Name: Mouse trapianto renale: Modelli di Allograft Rifiuto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 15 s
Description: Impara le tecniche chirurgiche per il trapianto renale nel topo, un modello essenziale per studiare il rigetto acuto e cronico dell'allograft. Questo protocollo riproducibile permette di investigare i meccanismi immunologici e le strategie terapeutiche.

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Finanziamento da Rene Research UK, The Royal College of Surgeons di Edimburgo e la Società Europea di Trapianto sostenuto questo studio.

Adeguati etica istituzionali nazionali e locali dovrebbero essere a posto prima di eseguire esperimenti su animali. In particolare nel Regno Unito i seguenti esperimenti sono stati intrapresi sotto gli Animali (Scientific Procedures) Act 1986, in cui sono disponibili ad operare contemporaneamente due microsurgeons il chirurgo donatore deve eseguire i passaggi 1,1-1,16 poi da 3.1 a 3.5, mentre il chirurgo destinatario esegue 2.1 a 2.8 . Per un singolo operatore le fasi possono essere seguite in modo sequenziale. 1 donatore Preparazione Nota: La procedura qui presentata è un donatore C57BL / 6 BM12 e destinatario C57BL / 6 topi di sesso maschile di età compresa tra 8 a 16 settimane di vita con un peso corporeo superiore a 20 g. Tuttavia questa procedura può essere eseguita in modo riproducibile su una varietà di ceppi di topi. I dati presentati nella sezione risultati rappresentativi sono stati ottenuti da C57BL / 6, C57BL / 6 BM12 e topi BALB / c. <ol><li> Procedure di Condotta Using strumenti chirurgici sterili e di consumo (autoclave), con sforza di mantenere il campo operatorio sterile come possibile. Eseguire la preparazione del donatore in contemporanea con la preparazione destinatario, se due chirurghi sono disponibili. </li><li> Anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale (31G ago) di medetomidina (0,5 mg / kg) e ketamina cloridrato (200 mg / kg). Questo si traduce in un piano anestetico che viene mantenuta per 4 ore fornire tempo sufficiente per l&#39;intera procedura da eseguire. Anestesia supplementare non è necessario. </li><li> Verificare che il mouse è anestetizzato (nessuna risposta a pizzico tep). </li><li> Shave addome del mouse e rimuovere tutti i capelli sciolti con nastro adesivo. </li><li> Posizionare il mouse sulla sua schiena su una stuoia riscaldata sterilmente drappeggiato e vagamente immobilizzare gli arti con nastro adesivo sterile. </li><li> Monitorare il mouse durante tutta la procedura per le ustioni termiche. Se possibile, utilizzare una fonte di calore non elettriche. </li><li> Applicare un lubrificante occhio e sanitize la parete addominale con una soluzione diluita di iodio. </li><li> Eseguire un&#39;incisione mediana nell&#39;addome per entrare nella cavità peritoneale e inserire un tre centimetri Calibri divaricatore addominale. </li><li> Applicare salina riscaldata per mantenere l&#39;intestino e l&#39;area chirurgica umida ed evitare inutili essiccazione dei visceri. </li><li> Coprire il mouse con teli sterili e spostare l&#39;intestino alla sinistra dell&#39;operatore (a destra del mouse) per esporre l&#39;aorta, vena cava e il rene sinistro. </li><li> Applicare una pinza sfogo allo stomaco e tirare superiormente per esporre i principali vasi e rene sinistro completamente. Confezione umidi tamponi sterili (da 2 mm x 2 mm) nell&#39;addome di ritrattare tessuti lontano dalla zona chirurgica, come ad esempio i lobi del fegato, vescicole seminali, e intestino. </li><li> Isolare il rene sinistro da nell&#39;avventizia circostante, il grasso e la ghiandola surrenale sinistra nella cavità peritoneale senza mezzi termini dalla dissezione del tessuto connettivo con pinze punta fine. Posizionare le punte chiuse della pinza tra le aree che neEd da separare e lentamente lasciare le punte forcep per aprire a sezionare lo spazio. </li><li> Isolare la vena renale sinistra legando e dividendo la vena surrenalica e gonadica sinistra vena sinistra con 9 / O nylon. Posizionare la sutura vicino alla vena renale. </li><li> Legare e sezionare l&#39;uretere con 7 / O sutura di seta vicino alla vescica lasciando la sutura termina lungo. Queste estremità lunga di sutura verranno utilizzati quando il rene è raccolto e sono necessari per l&#39;anastomosi ureterale. </li><li> Per mobilitare e sezionare completamente l&#39;aorta e vena cava inferiore e superiormente l&#39;arteria renale e la vena utilizzare pinze punta fine di sezionare senza mezzi termini vasi linfatici e il grasso dalla parte anteriore e sui lati dei vasi. </li><li> Trovare il piano di tessuto tra l&#39;aorta e vena cava e diffondere lentamente il forcipe. Aprire lentamente le punte delle belle pinze a punta a diffondere il tessuto con il minimo trauma. </li><li> Legare un sciolto 7 / O seta intorno all&#39;aorta superiore ed inferiore per l&#39;arteria renale passando un bel angolatopinze punta intorno alla parte posteriore dei vasi e di disegno attraverso una sutura. Questi punti di sutura saranno serrati prima di recupero rene per consentire la perfusione retrograda della University of Wisconsin soluzione. </li></ol> 2 Destinatario Preparazione Come per la preparazione donatore