Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in Xenopus laevis coni di crescita
7 settembre 2014
Il pacchetto software basato su MATLAB open source, plusTipTracker, può essere utilizzato per analizzare serie di immagini di + TIP fluorescenza marcata per quantificare la dinamica dei microtubuli.
Lo scopo di questa procedura è quello di ottenere informazioni quantitative riguardanti la proteina di tracciamento dei microtubuli più estremità o la dinamica della punta più e i coni di crescita viventi utilizzando il pacchetto software più il tracker della punta. Qui descriviamo i passaggi per l'analisi delle immagini delle dinamiche GFP di EB one e dei coni di crescita XUS lavis in coltura, ma un protocollo simile può essere utilizzato per altri tipi di cellule in seguito all'acquisizione di immagini live ad alta risoluzione di EB one marcate e coni di crescita embrionale in coltura. Il primo passo della procedura consiste nell'utilizzare il comando più tip, ottenere tracce per rilevare le comete EB one GFP, collegare le comete in tracce e determinare i parametri della dinamica dei microtubuli.
Il secondo passo consiste nell'utilizzare il comando più la punta C tracce per visualizzare le tracce dei microtubuli sovrapposte alle immagini del cono di crescita. Il passaggio finale consiste nell'utilizzare l'analisi del gruppo di punte positive per analizzare e confrontare i parametri della traccia dei microtubuli di gruppi di filmati. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'utilizzo del tracciamento manuale per analizzare le singole tracce delle punte, è che questo metodo consente il rilevamento, il tracciamento, la visualizzazione e l'analisi rapidi e automatizzati.
Il primo passo nell'analisi delle immagini consiste nel rilevare le comete EB one GFP, collegare le comete in tracce e determinare i parametri della dinamica dei microtubuli. Questo si ottiene con il comando più punta. Ottieni tracce prima dell'analisi delle immagini.
Converti ogni filmato time-lapse in una sequenza di file immagine TIFF e salva ogni serie nella propria cartella chiamata immagini. Si noti che le immagini fanno distinzione tra maiuscole e minuscole. Per iniziare l'analisi, apri l'applicazione MATLAB e digita più tip get tracks nella finestra di comando.
Questo farà apparire una nuova finestra di dialogo. Fare clic su, impostare nuovi progetti e selezionare una o più delle precedenti serie di immagini TIFF selezionando la cartella di immagini appropriata. Al termine di questo passaggio, verrà creata una directory File.
Clicca su, va bene. Una volta visualizzata la prima immagine, utilizzare il mouse per fare clic e creare un poligono. Quindi comprende l'intero cono di crescita.
Fare doppio clic con il mouse per chiudere il poligono. Se l'immagine ha un altro cono di crescita, viene visualizzata una finestra di dialogo. Per analizzare, selezionare sì.
In caso contrario, selezionare no. Il passo successivo è quello di selezionare i progetti che verranno immediatamente analizzati. Fare clic su seleziona progetti e selezionare la cartella.
Per analizzare un elenco, selezionare la schermata appiccicosa apparirà. Seleziona i progetti dal lato sinistro dello schermo e spostali sul lato destro. Clicca su, va bene.
Scegli una posizione in cui salvare l'elenco dei progetti e fai clic su Salva, seleziona Rilevamento, Tracciamento e Post-elaborazione. Una volta effettuate queste selezioni, il lato destro della finestra di dialogo diventerà configurabile. Compila le impostazioni di post-elaborazione.
A seconda delle impostazioni specifiche di acquisizione dell'immagine desiderate, fare clic su Avvia. Il software eseguirà quindi tutti i passaggi inseriti. La finestra di comando visualizza il tempo rimanente stimato per ciascuna funzione e indica quando l'esecuzione del passaggio è terminata.
Ora che le tracce micro tubari sono state definite, la funzione più le tracce C della punta viene utilizzata per la visualizzazione delle tracce e per visualizzare le tracce micro tubali sovrapposte alle immagini del cono di crescita. Questo si ottiene con il comando più il suggerimento C traccia il tipo più il suggerimento C tracce nella finestra di comando. Dopo il caricamento della finestra di dialogo, fare clic su seleziona progetto.
