Purificare l'Impure: sequenziamento metagenomi e Metatranscriptomes da campioni complessi animali associate

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di raccogliere ed elaborare campioni associati all'ospite complesso come la fibrosi cistica, l'espettorato, per studiare le comunità virali e microbiche utilizzando approcci metagenomici e metatrascrittomici. Ciò si ottiene facendo prima inalare al soggetto una soluzione salina ipertonica al 7% tramite un nebulizzatore, e quindi raccogliendo campioni di espettorato indotto per un periodo di tempo di 30 minuti. Successivamente, il campione viene immediatamente omogeneizzato e distribuito equamente in quattro provette etichettate come metagenoma virale, metagenoma microbico, metatrascrittoma ed espettorato extra.

Successivamente, la provetta del metatrascrittoma viene sigillata, posizionata orizzontalmente e l'espettorato omogeneizzato a velocità media per 10 minuti. Infine, le singole aliquote vengono elaborate separatamente per isolare e purificare le cellule virali o batteriche prima dell'isolamento dell'acido nucleico per gli studi metagenomici. In definitiva, gli acidi nucleici isolati vengono utilizzati per la preparazione di librerie di sequenziamento ad alto rendimento per generare librerie di metagenomica e metatrascrittomica.

Il vantaggio principale di questa procedura è che fornisce un flusso di lavoro completo per elaborare campioni associati all'ospite complesso per lo studio delle comunità virali e batteriche a livello di DNA e RNA. La dimostrazione visiva di questa procedura è fondamentale in quanto le fasi di pretrattamento del campione sono importanti per garantire una corretta manipolazione del campione, mentre le fasi di purificazione delle cellule virali e microbiche sono difficili da apprendere a causa della complessità della procedura Prima della raccolta del campione, etichettare quattro provette da 15 millilitri per campione con le seguenti, la prima con metagenoma virale, il secondo come metagenoma microbico numero tre con metatrascrittoma e tubo numero quattro come espettorato extra. Aggiungere due millilitri di perle di silice da 0,1 millimetri nel metatrascrittoma marcato con la provetta, seguiti da sei millilitri di tampone di lisi dell'RNA a base di isotiocianato di guina, o tampone di lisi GITC.

Seguendo la procedura di raccolta del campione descritta nel protocollo di testo e utilizzando coppette per campioni pre-wade, stimare il volume del campione pesando la tazza dopo la raccolta del campione e sottrarre il peso della tazza vuota. Per il peso rimanente, un grammo equivarrà a un millilitro di campione. Se il volume del campione è inferiore a otto millilitri, aggiungere il volume appropriato di 0,02 micrometri filtrato con un XPBS per portare il volume finale fino a otto millilitri.

Quindi, utilizzare immediatamente una siringa da tre millilitri per omogeneizzare il campione fino a quando non rimangono grumi visibili all'interno dell'espettorato: utilizzando la stessa siringa, aspirare immediatamente due millilitri di espettorato e iniettarlo nella provetta del microtrascrittoma contenente perle di silice e tampone di lisi GITC. Chiudere il coperchio e utilizzare una pellicola para per sigillare saldamente il coperchio Per evitare perdite, utilizzare un vortice, signore per omogeneizzare immediatamente l'espettorato a velocità media per 10 minuti. Utilizzando la stessa aliquota della siringa, due millilitri di espettorato ciascuno nelle provette etichettate con metagenoma vira e metagenoma microbico, e trasferire l'espettorato rimanente dalla coppa dell'espettorato nella provetta etichettata come espettorato extra.

Conservare tutte le provette a quattro gradi Celsius o su ghiaccio e trasportarle in laboratorio, se necessario, per generare un metagenoma virale. A seguire la preparazione di tamponi e soluzioni. Pretrattare i campioni aggiungendo un tampone di magnesio salino filtrato da 0,02 micrometri per un volume totale di sei millilitri.

Per facilitare la dissoluzione del muco, aggiungere sei millilitri di 6,5 millimolari di DTT a ciascun campione. Agitare energicamente per mescolare e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Dopo un vigoroso vortice, i campioni ruotano nuovamente a 3056 Gs e 10 gradi Celsius per 15-20 minuti.

Raccogliere ogni surnatante in un nuovo tubo da 15 millilitri. Successivamente, utilizzare un filtro a punta da 45 micrometri montato su una siringa per filtrare i surnatanti in nuove provette da 15 millilitri. Rimuovere 100 microlitri di campione in una provetta per microfughe e quindi eseguire il trattamento con cloroformio.

Estrarre il surnatante ed eseguire il trattamento DN one. Aggiungere un volume uguale del 4% di formaldeide per fissare il campione. Per la microscopia a epifluorescenza, fare riferimento al protocollo di testo per un approccio di arricchimento di particelle virali catch-all.