follow passi da 1.2 a 1.8. <ol><li> Spostare l&#39;intestino alla destra dell&#39;operatore (a sinistra del mouse) per esporre l&#39;aorta, vena cava. Coprire l&#39;intestino con una soluzione salina sterile tampone imbevuto. </li><li> Eseguire una nefrectomia destra legando l&#39;arteria renale destra e la vena con 7/0 sutura di seta e poi dividere. </li><li> Legare l&#39;uretere destro con 7 / O sutura di seta e dividere. </li><li> Mobilitare e sezionare completamente l&#39;aorta e vena cava inferiore per l&#39;arteria renale e la vena come descritto al punto 1.14 e 1.15. Garantire la completa dissezione tra l&#39;aorta e vena cava. Fare attenzione a preservare l&#39;arteria spermatica interna che corre anteriormente alla vena cava e aortun insieme con il fascio linfatico. </li><li> Identificare i vasi lombari esecuzione in retroperitoneo dalla vena cava e vena alla colonna vertebrale, legare con 9 / O seta in continuità, non c&#39;è bisogno di dividere i vasi. </li><li> Identificare lo spazio sufficiente per posizionare i morsetti microvascolari con spazio tra di anastomosi vascolari. </li><li> Somministrare eparina per via endovenosa (5 unità) con pene dorsale vena. </li></ol> 3. donatori di rene Retrieval Serrare i 7 / O cravatte di seta che sono stati posti in giro per l&#39;aorta inferiore e superiore per isolare il rene dalla circolazione arteriosa. <ol><li> Infondere retrograde freddo 0,2-0,5 ml della University of Wisconsin soluzione con un ago (31G) nell&#39;aorta. </li><li> Dividere l&#39;aorta entro le suture e dividere la vena renale alla sua giunzione con la vena cava per rimuovere il rene e l&#39;arteria renale con una lunghezza dell&#39;aorta. Dividere vasi lombari derivanti dall&#39;aorta, se presenti, wenza legatura. </li><li> Posizionare il rene in soluzione salina fredda su un tampone sterile in un piatto di cultura. </li><li> Euthanize il topo donatore per dislocazione cervicale. </li></ol> 4. Trapianto di Rene - Rene Preparazione <ol><li> Creare una patch aortica dividendo la parete dell&#39;aorta longitudinalmente di fronte l&#39;arteria renale. Identificare i lumi dei vasi nella patch che devono essere ligato o evitati quando si esegue l&#39;anastomosi arteriosa. </li><li> Collocare una sutura 10 / O dall&#39;esterno all&#39;interno del lume della vena renale superiormente ed una seconda sutura separata inferiormente. Le suture utilizzati per dividere la vena surrenale e vena gonadica possono essere utilizzati per orientare la nave. </li><li> Posizionare il rene nel fianco destro del destinatario (Figura 1.1) e verificare che i punti di sutura sono in grado di garantire la anastomosi vascolari possono essere completate senza suture diventare intrecciati in tamponi o altri strumenti. </li></ol> 5. Rene Transplanzione - anastomosi vascolare Applicare fascette microvascolari prima inferiormente poi superiormente che comprende la vena cava e aorta. <ol><li> Fare un ventomy con un ago (31G) per pungere la parete anteriore della vena cava. Lavare il sangue dalla vena cava iniettando circa 50 microlitri di 0.9% NaCl. </li><li> Ampliare la venotomy utilizzando una pinza punta fine con la loro apertura nel venotomy modo che la lunghezza è equivalente al diametro della vena renale donatore. </li><li> Inserire la sutura superiore 10 / O (che è già nel lume della vena renale) prima all&#39;apice del venotomy (Figura 1.2) ed entra nella parete posteriore della anastomosi in una sutura continua fino a raggiungere l&#39;apice inferiore (Figura 1.3). </li><li> Posizionare il 10 / O sutura inferiore e legare prima con un singolo nodo (Figura 1.4), poi legare la sutura che va dalla parete di fondo. </li><li> Utilizzando la sutura inferiore creare il fronte wall della anastomosi (Figura 1.5) con una sutura continua e legare alla fine sutura superiore al vertice superiore (Figura 1.6). </li><li> Crea un aortotomy sollevando la parete dell&#39;aorta con una pinza e taglio di una patch ellittica con le forbici (circa il aortotomy dovrebbe essere un quinto della circonferenza dell&#39;aorta e tre volte il lume dell&#39;arteria renale di lunghezza). </li><li> Inserire un 10 / O sutura nel punto superiore della patch aortico dall&#39;esterno all&#39;interno (Figura 1.7) e passare attraverso l&#39;aorta per legare fuori dei vasi all&#39;apice superiore della aortotomy. </li><li> Creare l&#39;anastomosi arteriosa con una sutura continua a partire superiormente (Figura 1.8) anastomosing la patch donatore al destinatario aorta, fare attenzione a non costringere l&#39;anastomosi legando la sutura troppo stretto (Figura 1.9). </li><li> Rimuovere le pinze vascolari inferiori prima poi il morsetto superiore al reperfuse rene (Figura 1.10 e 1.11). Visibile peristalsi dell&#39;uretere forse vede se viene raggiunto un adeguato apporto di sangue al uretere. </li></ol> 6 Trapianto di Rene - Anastomosi Ureteric <ol><li> Dividere eventuali allegati della vescica dalla parete addominale. </li><li> Far passare un ago (21G) da sinistra a destra della vescica attraverso entrambe le pareti. </li><li> Inserire punte forcep diritte nel lume dell&#39;ago e passare sia indietro attraverso la vescica tale che le pinze sono ora passando da destra a sinistra