Selezionare la directory principale contenente il progetto da visualizzare e fare clic su seleziona cartella. Una volta visualizzata la finestra, scegli il file da visualizzare e fai clic su. Ok, quindi, fai clic su seleziona ROI salvato, vai alla stessa cartella della regione di interesse di quella selezionata nel passaggio precedente e seleziona il file denominato R-O-I-Y-X.
Fare clic su seleziona directory di output per indicare dove MATLAB salverà i file di visualizzazione della traccia, quindi selezionare Crea filmato traccia. Apparirà una schermata che mostra tutte le tracce. Suggerimento plus: ottieni le tracce calcolate dai commenti del suggerimento plus.
Il passaggio salva la serie temporale della traccia in formato filmato. La funzione finale viene utilizzata per creare gruppi di filmati per l'analisi e il confronto dei parametri della traccia microtubiale. Questo si ottiene con il comando più l'analisi del gruppo di suggerimenti.
Una volta che più suggerimento get tracks è stato eseguito per più film e diversi sottoinsiemi di dati sono pronti per il confronto. Digitare più suggerimento analisi del gruppo nella finestra di comando Per selezionare manualmente i gruppi da confrontare per primo, deselezionare il raggruppamento automatico dalla gerarchia. Quindi fare clic su seleziona progetti.
Passa alle directory principali contenenti tutte le cartelle ROI. Per analizzare un elenco, selezionare GUI Apparirà la finestra. Seleziona tutti i progetti da includere nei gruppi dal lato sinistro dello schermo e spostali sul lato destro.
Clicca su, va bene. Quindi scegli una posizione in cui salvare l'elenco dei progetti e fai clic su Salva, apparirà una finestra. Clicca su.
Va bene, e verrà visualizzata la finestra appiccicosa di selezione dell'elenco. Ancora una volta, seleziona solo i file che corrispondono al primo gruppo che deve essere riunito e fai clic su. Ok. Inserisci il nome del gruppo e fai clic su, ok.
Apparirà una finestra, rispondi di conseguenza e continua a selezionare i gruppi. Quindi scegli una posizione in cui salvare l'elenco dei gruppi e fai clic su Salva. Fare clic su seleziona directory di output per scegliere dove verranno archiviate le cartelle di output.
Infine, selezionare il tipo di analisi di gruppo da condurre. Qui selezioniamo i dati del pool da tutte le celle e i gruppi. Fare clic su Confronta gruppi.
Questa immagine mostra i parametri della dinamica Micro tubiale ottenuti dalla funzione più le tracce git della punta. Questo filmato mostra le tracce dei microtubuli ottenute dalla funzione più le tracce della punta C. Infine, questa immagine mostra i parametri dei microtubuli ottenuti dall'analisi della funzione più il gruppo di punta.
Utilizzando un'applicazione per fogli di calcolo. Questi parametri acquisiti da diversi gruppi di filmati possono anche essere esaminati come box plot utilizzando un programma di elaborazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il tracker più punte per ottenere informazioni quantitative riguardanti la dinamica dei microtubuli più punte e i coni di crescita viventi utilizzando le funzioni più tracce git punta più tracce punta C e più analisi del gruppo di punta.
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Panoramica
Questo articolo descrive l'uso del pacchetto software basato su MATLAB, plusTipTracker, per analizzare la dinamica dei microtubuli attraverso +TIPs marcati fluorescentemente. La procedura fornisce un approccio sistematico per quantificare il comportamento delle proteine di tracciamento dell'estremità plus dei microtubuli nei coni di crescita viventi.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Dinamiche dei microtubuli
Sfondo
- I microtubuli svolgono un ruolo cruciale nella struttura e nella funzione cellulare.
- +TIPs sono proteine che si associano alle estremità in crescita dei microtubuli.
- L'analisi quantitativa della dinamica dei +TIP è essenziale per comprendere i processi cellulari.
- I metodi esistenti per il tracciamento dei microtubuli possono essere dispendiosi in termini di tempo e meno efficienti.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo dettagliato per analizzare la dinamica dei microtubuli utilizzando plusTipTracker.
- Migliorare la comprensione del comportamento dei +TIP nelle cellule viventi.
