Mouse trapianto renale: Modelli di Allograft Rifiuto

Questo video presenta un modello murino di trapianto di rene. Utilizzando i ceppi inbred multipli, che hanno le principali classi di istocompatibilità conosciute, siamo in grado di ricreare diversi aspetti del rigetto dell'allotrapianto renale. I dati presentati illustrano come questo sia un modello utile Nello studio di questi meccanismi, questo cartone animato schematico dimostra i passaggi principali di questo modello.

Una nefrectomia sinistra viene eseguita su un topo donatore e il rene del donatore viene quindi preparato su un tampone sterile. In un piatto di coltura, il topo ricevente viene sottoposto a una nefrectomia destra prima che il rene del donatore venga trapiantato. La procedura viene eseguita utilizzando strumenti sterili autoclavati e materiali di consumo posizionati all'interno di un campo chirurgico sterile.

Se vengono operati più animali, viene utilizzato un nuovo set di strumenti sterili per ciascuna procedura o gli strumenti vengono sterilizzati tra una procedura e l'altra. Utilizzando uno sterilizzatore a microsfere, l'operatore indosserà un camice sterile, una maschera, un cappello e guanti. Un solo operatore può eseguire questa procedura preparando il donatore fino al punto di prelievo del rene.

Il ricevente viene quindi preparato per il trapianto prima di tornare dal donatore per rimuovere il rene. Questo riduce il tempo di ischemia fredda. In alternativa, due operatori possono preparare contemporaneamente la donatrice e la ricevente.

Ciò consente di operare più animali in un giorno. Ecco un topo maschio di sei anni di C 57 di otto settimane che è stato anestetizzato con un'iniezione intraperitoneale di ketamina, cloridrato e meina. L'area chirurgica è stata rasata e igienizzata utilizzando una soluzione di iodio diluito.

Il mouse è stato posizionato su un cuscinetto chirurgico riscaldato drappeggiato sterile con le estremità fissate al tampone. L'unguento per gli occhi è stato applicato. Una laparotomia viene eseguita mediante un'incisione cutanea sulla linea mediana.

Quindi la cavità peritoneale viene aperta tramite l'Albert lineare utilizzando le forbici per la separazione dei tessuti. Il topo viene quindi drappeggiato e un divaricatore calibratore viene inserito nell'incisione. L'intestino viene spostato a sinistra o a destra del campo chirurgico per esporre il rene sinistro e l'uretere per preparare il rene del donatore.

Per il trapianto, l'uretere viene legato e diviso il più vicino possibile alla vescica. Le vene gonadiche inferiori e surrenali superiori sono legate e divise vicino alla vena renale. L'aorta è legata, superiore e inferiore all'arteria renale e la soluzione fredda dell'Università del Wisconsin viene iniettata nell'aorta per perfondere il rene.

L'uretere può essere facilmente sezionato dal retroperitoneo e rintracciato fino alla sua terminazione della vescica. Dovrebbe essere legato il più vicino possibile alla vescica con una sutura 7.0 e poi diviso la vena gonadica sinistra normalmente si svuota nella vena renale. Dovrebbe essere doppiamente legato utilizzando una sutura 9.0 e diviso tra le suture vicino alla vena renale.

Come mostrato in questa clip in modo simile, la vena surrenalica sinistra si svuota nella vena renale e deve essere legata e divisa. L'attenzione dovrebbe quindi rivolgersi alla dissezione dell'aorta del donatore dal tessuto linfatico circostante e all'avvento per consentire il posizionamento della prima e comprendente sutura inferiore libera. Quindi una sutura superiore all'arteria renale.

Una volta che il topo donatore è pronto, cinque unità di eparina per via endovenosa vengono somministrate dalla vena penale dorsale. In primo luogo, la sutura aortica inferiore viene legata strettamente, seguita dalla legatura superiore. Questo isola il rene dalla circolazione arteriosa.

Circa 500 microlitri di soluzione fredda universitaria Wisconsin vengono somministrati dall'aorta. Il successo della profusione è identificato dallo sbollentamento del rene del donatore. L'aorta è divisa prima inferiormente e poi superiormente all'arteria renale.

Successivamente, la vena renale viene divisa alla sua giunzione con la vena cava. Il rene del donatore viene quindi rimosso e posto su una garza sterile fredda. In un piatto di coltura, l'aorta è incisa longitudinalmente direttamente di fronte all'aorta renale.

Per creare un cerotto aortico per l'anastomosi, identificare il lume dell'arteria renale e assicurarsi che non ci siano arterie polari extra. La vena renale viene quindi preparata posizionando prima una sutura in poliammide 10 O all'apice inferiore della vena renale e poi, analogamente, una sutura all'apice superiore. Le legature che dividevano la vena surrenale e la vena gonadica sono utili marcatori per orientare la vena.