dal lato sinistro della vescica. </li><li> Tracciare la sutura sul uretere donatore attraverso la vescica tale che l&#39;uretere passa nel difetto vescica sinistra poi dal lato destro. </li><li> Suturare la avventizia dell&#39;uretere alla avventizia della vescica con tre singoli punti staccati in giro per il punto di ingresso con 9 / O nylon sutura su un ago rotondo e corposo. </li><li> Tagliare il prossimale dell&#39;uretere alla legatura, aprendo così the uretere per consentire l&#39;urina di fluire e permettere al fine uretere per ritrarre nel corpo della vescica. Visibile produzione di urina può essere osservata con sanguinamento da peri-ureterali vasi. </li><li> Chiudere il diritto difetto vescicale laterale con un solo interrotto 9 / O sutura di seta. </li></ol> 7 Recupero e assistenza post-operatoria Sostituire i visceri gastro-intestinale in addome secondo l&#39;orientamento originale e chiudere la parete addominale mediante il ravvicinamento delle muscoli retti con 6 / O sutura assorbibile. <ol><li> Approssimare la pelle con clip in metallo pelle. </li><li> Parzialmente invertire l&#39;anestesia con una iniezione sottocutanea di cloridrato atipamazole (10 ml / g). </li><li> Somministrare analgesia sottocutanea buprenorfina cloridrato (0,05 mg / kg) e il supporto per l&#39;iniezione di fluido 1 ml di sottocutanea 0,9% NaCl. </li><li> Recuperare il mouse in un armadio riscaldamento a 28 ° C per 24-48 ore. Osservare il mouse per malattia fino allacompletamento dell&#39;esperimento. </li><li> Rimuovere le clip di pelle metallo 7 - 10 giorni dopo l&#39;intervento. </li><li> Una volta che l&#39;esperimento è completo eutanasia il mouse per dislocazione cervicale. </li><li> Togliere e raccogliere il rene controlaterale e allogenico per l&#39;analisi istologica. </li></ol>

<ol><li>Guild, W. R., Harrison, J. H., Merrill, J. P., Murray, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+homotransplantation+of+the+kidney+in+an+identical+twin%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Am.+Clin.+Climatol+Assoc%22%5BJournal%5D)">Successful homotransplantation of the kidney in an identical twin.</a> Trans. Am. Clin. Climatol Assoc. 67, 167-173 (1955).</li>
<li>Wolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mortality+in+all+patients+on+dialysis%2C+patients+on+dialysis+awaiting+transplantation%2C+and+recipients+of+a+first+cadaveric+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant.</a> N. Engl. J. Med. 341, 1725-1730 (1999).</li>
<li>Nankivell, B. J., Alexander, S. I. Rejection of the Kidney Allograft. N. Engl. J. Med. 363, 1451-1462 (2010).</li>
<li>Tse, G. H., Hughes, J., Marson, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+of+mouse+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Systematic review of mouse kidney transplantation.</a> Transplant International. 26, 1149-1160 (2013).</li>
<li>Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+transplants+between+mice+of+graded+immunogenetic+diversity.+Transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc%22%5BJournal%5D)">Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplant.</a> Proc. 5, 721-725 (1973).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+liver%2C+kidney%2C+heart%2C+and+intestine+allograft+rejection+in+different+mouse+strain+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations.</a> Transplantation. 62, 1267-1272 (1996).</li>
<li>Qi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+cells+of+monocyte+lineage+prevents+loss+of+renal+microvasculature+in+murine+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Depletion of cells of monocyte lineage prevents loss of renal microvasculature in murine kidney transplantation.</a> Transplantation. 86, 1267-1274 (2008).</li>
<li>Dang, Z., Mackinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+atrophy+and+interstitial+fibrosis+after+renal+transplantation+is+dependent+on+galectin-3%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3.</a> Transplantation. 93, 477-484 (2012).</li>
<li>Jabs, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+Evolution+and+Mechanisms+of+the+Lesions+of+Kidney+Allograft+Rejection+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the Evolution and Mechanisms of the Lesions of Kidney Allograft Rejection in Mice.</a> Am. J. Transplant. 3, 1501-1509 (2003).</li>
<li>Lin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+C4+from+Donor+or+Recipient+Mouse+Fails+to+Prevent+Renal+Allograft+Rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Deficiency of C4 from Donor or Recipient Mouse Fails to Prevent Renal Allograft Rejection.</a> Am. J. Pathol. 168, 1241-1248 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il modo più ben descritto effettuare l&#39;anastomosi arteriosa è utilizzare l&#39;aorta distale del donatore, con l&#39;arteria renale in continuazione, in modo end-to-side all&#39;aorta destinatario. Descriviamo l&#39;uso di una patch aortica, simile al mirroring &#39;Carrell cerotto&#39; che ha effettuato nel trapianto di rene umano che riteniamo essere più conveniente. Anche se segnalazioni in letteratura di tempo donatore e ricevente operativa sono scarsi crediamo che utilizzando una patch aortico al destinatario a...