- Dimostrare i vantaggi del tracciamento automatizzato rispetto ai metodi manuali.
Metodi utilizzati
- Utilizzo del comando plusTip, get tracks per rilevare le comete EB1-GFP.
- Collegamento delle comete in tracce per determinare i parametri di dinamica dei microtubuli.
- Visualizzazione delle tracce dei microtubuli utilizzando il comando plusTip C tracks.
- Analisi di gruppo dei parametri delle tracce dei microtubuli su più filmati.
Principali risultati
- È stata ottenuta la rilevazione e il tracciamento automatizzati della dinamica dei microtubuli.
- Le tecniche di visualizzazione hanno fornito chiare informazioni sul comportamento dei microtubuli.
- L'analisi di gruppo ha permesso studi comparativi in diverse condizioni.
- Il metodo si è dimostrato più veloce ed efficiente rispetto ai metodi di tracciamento tradizionali.
Conclusioni
- plusTipTracker è uno strumento prezioso per studiare la dinamica dei microtubuli.
- L'approccio automatizzato migliora la precisione e l'efficienza dell'analisi.
- Questo protocollo può essere adattato per vari tipi di cellule e condizioni.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantifying microtubule dynamics in neuronal growth cones provides mechanistic insights into axonal guidance and synaptic formation, processes relevant to neurodevelopmental disorder models. Automated analysis of +TIP comet trajectories enables high-content screening of compounds affecting cytoskeletal regulation, supporting target validation in neuroscience discovery pipelines. The approach reduces analytical bias and increases throughput compared to manual tracking, improving predictive confidence in early-stage target engagement studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microtubule polymerization dynamics as a functional readout for targets regulating axonal growth or stability.
- Operational Value: Provides standardized, quantitative parameters (growth speed, pause frequency, catastrophe rate) for consistent target phenotype assessment across compound libraries.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, multiparametric readouts of microtubule behavior suitable for assay miniaturization and automation in 96-/384-well formats.
- Operational Value: Facilitates assay standardization across laboratories by defining clear ROI selection, tracking parameters, and group analysis thresholds.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links in vitro microtubule dynamics phenotypes to disease-relevant mechanisms in neurodevelopmental or neurodegenerative models.
- Operational Value: Supports continuity from primary neuronal cultures to organotypic slice or in vivo validation through conserved +TIP tracking methodology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, where quantitative cytoskeletal phenotypes inform target selection prior to lead identification and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of kinase, phosphatase, or microtubule-associated protein targets via direct measurement of +TIP comet dynamics in live growth cones.
- Screening: Delivers assay-ready, normalized outputs (comet density, track length, velocity distributions) enabling Z'-factor calculation and hit confirmation.
- Analytics: Provides group-level statistical comparisons (mean, variance, distribution shifts) essential for evaluating compound effects across biological replicates.
- Translational Research: Connects cytoskeletal phenotypes to axon outgrowth or synapse formation assays, aligning with preclinical functional endpoints.
- Enterprise Reuse: Establishes a centralized, MATLAB-based analytics framework applicable to diverse cell types (neurons, fibroblasts, cancer lines) expressing fluorescent +TIPs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation by reducing variability inherent in manual tracking and enabling detection of subtle dynamic shifts.
- Operational Value: Enhances reproducibility through automated comet detection, standardized tracking algorithms, and batch processing of time-lapse series.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by delivering multiparametric cytoskeletal profiles earlier in the discovery timeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative microtubule phenotype severity and compound-induced rescue magnitude.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, MATLAB environment, and fluorescent protein tagging (e.g., EB1-GFP) in primary neuronal cultures.
- Depends on high-resolution, low-phototoxicity time-lapse acquisition systems capable of capturing +TIP comet dynamics at 1–2 second intervals.
- Necessitates cross-team standardization of ROI definition (growth cone perimeter), tracking parameters (linking distance, frame gap), and post-processing filters.
- Involves adaptation considerations for varying cell morphologies (e.g., growth cones vs. axonal shafts) and +TIP expression levels across model systems.
- Limited by the requirement for detectable, persistent +TIP comets; may not apply to conditions with highly unstable or sparse microtubule polymerization events.
