Name: Produzione e Targeting di monovalente Quantum Dots (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Scopri come preparare quantum dots monovalenti con DNA fosforotioato per l'imaging di singole molecole di proteine di membrana in cellule vive. Questo protocollo semplice e accessibile facilita il tracciamento dinamico delle proteine.

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Finanziamento previsto dal DOD W81XWH-1023/10/01 (ZJG), concessione P50 GM081879 dal Centro UCSF per sistemi e Biologia Sintetica (ZJG), NIH 5R21EB015088-02 (YJ) e NIH 1R21EB018044 (ZJG &amp; YJ). DS è stato sostenuto da Human Frontier Science Program Cross postdoc disciplinare Research Fellowship.

1 Produzione di monovalente Quantum Dots <ol><li> Trasferimento di fase di QD da organico a fase acquosa <ol><li> Diluire 200 ml di una soluzione 1 mM di QD fase organica con 400 ml di cloroformio in un flaconcino di vetro da 5 ml. </li><li> Mescolare 400 ml di una soluzione 0.3 M tetrabutilammonio bromuro (TBAB) il cloroformio con 36 ml di pulito mPEG tiolo (CH 3 O (CH 2 CH 2 O) 6 C 2 H 5 SH) e agitare O / N. </li><li> Aggiungere 800 ml di una soluzione acquosa 0,2 M di NaOH e agitare per 30 sec. Un trasferimento di fase si verifica entro pochi minuti, indicati dal trasferimento delle particelle colorate alla fase acquosa sopra la fase organica più densa. </li><li> Se le particelle si aggregano in una terza fase tra le fasi acquosa ed organica, aumentare il tempo di incubazione con il tiolo MPEG. Se la fase acquosa rimane chiaro, i QD non hanno fatto il trasferimento di fase (vedi Figura 3A). In alternativa, aumentare la concentrazione di mPEG tiolo al punto 2 per alleviare poveri trasferimento di fase. </li><li> Recuperare l&#39;(colorato) fase acquosa e quindi concentrare le QD raccolti con una colonna Centricon di spin (peso molecolare 30 kDa cut-off) a 1 ml. </li><li> Aggiungere la soluzione QD concentrata in una colonna Sephadex NAP10 pre-equilibrata con tampone Tris 10 mM contenente 30 mM NaCl (pH 8,0). Eluire i QD con 1,5 ml di tampone di eluizione di flusso di gravità. </li><li> Misurare la concentrazione di QD con spettroscopia di assorbimento a 350 nm. </li></ol></li><li> Preparazione di MQDS <ol><li> Acquisto (o sintetizzare) ptDNA. Questo protocollo utilizza la sequenza 5&#39;-A S 50 (CT) 10 (ACTG) 5 -3 &#39;(vedi Tabella 1). </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> DNA </td><td> Sequenza </td></tr><tr><td> 5&#39;-A S 50 (CT) 10 (ACTG) 5 </sub&gt; -3 &#39; </td><td> A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S A S CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTACTGACTGACTGACTGACTG </td></tr><tr><td> 5&#39;-NH 2 - (CT) 10 (CAGT) 5 -3 &#39; </td><td> NH 2 - / C6spacer / CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT </td></tr><tr><td> BG-DNA </td><td> BG- / C6spacer / CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAGTCAGTCAGTCAGTCAGT </td></tr></tbody></table> Tabella 1. sequenze di DNA utilizzate per produrre e MQDS bersaglio. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Preparare 1 ml di soluzione di QD 100 nM in tampone Tris 10 mM contenente 30 mM NaCl (pH 8). </li><li> Aggiungere una goccia saggi 500 microlitri della soluzione di 100 nM ptDNA ai QD acquosi per 1 min, mescolando energicamente. Mescolare o posizionare su un agitatore per un ulteriore 9 ore. Nota: Questo dovrebbe teoricamente produrre un rapporto di 1: 2 di ptDNA: QD. Tuttavia, la stechiometria reale è mai perfetta - solitamente il risultato è più vicino a 1: 1.5. Al fine di produrre un rapporto 1: 1 di ptDNA: QD, densitometria dopo elettroforesi su gel è necessario quantificare l&#39;esatto rapporto di coniugazione in volumi noti utilizzati in precedenza. </li><li> Rimuovere ~ 10 ml di miscela QD per funzionare su un gel di agarosio