A questo punto, dopo il prelievo del rene da donatore, viene preparato un topo ricevente come descritto in precedenza, il topo ricevente viene drappeggiato e viene inserito un divaricatore calibra. L'intestino viene spostato a destra o a sinistra del campo chirurgico e coperto con teli sterili inumiditi con soluzione salina. In primo luogo, una nefrectomia destra viene eseguita legando l'arteria renale e la vena con sette oh di sutura, quindi l'uretere viene isolato e legato prima della divisione.

Infine, l'arteria renale e la vena vengono divise, dopodiché il rene può essere rimosso. Questo crea spazio all'interno della cavità peritoneale per il rene, l'aorta e la vena del ricevente del trapianto, quindi l'aorta e la vena devono essere preparate per l'anastomosi vascolare. In primo luogo, il fascio linfatico viene mobilizzato dall'aorta e dalla vena cava e il retroperitoneo viene aperto.

Sezionare senza mezzi termini i vasi lombari dagli aspetti sinistro e destro per consentire il posizionamento di una sutura attorno ai vasi lombari. I vasi possono quindi essere legati in continuazione senza dividersi. Ciò previene il sanguinamento della schiena durante l'esecuzione dell'anastomosi vascolare.

Viene quindi eseguita un'ulteriore dissezione per creare una finestra tra l'aorta e la vena cava e dal tessuto circostante dell'avvento. Identificare una posizione per il clamp microvascolare superiore e inferiore, assicurandosi che sia privo di tessuto in eccesso e pronto per l'anastomosi. A questo punto, l'eparina può essere somministrata per iniezione endovenosa come mostrato in precedenza, Il rene del donatore viene posizionato nella cavità peritoneale del ricevente.

Prestare attenzione al topo per garantire che le suture posizionate nella vena non si aggroviglino. Questo cartone animato schematico mostra il rene del donatore insieme all'aorta e alla vescica IVC del ricevente dopo la nefrectomia destra per trapiantare un rene da donatore due. Un clamp traumatico viene applicato all'IVC e all'aorta sopra e sotto il sito dell'anastomosi vascolare.

Il rene, la vena renale e l'arteria del donatore sono anastomosi rispettivamente nell'IVC e nell'aorta del ricevente. Successivamente, le pinze atraumatiche vengono rimosse e il rene del donatore viene riperfuso. L'uretere viene quindi anastomosi nella vescica del ricevente.

Il morsetto microvascolare inferiore viene applicato e comprende sia l'aorta che la vena cava. Viene quindi posizionato un morsetto superiore. Atomy è realizzato con un ago calibro 30 e la vena cava arrossata con soluzione fisiologica.

La venotomia viene allargata con una pinza. La sutura precedentemente posizionata all'apice superiore della vena renale del donatore viene quindi fatta passare attraverso la vena cava del ricevente all'apice superiore della venotomia. La sutura viene quindi legata e viene eseguita un'anastomosi della sutura in esecuzione della parete posteriore della vena renale allo speleologo della vena una volta raggiunto l'apice inferiore dell'otomia del pH.

La seconda sutura precedentemente inserita nella vena renale viene fatta passare attraverso la vena cava inferiore e legata. Questo può quindi essere legato alla prima sutura e viene eseguita un'anastomosi vascolare in esecuzione per completare la parete frontale. Nel protocollo di accompagnamento, viene fornita una rappresentazione schematica di ogni fase dell'anastomosi vascolare.

È di fondamentale importanza evitare di suturare inavvertitamente la parete anteriore alla parete posteriore e anche di coinvolgere l'arteria vera e propria o la macchia aortica nelle suture dell'anastomosi di Venere. L'autotomia dell'aor del donatore può quindi essere creata raccogliendo una piccola ellisse dell'aorta nella pinza e tagliando con precisione con le forbici. Una sutura da 10 oh viene quindi posizionata nel punto superiore del cerotto aortico.

Fare attenzione a eseguire una manipolazione minima di una qualsiasi delle superfici endoteliali arteriose. Poiché ciò aumenta il rischio di trombosi, la sutura viene quindi fatta passare attraverso l'apice superiore dell'autotomia A e della marea. Il cerotto aortico può quindi essere anastomosi in una sutura in esecuzione all'aorta del ricevente e legato a se stesso.

Fare attenzione a non legare troppo strettamente in quanto ciò potrebbe causare un effetto per corda e compromettere l'afflusso. Il clamp microvascolare inferiore viene rimosso per primo, spesso si verifica una riperfusione a causa del riflusso nell'arteria renale dall'aorta distale. Quindi il morsetto superiore viene rimosso.

L'anastomosi ureterale viene quindi eseguita facendo passare un ago calibro 21 dentro e fuori dalla vescica. Le pinze vengono quindi fatte passare indietro attraverso il tratto e quindi l'uretere viene aspirato attraverso la sutura. Il tessuto di avvento dell'uretere viene quindi suturato al tessuto di avvento della vescica con nove oh di poliammide in tre punti per fissare l'uretere in posizione.