Trapianto renale con successo per il trattamento di insufficienza renale è stata descritta per la prima nel 1955 tra gemelli monozigoti 1, da allora è diventato un rivoluzionario trattamento per i pazienti con insufficienza renale allo stadio terminale in tutto il mondo, che offre sia un miglioramento nella durata e la qualità della vita 2. Tuttavia la sopravvivenza del trapianto a lungo termine è stata ostacolata da una moltitudine di processi patologici con conseguente danno cronica del trapianto 3. Rifiuto del rene trapiantato negli esseri umani rimane una delle principali cause di morbilità, nonostante i significativi miglioramenti nei regimi immunosupporessive. L&#39;obiettivo di sviluppare un modello murino di trapianto renale è replicare da vicino il processo e la patologia trovato nel trapianto renale umano 4. Skoskiewicz et al. Prima descritto il modello murino di trapianto di rene nel 1973 5. Anche se sono richieste competenze avanzate microchirurgiche, è una preziosa tool per diversi motivi: il genoma del topo è stato ben caratterizzato e c&#39;è una grande varietà di metodi e tecniche disponibili per studi sui topi sperimentali. Molti gruppi che utilizzano il modello murino di trapianto renale hanno usato il rene trapiantato come un organo di supporto vitale, ma in altri studi e nella nostra metodologia descritta uno dei reni nativi del topo destinatario viene lasciato in situ per tutta la durata dell&#39;esperimento 4. Il vantaggio è che il mouse subisce una sola anestesia e il funzionamento riducendo la morbilità per il mouse e il rischio di morte per una seconda procedura. Inoltre, il mouse non soffre gli effetti negativi di insufficienza renale progressiva. Sebbene esistano modelli di rigetto allogenico in altri organi come il cuore e la pelle, queste non sono sempre direttamente rilevanti per il trapianto renale. Ci sono prove che questi modelli suscitano diverse modalità e dynamics di rifiuto, per esempio, l&#39;andamento nel tempo del rigetto in allotrapianto cardiaco e trapianto renale differisce in modo significativo in determinate combinazioni di deformazione 6. Abbiamo descritto i modelli renale acuta rigetto allogenico in BALB donatori / c in non-transgenici topi FVB / NJ, questo modello ha mostrato lesioni mediato cellulare con accumulo di cellule T e macrofagi 7. In alternativa abbiamo anche descritto un modello di danno cronica del trapianto che presenta fibrosi interstiziale e atrofia tubulare, questo risulta dal trapianto di un rene da C57BL / 6 BM12 donatori in C57BL / 6 destinatari, in quanto questi mouse sono caratterizzati da un unico MHC di classe II mis loci -match 8. Molteplici aspetti del trapianto sono stati studiati utilizzando il modello murino di trapianto renale tra cui rigetto acuto, rigetto cellulare e umorale, ischemia riperfusione, e sperimentando nuovi agenti terapeutici. Abbiamo modificato la t chirurgicaecnica per ridurre il tempo di funzionamento e migliorare la facilità di intervento chirurgico. In particolare abbiamo descritto donatore simultanea e la preparazione destinatario e un semplificato tecnica di anastomosi vascolare utilizzando un continuo aortica patch di anastomosi. Questo video e manoscritto forniranno punti chiave per aiutare nella creazione di questa tecnica.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Strumenti chirurgici Forbici</td></tr> da <tr><td>dissezione smussate</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>&nbsp; 14072-10</td><td>Per il taglio della pelle</td></tr><tr><td>Forbici curve Castoviejo</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>15017-10</td><td>Per il taglio dei tessuti</td></tr><tr><td>Forbici a molla - dritte</td><td>Strumenti per la scienza</td> fine <td>15000-08</td><td>Per il taglio della sutura</td></tr><tr><td>Pinze dentate 1x2 denti</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11021-12</td><td></td></tr><tr><td>2 pinze a punta fine (Dumont No.5)</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinze angolate a punta fine (Dumont n. 5/45)</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11253-25</td><td>Per la dissezione smussata</td></tr><tr><td>Pinze a punta fine curva (Dumont n. 7)</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>11273-22</td><td>Utile per passare intorno ai vasi</td></tr><tr><td>Crile Haemostat curvo</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>1300-04</td><td></td></tr><tr><td>Applicatore di micro clip con blocco</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>18056-14</td><td></td></tr><tr><td>2 x Micro serrefines larghezza molla 2 mm, lunghezza ganascia 4 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-04</td><td>Morsetti microvascolari</td></tr><tr><td>2 x Divaricatore a filo Colibri da 3 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi Castroviejo con blocco</td><td>Fine Science Tools</td><td>120660-01</td><td></td></tr><tr><td>Applicatore di clip per ferite</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-07</td><td></td></tr><tr><td>Clip