analitica. Rimuovere anche una simile concentrazione di QD non coniugati in fase acquosa (dal punto 1.2.1). <ol><li> Aggiungere ~ 2 μ; L di tampone di caricamento 6x Ficoll (per aumentare la densità della soluzione) ed eseguire questi due campioni insieme su un gel 0,8% p / v agarosio in tampone borato di sodio per 15 minuti a 150 V. Una singola banda nella corsia di controllo non coniugata migrazione vicino a il bene, e due bande in corsia con QD coniugati sono visti (vedi gel nella Figura 2B). </li></ol></li><li> Calcolare la frazione QD coniugato usando l&#39;intensità relativa delle due bande (vedere l&#39;equazione nella Figura 2B). Quindi utilizzare la frazione per calcolare il volume supplementare di 100 nM ptDNA soluzione necessaria per corrispondere al numero di QD. </li><li> Ripetere i passaggi da 1.2.3 a 1.2.5 ancora una volta con questo volume calcolato o fino a quando il QD coniugati crollo in una singola banda sul gel che indica la coniugazione completa di tutti i QD. </li><li> Aggiungere 100 ml di 10 mM (CO 2 H) CH 2 O (CH 2 CH 2 O) 6 C 11 H 23 SH (carbossi PEG6 alcano tiolo) in 10 mM Tris buffer di containing 30 mM NaCl (pH 8) per i MQDS coniugati prodotte in precedenza, e agitare per 10 min. Nota: Questi ligandi PEG passivare la superficie QD. Un PEG sarà più meglio passivare i QD, tuttavia, sarà anche aumentare la loro dimensione. La funzionalità alcano tiolo idrofoba ha un&#39;affinità molto maggiore per i QD, nel complesso, rispetto al meno idrofobico PEG-tiolo utilizzato per il trasferimento di fase. Pertanto, non permettere che questo passaggio di procedere troppo a lungo o il ptDNA sarà sostituito dal alcano-PEG-tiolo. Dopo un min di incubazione ~ 30, una frazione significativa di DNA sarà stato spostato dai QD (Figura 3B). </li><li> Per rimuovere l&#39;eccesso di alcano PEG-tiolo, aggiungere 0,5 ml della soluzione QD per una colonna Sephadex NAP5 pre-equilibrata con tampone di eluizione (10 mM tampone Tris contenente NaCl 30 mM). Raccogliere le MQDS con 1,0 ml di tampone di eluizione di flusso di gravità. </li><li> Concentrare i QD raccolti con una colonna Centricon di spin (30 kDa). Conservare queste MQDS a 4 ° C per mesi. Non frli eeze. Nota: Se una pallina colorata nella parte inferiore del tubo è visto, i puntini si sono aggregati e sono probabilmente non più utilizzabili. </li></ol> 2 Produzione di targeting (Benzylguanine-) DNA <ol><li> Produrre o acquistare DNA ammina-terminato. Questo protocollo utilizza la sequenza 5&#39;-NH 2 - (CT) 10 - (CAGT) 5 -3 &#39;(vedi Tabella 1). Il linker poli-CT aumenta l&#39;accessibilità alla funzionalità sepolto nel profondo del glicocalice, ma potrebbe non essere necessario per tutte le applicazioni. Se vi è l&#39;accesso a un sintetizzatore di DNA, produrre DNA amino-modificato utilizzando un appropriato 5 &#39;amino-modificatore (5&#39; amino-modificatore C6). </li><li> Sciogliere BG-N-idrossisuccinimmide (BG-NHS) in dimetilsolfossido secco (DMSO) ad una concentrazione di 10 mg / ml. Nota: BG-NHS in grado di assorbire acqua dall&#39;aria e portare a idrolisi del reattiva NHS-estere, in particolare in solventi igroscopici come il DMSO e dimetilformammide (DMF). BG-NHS è miglior negoziod a -80 ° C come polvere nel suo flacone in un contenitore contenente essiccante secondario. Riscaldare a TA prima apertura del flacone. In alternativa, un&#39;aliquota immediatamente per uso singolo estere BG-NHS in un solvente polare asciutto e congelare a -80 ° C, o reagire completamente con il DNA ammina al punto 2.2. </li><li> Reagire mescolando il BG-NHS in DMSO dal punto 2.1 con il DNA ammina-terminato in HEPES (4-(2-idrossietil) -1 acido-piperazineethanesulfonic) tamponata (pH 8,5) di acqua. In un tipico reagire 20 ml di 10 mg / ml BG-NHS in DMSO con 2 ml di 2 mM NH 2 - (CT) 10 - (CAGT) 5 a 58 ml di acqua deionizzata