Altrimenti, utilizzando soluzioni di cloruro di cesio appena preparate, impostare un gradiente di cloruro di cesio caricando un millilitro di 1,7 grammi per millilitro di soluzione di cloruro di cesio in ciascuna provetta, seguito da un millilitro di 1,5 grammi per millilitro, un millilitro di un virgola 35 grammi per millilitro e, infine, un millilitro di 1,2 grammi per millilitro di soluzione di cloruro di cesio. Infine, caricare da sei a otto millilitri di campione in provette a gradiente individuale. Contrassegna i singoli livelli per indicare la posizione di ciascuna frazione.

Quindi bilancia ogni coppia di due opposta entro un milligrammo. Bloccare con cura ciascun tubo nel secchio di centrifuga. Caricare sul rotore e centrifugare a 82, 844 Gs e quattro gradi Celsius per due ore.

Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela le provette dal supporto senza interrompere i gradienti di densità con un ago calibro 18 collegato a una siringa da tre millilitri. Assicurarsi che l'estremità aperta dell'ago sia rivolta verso l'alto. Forare il tubo appena sotto lo strato di densità di 1,5 grammi per millilitro e aspirare lentamente circa 1,5 millilitri di soluzione nella siringa.

Rimuovere lentamente l'ago e lasciare che la frazione rimanente nel tubo goccioli in un nuovo tubo da 15 millilitri attraverso la puntura. Etichettare come frazione superiore vita Trasferire la soluzione nella siringa contenente il V ps in due nuovi tubi per micro fuge. Una volta che i tamponi e le soluzioni sono stati preparati, secondo il protocollo di testo, aggiungere cinque volumi di punto 22 micrometrico filtrato un XPBS Per diluire ciascun omogenato sotto una cappa chimica, aggiungere beta MAR capta etanolo a una concentrazione finale del 2% in volume e agitare la miscela a temperatura ambiente per due ore dopo l'incubazione.

Far girare il campione a 3056 GS e 10 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo aver scartato il surnatante, utilizzare 10 millilitri di acqua di grado molecolare per risospendere il pellet e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti prima di ripetere il lavaggio. Dopo un giro finale, e una volta che la natina SUP è stata scartata, utilizzare cinque millilitri di un tampone XDNA per risospendere il pellet prima di aggiungere 15 microlitri di ds.

Uno per millilitro di campione Incubare a 37 gradi Celsius mescolando ripetutamente per due ore. Dopo aver centrifugato i campioni e scartato lo snat, utilizzare 10 millilitri di tampone SE per risospendere il pellet. Quindi centrifugare il campione e ripetere il lavaggio.

Utilizzare due millilitri di tampone SE per risospendere il pellet e trasferire la sospensione in due tubi micro fuge. Quindi centrifugare i tubi a 16.000 GS a temperatura ambiente per 15 minuti. Infine, dopo aver rimosso il surnatante, utilizzare un kit di estrazione del DNA genomico seguendo le istruzioni per i batteri gram-positivi.

Per isolare il DNA, i risultati precedenti per generare metagenomi virali sono riassunti qui. I vironi contengono poche sequenze di derivazione umana con un solo campione contenente il 70% di campione di DNA umano CCF quattro A è stato omesso dalla fase di ultracentrifugazione a gradiente di densità e, di conseguenza, conteneva più del 97% di sequenze derivate dall'uomo. Questa figura mostra un'immagine fluorescente di un tipico campione di espettorato CF prima e dopo l'ultracentrifugazione con gradiente di densità.

Vlp chiari sono stati osservati in assenza di particelle di grandi dimensioni dopo la separazione del gradiente di densità vista qui. Sette campioni giornalieri di espettorato sono stati raccolti da un singolo paziente con fibrosi cistica che ha iniziato con antibiotici orali. Dopo il terzo giorno di raccolta, la resa totale della lisi ipotonica derivata o del DNA HL raccolto da ciascun campione variava da 210 nanogrammi a oltre cinque microgrammi dalle librerie di sequenziamento Illumina generate per ciascun campione.

Tutte le librerie tranne una hanno prodotto più di 1 milione di sequenze e oltre l'85% di sequenze di alta qualità sono state conservate dopo la pre-elaborazione dei dati. Utilizzando il software print seq, la quantità totale di sequenze derivate dall'uomo variava dal 14% al 46%Come mostrato qui, i profili microbici dei sottocampioni sono molto simili ai campioni dopo due trattamenti di lisi ipotonica. Inoltre, la seconda lisi ipotonica aumenta la frazione di sequenze non umane dal 6 al 17% all'interno dei metagenomi.

Non dimenticare che lavorare con campioni clinici e potenziali agenti patogeni può essere estremamente pericoloso. I dispositivi di protezione individuale devono essere sempre utilizzati in ogni momento durante la manipolazione dei campioni. Durante l'esecuzione di questa procedura sono necessarie buone tecniche di biologia molecolare e microbiologia per garantire l'assenza di contaminazione.

Seguendo questa procedura, dovresti essere in grado di eseguire studi metagenomici virali e microbici, nonché metatrascrittomici da campioni complessi come l'espettorato FC.