Subcloning più Insertion (SPI) - A Novel Metodo recombineering per la costruzione rapida di gene targeting Vettori

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di costruire vettori di targeting genico utilizzando il subclonaggio più l'inserimento. Ciò si ottiene trasformando la parte posteriore contenente e coli con un plasmide ricombinante. La seconda fase prevede la generazione di cassette di inserzione fosforolate asimmetriche e la subclonazione di plasmidi mediante reazione a catena della polimerasi.

Dopo l'aggiunta di arabinosio, le proteine ricombinanti GBAA vengono espresse e la cassetta di inserzione modificata terminale e il plasmide subclonante vengono elettroporati. La sequenza di DNA desiderata viene contemporaneamente catturata dalla parte posteriore e modificata con la cassetta di inserimento nel plasmide di subclonaggio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la ricombinazione standard, è che la costruzione del vettore di targeting genico può essere eseguita in una singola reazione.

Per iniziare, progettare gli oligo per la cassetta di inserzione e il plasmide di subclonaggio, progettare ogni oligo in modo tale da contenere 180 bracci di omologia di coppie di basi che fiancheggiano il sito bersaglio genomico e 20 coppie di basi, una sequenza di priming specifica per la cassetta di inserzione o il plasmide di subclonaggio. Successivamente, determina l'orientamento dell'inserto di DNA genomico del clone posteriore utilizzando uno strumento basato sul web come clone db. Stabilire la direzione di replicazione da o ES controllando la mappa della spina dorsale plasmidica utilizzata nella parte posteriore.

Costruzione della libreria, aggiungere due fosfo terminali otto legami, quindi l'estremità cinque primi dell'oligo che è opposta alla direzione di replicazione sul clone posteriore. Quindi, aggiungi una modifica del fosfato a cinque prime all'oligo inverso. Per prima cosa, infilzare la punta di una pipetta sterile nella coltura di agar posteriore e inoculare 5,0 millilitri di brodo di odina.

Coltiva la coltura a 37 gradi Celsius per cinque ore con agitazione a 200 giri/min. Successivamente, freddo, soluzione di glicerolo al 10%, microcentrifuga, provette ed elettroporazione, cuvette su refrigeratore di ghiaccio, grande centrifuga refrigerata e microcentrifuga a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, determinare la densità ottica della coltura utilizzando uno spettrofotometro.

Misura dell'assorbanza. A 600 nanometri. Preparare le celle elettrocompetenti quando viene raggiunta una lettura OD 600 da 0,3 a 0,8.

Quando la coltura è pronta, centrifugare le cellule in una provetta da centrifuga da 50 millilitri. Lavare le celle con un millilitro di glicerolo freddo al 10% e centrifugare di nuovo. Eseguire queste fasi di lavaggio per un totale di tre volte.

Risospendere le cellule in un volume totale di 50 microlitri e aggiungere da 10 a 200 nanogrammi di plasmide ricombinante. Ottenere una sospensione a singola cellula pipettando su e giù più volte, quindi trasferire le cellule in un'elettroporazione pre-raffreddamento. Vete. Successivamente, posizionare il vete in un dispositivo di elettroporazione e azionare le celle con l'elettrocompressore, recuperare immediatamente le cellule in un millilitro di LB e trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.

Far crescere la coltura posteriore a 30 gradi Celsius per due ore con agitazione a 200 giri/min. Trascorso questo tempo, aggiungere nove millilitri di LB alla coltura recuperata. Coltiva durante la notte a 30 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min per incorporare i bracci di omologia nella cassetta di inserimento e nel plasmide di clonazione subc.

Eseguire la PCR utilizzando gli oligo modificati lunghi preparati in precedenza. In alternativa, linearizzare il modello plasmidico Utilizzando un enzima di restrizione, sceglierne uno che tagli al di fuori della regione di amplificazione della PCR e sia attivato dal calore. Impostare la PCR utilizzando un sistema di DNA polimerasi hot start ad alta fedeltà.

Preparare una miscela master PCR ed eseguire i cicli termici secondo le migliori pratiche. Dopo la reazione, analizzare i prodotti della PCR mediante elettroforesi su gel AROS. Caricare da uno a cinque microlitri di ciascuna PCR su un gel all'1%aros.

Successivamente, purificare i prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione PCR. Quantificare il DNA amplificato con PCR rispetto a un insieme noto di standard di DNA o utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop. Dopo un'incubazione notturna, diluire la coltura GBAA posteriore 50 volte e preparare una coltura separata per un controllo negativo.

Coltiva le colture diluite a 30 gradi Celsius agitando a 200 giri/min per un'ora e 50 minuti. Quindi, raffreddare tutti i materiali e le attrezzature di ricombinazione a quattro gradi Celsius, come dimostrato in precedenza. Preparare una soluzione al 10% in peso per volume di OSE e sterilizzare con il filtro attraverso un filtro per siringa da 0,2 micron.

Quando l'OD della coltura posteriore raggiunge il livello desiderato, procedere con l'induzione delle proteine ricombinanti. Aggiungere 200 microlitri della soluzione araba al 10% a 10 millilitri di coltura posteriore per ottenere una concentrazione finale di alci dello 0,2%Includere una coltura non indotta da utilizzare come controllo negativo. Trasferire le colture in un'incubatrice con agitazione a 37 gradi Celsius e indurre l'espressione del rosso per 45 minuti con agitazione a 230 giri/min.

Centrifugare le cellule e lavare con glicerolo al 10% tre volte come mostrato in precedenza a 600-1000 nanogrammi. Ciascuna delle cassette di inserimento e il plasmide di subclonaggio per la reazione di ricombinazione includono un controllo solo vettore e vettore più un singolo inserto per verificare la competenza di ricombinazione e l'integrità del vettore. Quindi, ottenere una sospensione a cella singola ed elettroazionare le celle come mostrato in precedenza.

Consentire il recupero in terreni LB a 37 gradi Celsius per un'ora per plasmidi multicopia o in 10 lb a 37 gradi Celsius per tre ore per i vettori posteriori. Completare diverse diluizioni con la coltura recuperata su doppia selezione. L'agar si prega e cresce a 37 gradi Celsius per 16 ore.

Quando sono pronte, raccogli le colonie in cinque millilitri di LB contenenti l'antibiotico selettivo e cresci durante la notte a 37 gradi Celsius. Successivamente, utilizzare un kit di purificazione su colonna per preparare il mini prep DNA, introdurre l'enzima di restrizione appropriato e quindi identificare i cloni contenenti le dimensioni dei frammenti previste mediante elettroforesi su gel. Infine, eseguire il sequenziamento del DNA attraverso i bracci di omologia e la cassetta di inserimento per verificare la presenza di errori di fotosintesi dell'olio.

In questo esempio, l'analisi della digestione di restrizione di P due RX un inserto EYFP contenente cloni ha mostrato il pattern atteso che indica che contengono il vettore knockin correttamente assemblato. Questo schema illustra il concetto di rifilatura dei patti. L'utilizzo del subclonaggio e dell'analisi dell'inserimento dei prodotti PCR ha confermato che le cassette sono state incorporate correttamente.

Inoltre, quando i cloni posteriori positivi sono stati analizzati dopo aver aggiunto l'enzima di restrizione appropriato, è stato ottenuto il modello atteso. L'analisi della digestione di restrizione di 12 cloni di R SR due SBI ha mostrato un corretto assemblaggio del vettore nella maggior parte dei ricombinanti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come costruire rapidamente vettori di targeting genico utilizzando il subclonaggio più l'inserimento.