per ferite da 7 mm</td><td>Fine Science Strumenti</td><td>12032-07</td><td>Rimuovere da 7 a 10 giorni dopo l'intervento</td></tr><tr><td colspan="4">Attrezzatura</td></tr><tr><td>Microscopio OPMI pico</td><td>Carl Zeiss</td><td>S100</td><td></td></tr><tr><td>Unità di cauterizzazione termica con punta fine</td><td>Geiger</td><td>150A</td><td></td></tr><tr><td>Pad elettronico termico</td><td>Cozee Cumfort</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Euroklav 23-S</td><td>Melag</td><td>n/a</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td colspan="4">Monouso attrezzatura</td></tr><tr><td>7/O Sutura intrecciata in seta</td><td>Pearsall</td><td>30514</td><td></td></tr><tr><td>10/O Sutura Dafilon (poliammide)</td><td>B-Braun</td><td>&nbsp; </td><td></td>G1118099</tr><tr><td>6/O Vicryl (plygalectin)</td><td>Ethicon</td><td>W9537</td><td></td></tr><tr><td>Ago smussato regolare, 1 pollice, 21G</td><td>Bection, Dickinson and Company</td><td>305175</td><td>Per anastamosi ureterale</td></tr><tr><td>Ago smussato regolare, 5/8 pollici, 25G</td><td>Bection, Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Ago smussato regolare, 1/2 pollice, 30G</td><td>Bection, Dickinson and Company</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Ago da insulina 1ml, 29G</td><td>Bection, Dickinson and Company</td><td>324827</td><td></td></tr><tr><td>Ago da insulina 0,3ml, 30G</td><td>Bection, Dickinson and Company</td><td>324826</td> siringa da <td></td></tr><tr><td>1 ml con punta a slitta</td><td>Bection, Dickinson and Company</td><td>300184</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 5 ml con punta a slitta</td><td>Bection, Dickinson and Company</td><td>302187</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi di carta Wypall</td><td>Kimberley-Clark</td><td>L40</td><td>sterilizzato in autoclave</td></tr><tr><td>Cotton fioc</td><td>Johnson and Johnson</td><td>n/a</td><td>sterilizzato in autoclave</td></tr><tr><td>Teli lisci</td><td>Guardian</td><td>CB03</td><td>sterilizzato in autoclave</td></tr><tr><td>Piatto di coltura cellulare 60 mm x 15 mm</td><td>Corning Incorporated</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Spillo di erogazione</td><td>B-Braun</td><td>DP3500L / 413501</td><td>Utilizzato con NaCl 0,9%</td></tr><tr><td>Reagenti e farmaci</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Lacri-Lube) Paraffina morbida bianca 57,3%, olio minerale 42,5% e alcoli di lanolina 0,2%</td><td>Allergan Ltd</td><td>21956GB10X</td><td></td></tr><tr><td>(Videne) Povidone-iodio 10%</td><td>Ecolab Ltd</td><td>PL 04509/0041</td><td></td></tr><tr><td>(Vetalar V) Ketamina cloridrato</td><td>Pfizer Animal Health</td><td>Vm 42058/4165</td><td>100mg/ml soluzione (dose 200mg/kg)</td></tr><tr><td>(Domitor) Medetomidina cloridrato&nbsp;</td><td>Orion Pharma</td><td>Vm 06043/4003</td><td>1mg/ml (dose 0,5mg/kg)</td></tr> <tr><td>(Vetergesic) Bupernorfina cloridrato&nbsp;</td><td>Alsto Animal Health</td><td>Vm 00063/4002</td><td>0,3 mg/ml (dose 0,05 mg/kg)</td></tr> <tr><td>(Antisedan) Atipamezolo idrocoruro</td><td>Orion Pharma</td><td>Vm 06043/4004</td><td>5 mg/ml (dose 2 mg/kg)</td></tr><tr><td>Soluzione dell'Università del Wisconsin</td><td>Belzer Bridge to Life</td><td>n/a</td><td>dose circa 500 microlitri/topo</td></tr><tr><td>NaCl 0,9%</td><td>Baxter</td><td>FKE1323</td><td></td></tr><tr><td>Eparina solfato</td><td>non proprietario</td><td>n/a</td><td>5000 unità/ml (dose 5 unità/mouse)</td></tr></tbody></table>

mouse trapianto renale: modelli di allograft rifiuto

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Il rigetto del rene trapiantato nell'uomo è ancora una delle principali cause di morbilità e mortalità. Il modello murino di trapianto renale replica fedelmente sia i processi tecnici che patologici che si verificano nel trapianto renale umano. Sebbene esistano modelli murini di rigetto allogenico in organi diversi dal rene e siano tecnicamente più fattibili, ci sono prove che organi diversi suscitano modalità e dinamiche di rigetto disparate, ad esempio il decorso temporale del rigetto nell'allotrapianto cardiaco e renale differisce significativamente in alcune combinazioni di ceppi. Questo modello è uno strumento interessante per molte ragioni, nonostante le sue sfide tecniche. Poiché gli aplotipi del ceppo di topo consanguineo sono ben caratterizzati, è possibile scegliere combinazioni di donatore e ricevente per modellare il rigetto acuto dell'allotrapianto mediante trapianto in loci MHC di classe I e II. Al contrario, con il trapianto tra ceppi con aplotipi simili, può essere indotto un processo cronico in cui il rene allotrapianto sviluppa fibrosi interstiziale e atrofia tubulare. Abbiamo modificato la tecnica chirurgica per ridurre i tempi operatori e migliorare la facilità dell'intervento, tuttavia è ancora necessario superare una curva di apprendimento per replicare fedelmente il modello. Questo studio fornirà i punti chiave della procedura chirurgica e aiuterà il processo di creazione di questa tecnica.