L'uretere viene quindi tagliato, lavato fino alla vescica e spesso l'urina può essere vista prodotta dal rene del donatore. Si noti anche il sanguinamento dai vasi perureterali. L'uretere viene lasciato giacere liberamente nella vescica e il difetto chiuso dopo aver sostituito l'intestino.

Il peritoneo viene suturato e la pelle viene chiusa mediante clip metalliche. Lo iodio viene quindi applicato all'area chirurgica e l'anestesia viene parzialmente invertita mediante un'iniezione sottocutanea di tapazolo cloridrato. Analgesici Vengono somministrati mediante iniezione di buprenorfina cloridrato.

I liquidi vengono somministrati mediante iniezione sottocutanea di soluzione fisiologica riscaldata da un mil. I topi vengono attentamente monitorati fino a quando non si riprende conoscenza, appaiono vigili e incapaci di scrivere da soli. I topi possono recuperare qualsiasi scatola riscaldata mantenuta a 29 gradi per 24 ore per esperimenti a lungo termine.

Vengono somministrati analgesici in corso e le clip cutanee vengono rimosse. Sette giorni dopo l'intervento. Ecco un topo 24 ore dopo l'intervento chirurgico notato che è completamente mobile ed è oltre l'urina macchiata di sangue sul tessuto della lettiera.

È importante monitorare la gestione della paralisi in questo modello in quanto ciò può indicare complicanze vascolari presentate. Poi ci sono i dati che indicano come questo modello e diversi ceppi di topi possono essere utilizzati per studiare lo sviluppo del rigetto del trapianto renale per modellare il rigetto acuto del trapianto. Il ceppo di topo mutante BM 12 viene utilizzato come donatore.

Questi topi mutanti BM 12 differiscono dal ceppo genitore C 57 black six per una singola differenza di classe MHC di due volte trapiantando un rene BM 12 in un ricevente C intestinale. Provoca un rigetto acuto a causa di una mancata corrispondenza completa di MHC di classe uno e di classe due. Un allotrapianto C 57 black six porta allo sviluppo di rigetto cronico a causa del disallineamento MHC isolato Gli innesti ISO BM 12 hanno una corrispondenza MHC completa di classe uno e classe due e quindi non mostrano segni di rigetto.

La struttura renale viene esaminata mediante istopatologia su sezioni renali incluse in paraffina colorate con ematina ed eoina. Poiché questo modello non dipende dal trapianto per la sopravvivenza, il rene nativo può essere utilizzato come controllo Dopo il trapianto renale con innesto ISO, il rene subisce un danno da riperfusione ischemica, ma entro quattro settimane i tubuli si sono ripresi dopo il trapianto di allotrapianto di biopsia con BM 12. Il rigetto acuto è evidente con infiltrati diffusi di cellule mononucleate denotati dai tubuli necrotici con asterisco singolo con doppio asterisco e reni tubuli BM 12 trapiantati in topi C 57 black six.

Provoca un danno cronico allotrapianto caratterizzato da infiltrato linfatico perivascolare indicato dalle frecce di blocco con fibrosi interstiziale e atrofia tubulare indicata da frecce cave. La quantificazione dei tubuli per campo ad alta potenza può essere utilizzata per valutare la massa funzionale del nefrone. Non c'era differenza tra il trapianto ISO e la conta dei tubuli renali nativi di quattro settimane dopo il trapianto.

Il rigetto acuto provoca una significativa perdita di tubuli entro quattro settimane. In confronto, il rigetto cronico mostra una perdita più varia ma graduale. Piro serious red è un colorante di collagene pan e può essere eseguito su sezioni renali incluse in paraffina Per quantificare la fibrosi interstiziale.

Il trapianto renale con trapianto ISO è associato a fibrosi insignificante rispetto al rene nativo BM 12 inter C 57. Il blocco sei provoca la fibrosi a 12 settimane. Dopo il trapianto, abbiamo descritto un modello di trapianto renale con particolare attenzione alla dimostrazione delle tecniche chirurgiche.

Questo modello è associato a una curva di apprendimento significativa, che può essere superata per ottenere un modello di trapianto di rene di topo funzionante riproducibile. La combinazione di ceppi descritta sviluppa le caratteristiche chiave del danno cronico da trapianto renale e può essere utilizzata per studiare la patologia risultante della fibrosi interstiziale e dell'atrofia tubulare. Inoltre, il rigetto acuto può anche essere modellato, consentendo lo studio di importanti meccanismi fisiopatologici di questa entità.

Questo video fornisce punti chirurgici chiave per aiutare lo spettatore a replicare fedelmente questo modello.