNA umano CCF quattro A è stato omesso dalla fase di ultracentrifugazione a gradiente di densità e, di conseguenza, conteneva più del 97% di sequenze derivate dall'uomo. Questa figura mostra un'immagine fluorescente di un tipico campione di espettorato CF prima e dopo l'ultracentrifugazione con gradiente di densità.Vlp chiari sono stati osservati in assenza di particelle di grandi dimensioni dopo la separazione del gradiente di densità vista qui. Sette campioni giornalieri di espettorato sono stati raccolti da un singolo paziente con fibrosi cistica che ha iniziato con antibiotici orali. Dopo il terzo giorno di raccolta, la resa totale della lisi ipotonica derivata o del DNA HL raccolto da ciascun campione variava da 210 nanogrammi a oltre cinque microgrammi dalle librerie di sequenziamento Illumina generate per ciascun campione.Tutte le librerie tranne una hanno prodotto più di 1 milione di sequenze e oltre l'85% di sequenze di alta qualità sono state conservate dopo la pre-elaborazione dei dati. Utilizzando il software print seq, la quantità totale di sequenze derivate dall'uomo variava dal 14% al 46%Come mostrato qui, i profili microbici dei sottocampioni sono molto simili ai campioni dopo due trattamenti di lisi ipotonica. Inoltre, la seconda lisi ipotonica aumenta la frazione di sequenze non umane dal 6 al 17% all'interno dei metagenomi.Non dimenticare che lavorare con campioni clinici e potenziali agenti patogeni può essere estremamente pericoloso. I dispositivi di protezione individuale devono essere sempre utilizzati in ogni momento durante la manipolazione dei campioni. Durante l'esecuzione di questa procedura sono necessarie buone tecniche di biologia molecolare e microbiologia per garantire l'assenza di contaminazione.Seguendo questa procedura, dovresti essere in grado di eseguire studi metagenomici virali e microbici, nonché metatrascrittomici da campioni complessi come l'espettorato FC.

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