Renale rigetto del trapianto allogenico può essere valutata mediante analisi istologica di sezioni di tessuto incluse in paraffina methacarn-fisso del rene trapiantato (Figura 2). Trapianto di reni tra Isograft risultati topi singenici in renale danno da riperfusione ischemica, comunque da 4 settimane di tubuli hanno recuperato e sono istologicamente paragonabili a reni nativi. Rigetto acuto può essere modellato da C57BL / 6 trapianto renale in riceventi BALB / c, entro 1 settimana non vi è diffusa infi...

Qui, presentiamo un protocollo per studiare l'immunologia del rigetto. Il modello chirurgico presentato riporta un breve tempo operatorio e una tecnica concisa. A seconda della combinazione di ceppo donatore-ricevente, il rene trapiantato può sviluppare rigetto cellulare acuto o danno cronico da allotrapianto, definito da fibrosi interstiziale e atrofia tubulare.

Mouse trapianto renale: Modelli di Allograft Rifiuto

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Questo video presenta un modello murino di trapianto di rene. Utilizzando i ceppi inbred multipli, che hanno le principali classi di istocompatibilità conosciute, siamo in grado di ricreare diversi aspetti del rigetto dell'allotrapianto renale. I dati presentati illustrano come questo sia un modello utile Nello studio di questi meccanismi, questo cartone animato schematico dimostra i passaggi principali di questo modello.Una nefrectomia sinistra viene eseguita su un topo donatore e il rene del donatore viene quindi preparato su un tampone sterile. In un piatto di coltura, il topo ricevente viene sottoposto a una nefrectomia destra prima che il rene del donatore venga trapiantato. La procedura viene eseguita utilizzando strumenti sterili autoclavati e materiali di consumo posizionati all'interno di un campo chirurgico sterile.Se vengono operati più animali, viene utilizzato un nuovo set di strumenti sterili per ciascuna procedura o gli strumenti vengono sterilizzati tra una procedura e l'altra. Utilizzando uno sterilizzatore a microsfere, l'operatore indosserà un camice sterile, una maschera, un cappello e guanti. Un solo operatore può eseguire questa procedura preparando il donatore fino al punto di prelievo del rene.Il ricevente viene quindi preparato per il trapianto prima di tornare dal donatore per rimuovere il rene. Questo riduce il tempo di ischemia fredda. In alternativa, due operatori possono preparare contemporaneamente la donatrice e la ricevente.Ciò consente di operare più animali in un giorno. Ecco un topo maschio di sei anni di C 57 di otto settimane che è stato anestetizzato con un'iniezione intraperitoneale di ketamina, cloridrato e meina. L'area chirurgica è stata rasata e igienizzata utilizzando una soluzione di iodio diluito.Il mouse è stato posizionato su un cuscinetto chirurgico riscaldato drappeggiato sterile con le estremità fissate al tampone. L'unguento per gli occhi è stato applicato. Una laparotomia viene eseguita mediante un'incisione cutanea sulla linea mediana.Quindi la cavità peritoneale viene aperta tramite l'Albert lineare utilizzando le forbici per la separazione dei tessuti. Il topo viene quindi drappeggiato e un divaricatore calibratore viene inserito nell'incisione. L'intestino viene spostato a sinistra o a destra del campo chirurgico per esporre il rene sinistro e l'uretere per preparare il rene del donatore.Per il trapianto, l'uretere viene legato e diviso il più vicino possibile alla vescica. Le vene gonadiche inferiori e surrenali superiori sono legate e divise vicino alla vena renale. L'aorta è legata, superiore e inferiore all'arteria renale e la soluzione fredda dell'Università del Wisconsin viene iniettata nell'aorta per perfondere il rene.L'uretere può essere facilmente sezionato dal retroperitoneo e rintracciato fino alla sua terminazione della vescica. Dovrebbe essere legato il più vicino possibile alla vescica con una sutura 7.0 e poi diviso la vena gonadica sinistra normalmente si svuota nella vena renale. Dovrebbe essere doppiamente legato utilizzando una sutura 9.0 e diviso tra le suture vicino alla vena renale.Come mostrato in questa clip in modo simile, la vena surrenalica sinistra si svuota nella vena renale e deve essere legata e divisa. L'attenzione dovrebbe quindi rivolgersi alla dissezione dell'aorta del donatore dal tessuto linfatico circostante e all'avvento per consentire il posizionamento della prima e comprendente sutura inferiore libera. Quindi una sutura superiore all'arteria renale.Una volta che il topo donatore è pronto, cinque unità di eparina per via endovenosa vengono somministrate dalla vena penale dorsale. In primo luogo, la sutura aortica inferiore viene legata strettamente, seguita dalla legatura superiore. Questo isola il rene dalla circolazione arteriosa.Circa 500 microlitri di soluzione fredda universitaria Wisconsin vengono somministrati dall'aorta. Il successo della profusione è identificato dallo sbollentamento del rene del donatore. L'aorta è divisa prima inferiormente e poi superiormente all'arteria renale.Successivamente, la vena renale viene divisa alla sua giunzione con la vena cava. Il rene del donatore viene quindi rimosso e posto su una garza sterile fredda. In un piatto di coltura, l'aorta è incisa longitudinalmente direttamente di fronte all'aorta renale.Per creare un cerotto aortico per l'anastomosi, identificare il lume dell'arteria renale e assicurarsi che non ci siano arterie polari extra. La vena renale viene quindi preparata posizionando prima una sutura in poliammide 10 O all'apice inferiore della vena renale e poi, analogamente, una sutura all'apice superiore. Le legature che dividevano la vena surrenale e la vena gonadica sono utili marcatori per orientare la vena.A questo punto, dopo il prelievo del rene da donatore, viene preparato un topo ricevente come descritto in precedenza, il topo ricevente viene drappeggiato e viene inserito un divaricatore calibra. L'intestino viene spostato a destra o a sinistra del campo chirurgico e coperto con teli sterili inumiditi con soluzione salina. In primo luogo, una nefrectomia destra viene eseguita legando l'arteria renale e la vena con sette oh di sutura, quindi l'uretere viene isolato e legato prima della divisione.Infine, l'arteria renale e la vena vengono divise, dopodiché il rene può essere rimosso. Questo crea spazio all'interno della cavità peritoneale per il rene, l'aorta e la vena del ricevente del trapianto, quindi l'aorta e la vena devono essere preparate per l'anastomosi vascolare. In primo luogo, il fascio linfatico viene mobilizzato dall'aorta e dalla vena cava e il retroperitoneo viene aperto.Sezionare senza mezzi termini i vasi lombari dagli aspetti sinistro e destro per consentire il posizionamento di una sutura attorno ai vasi lombari. I vasi possono quindi essere legati in continuazione senza dividersi. Ciò previene il sanguinamento della schiena durante l'esecuzione dell'anastomosi vascolare.Viene quindi eseguita un'ulteriore dissezione per creare una finestra tra l'aorta e la vena cava e dal tessuto circostante dell'avvento. Identificare una posizione per il clamp microvascolare superiore e inferiore, assicurandosi che sia privo di tessuto in eccesso e pronto per l'anastomosi. A questo punto, l'eparina può essere somministrata per iniezione endovenosa come mostrato in precedenza, Il rene del donatore viene posizionato nella cavità peritoneale del ricevente.Prestare attenzione al topo per garantire che le suture posizionate nella vena non si aggroviglino. Questo cartone animato schematico mostra il rene del donatore insieme all'aorta e alla vescica IVC del ricevente dopo la nefrectomia destra per trapiantare un rene da donatore due. Un clamp traumatico viene applicato all'IVC e all'aorta sopra e sotto il sito dell'anastomosi vascolare.Il rene, la vena renale e l'arteria del donatore sono anastomosi rispettivamente nell'IVC e nell'aorta del ricevente. Successivamente, le pinze atraumatiche vengono rimosse e il rene del donatore viene riperfuso. L'uretere viene quindi anastomosi nella vescica del ricevente.Il morsetto microvascolare inferiore viene applicato e comprende sia l'aorta che la vena cava. Viene quindi posizionato un morsetto superiore. Atomy è realizzato con un ago calibro 30 e la vena cava arrossata con soluzione fisiologica.La venotomia viene allargata con una pinza. La sutura precedentemente posizionata all'apice superiore della vena renale del donatore viene quindi fatta passare attraverso la vena cava del ricevente all'apice superiore della venotomia. La sutura viene quindi legata e viene eseguita un'anastomosi della sutura in esecuzione della parete posteriore della vena renale allo speleologo della vena una volta raggiunto l'apice inferiore dell'otomia del pH.La seconda sutura precedentemente inserita nella vena renale viene fatta passare attraverso la vena cava inferiore e legata. Questo può quindi essere legato alla prima sutura e viene eseguita un'anastomosi vascolare in esecuzione per completare la parete frontale. Nel protocollo di accompagnamento, viene fornita una rappresentazione schematica di ogni fase dell'anastomosi vascolare.È di fondamentale importanza evitare di suturare inavvertitamente la parete anteriore alla parete posteriore e anche di coinvolgere l'arteria vera e propria o la macchia aortica nelle suture dell'anastomosi di Venere. L'autotomia dell'aor del donatore può quindi essere creata raccogliendo una piccola ellisse dell'aorta nella pinza e tagliando con precisione con le forbici. Una sutura da 10 oh viene quindi posizionata nel punto superiore del cerotto aortico.Fare attenzione a eseguire una manipolazione minima di una qualsiasi delle superfici endoteliali arteriose. Poiché ciò aumenta il rischio di trombosi, la sutura viene quindi fatta passare attraverso l'apice superiore dell'autotomia A e della marea. Il cerotto aortico può quindi essere anastomosi in una sutura in esecuzione all'aorta del ricevente e legato a se stesso.Fare attenzione a non legare troppo strettamente in quanto ciò potrebbe causare un effetto per corda e compromettere l'afflusso. Il clamp microvascolare inferiore viene rimosso per primo, spesso si verifica una riperfusione a causa del riflusso nell'arteria renale dall'aorta distale. Quindi il morsetto superiore viene rimosso.L'anastomosi ureterale viene quindi eseguita facendo passare un ago calibro 21 dentro e fuori dalla vescica. Le pinze vengono quindi fatte passare indietro attraverso il tratto e quindi l'uretere viene aspirato attraverso la sutura. Il tessuto di avvento dell'uretere viene quindi suturato al tessuto di avvento della vescica con nove oh di poliammide in tre punti per fissare l'uretere in posizione.L'uretere viene quindi tagliato, lavato fino alla vescica e spesso l'urina può essere vista prodotta dal rene del donatore. Si noti anche il sanguinamento dai vasi perureterali. L'uretere viene lasciato giacere liberamente nella vescica e il difetto chiuso dopo aver sostituito l'intestino.Il peritoneo viene suturato e la pelle viene chiusa mediante clip metalliche. Lo iodio viene quindi applicato all'area chirurgica e l'anestesia viene parzialmente invertita mediante un'iniezione sottocutanea di tapazolo cloridrato. Analgesici Vengono somministrati mediante iniezione di buprenorfina cloridrato.I liquidi vengono somministrati mediante iniezione sottocutanea di soluzione fisiologica riscaldata da un mil. I topi vengono attentamente monitorati fino a quando non si riprende conoscenza, appaiono vigili e incapaci di scrivere da soli. I topi possono recuperare qualsiasi scatola riscaldata mantenuta a 29 gradi per 24 ore per esperimenti a lungo termine.Vengono somministrati analgesici in corso e le clip cutanee vengono rimosse. Sette giorni dopo l'intervento. Ecco un topo 24 ore dopo l'intervento chirurgico notato che è completamente mobile ed è oltre l'urina macchiata di sangue sul tessuto della lettiera.È importante monitorare la gestione della paralisi in questo modello in quanto ciò può indicare complicanze vascolari presentate. Poi ci sono i dati che indicano come questo modello e diversi ceppi di topi possono essere utilizzati per studiare lo sviluppo del rigetto del trapianto renale per modellare il rigetto acuto del trapianto. Il ceppo di topo mutante BM 12 viene utilizzato come donatore.Questi topi mutanti BM 12 differiscono dal ceppo genitore C 57 black six per una singola differenza di classe MHC di due volte trapiantando un rene BM 12 in un ricevente C intestinale. Provoca un rigetto acuto a causa di una mancata corrispondenza completa di MHC di classe uno e di classe due. Un allotrapianto C 57 black six porta allo sviluppo di rigetto cronico a causa del disallineamento MHC isolato Gli innesti ISO BM 12 hanno una corrispondenza MHC completa di classe uno e classe due e quindi non mostrano segni di rigetto.La struttura renale viene esaminata mediante istopatologia su sezioni renali incluse in paraffina colorate con ematina ed eoina. Poiché questo modello non dipende dal trapianto per la sopravvivenza, il rene nativo può essere utilizzato come controllo Dopo il trapianto renale con innesto ISO, il rene subisce un danno da riperfusione ischemica, ma entro quattro settimane i tubuli si sono ripresi dopo il trapianto di allotrapianto di biopsia con BM 12. Il rigetto acuto è evidente con infiltrati diffusi di cellule mononucleate denotati dai tubuli necrotici con asterisco singolo con doppio asterisco e reni tubuli BM 12 trapiantati in topi C 57 black six.Provoca un danno cronico allotrapianto caratterizzato da infiltrato linfatico perivascolare indicato dalle frecce di blocco con fibrosi interstiziale e atrofia tubulare indicata da frecce cave. La quantificazione dei tubuli per campo ad alta potenza può essere utilizzata per valutare la massa funzionale del nefrone. Non c'era differenza tra il trapianto ISO e la conta dei tubuli renali nativi di quattro settimane dopo il trapianto.Il rigetto acuto provoca una significativa perdita di tubuli entro quattro settimane. In confronto, il rigetto cronico mostra una perdita più varia ma graduale. Piro serious red è un colorante di collagene pan e può essere eseguito su sezioni renali incluse in paraffina Per quantificare la fibrosi interstiziale.Il trapianto renale con trapianto ISO è associato a fibrosi insignificante rispetto al rene nativo BM 12 inter C 57. Il blocco sei provoca la fibrosi a 12 settimane. Dopo il trapianto, abbiamo descritto un modello di trapianto renale con particolare attenzione alla dimostrazione delle tecniche chirurgiche.Questo modello è associato a una curva di apprendimento significativa, che può essere superata per ottenere un modello di trapianto di rene di topo funzionante riproducibile. La combinazione di ceppi descritta sviluppa le caratteristiche chiave del danno cronico da trapianto renale e può essere utilizzata per studiare la patologia risultante della fibrosi interstiziale e dell'atrofia tubulare. Inoltre, il rigetto acuto può anche essere modellato, consentendo lo studio di importanti meccanismi fisiopatologici di questa entità.Questo video fornisce punti chirurgici chiave per aiutare lo spettatore a replicare fedelmente questo modello.

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