tamponata con 20 microlitri 0,5 M HEPES pH 8,5. Effettuare reazioni in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Mescolare rapidamente la reazione procede rapidamente e deve competere con NHS-estere idrolisi. </li><li> Sonicare per 5-10 min per garantire un&#39;accurata miscelazione. Incubare ~ 1 ora a temperatura ambiente. Il rapporto stechiometrico di BG: DNA può essere modificato per guidare la reazione al completamento. </li><li&gt; desalt la reazione utilizzando una colonna standard di NAP5 in 100 mM acetato di trietilammina (TEAA, pH 7). </li><li> Purificare il BG-DNA dal reagito ammina-DNA-HPLC in fase inversa esecuzione di un TEAA 100 mm: acetonitrile (ACN) pendenza tra l&#39;8% e il 95% acetonitrile oltre 30 min. L&#39;ammina-DNA che non ha reagito viene eluire prima che il BG-DNA. Raccogliere la frazione BG-DNA in un tubo conico. <ol><li> Utilizzare una colonna C 18 Zorbax per la purificazione oligonucleotide di serie e il seguente gradiente: 0 → 15 min: 8 → 30% ACN; 15 → 21 min: 30-90% ACN; 21 → 25 min: 90 → 8% ACN; 25 → 30 min: 8% ACN; </li></ol></li><li> Congelare in azoto liquido e liofilizzare la frazione raccolta. Risospendere il DNA in acqua deionizzata. Per essere molto attenti, liofilizzare altre due volte per rimuovere TEAA residuo. TEAA residuo può essere tossico per le cellule a concentrazioni più elevate. </li><li> Risospendere il liofilizzato BG-DNA in acqua, avendo cura di lavare i lati di the tubo, e portare a ~ 25 mM magazzino. Aliquota e conservare a 4 ° C. I campioni sono stati conservati per ~ 9 mesi senza degrado evidente. </li></ol> 3. Cellule Etichettatura diretta con monovalente Quantum Dots <ol><li> Facoltativamente, passivare le MQDS appena prima di un esperimento di imaging utilizzando reagenti quali caseina (0,5%) o albumina di siero bovino (BSA, 1-3%). </li><li> Cellule piastra che esprimono la proteina SNAP-tag sulla riflessione totale interna fluorescenza (TIRF) vetro -Qualità. In questo esperimento, si usa una linea cellulare U2OS esprimono un recettore Notch1 SNAP-tag e superfici in vetro di alta qualità. </li><li> Dopo che le cellule hanno attaccato al vetro (~ 24 ore), rimuovere i supporti di crescita, lavare con PBS, e incubare le cellule per 10-30 minuti a temperatura ambiente in ~ 100-150 ml di PBS o supporti cella contenente ~ 1 mM BG- DNA a partire dal punto 2.6. </li><li> Dopo l&#39;incubazione con BG, lavare accuratamente le cellule con PBS o supporti cellulare. Incubare le cellule per ~ 5-10 min con thE MQDS prodotte nella fase 1.2.9 (e facoltativamente passivazione al punto 3.1). </li><li> Facoltativamente, lavare i MQDS non legate e tornare alle cellule di un buffer / media adatto sia per l&#39;imaging e la cultura. Per le celle che dovevano essere ripreso in modalità TIRF, una fase di lavaggio finale è stato spesso inutili come MQDS sciolti in soluzione diffuse così rapidamente rispetto a MQDS legati da essere rilevabile durante l&#39;analisi. </li></ol> 4. Microscopia e analisi <ol><li> Immagine le cellule utilizzando un microscopio TIRF. Nota: Il campo di applicazione deve avere eccitazione separabili e filtri di emissione, o un filtro cubo QD personalizzato. QD sono meglio eccitato con un laser a bassa lunghezza d&#39;onda (405 o 488 nm). QD di diametro diverso hanno caratteristiche lunghezze d&#39;onda di emissione, in genere associato a un grande cambiamento di Stoke. </li><li> A causa della luminosità di MQDS, raccogliere immagini a frame rate elevati in TIRF mentre l&#39;imaging lato basale di una cellula dal vivo. Nota: In alternativa, dinamica singola molecola possono essere followed in altri piani focali utilizzando un microscopio confocale disco rotante. Automatizzato software di monitoraggio singola particella è generalmente efficace a seguire con precisione le MQDS luminose e fotostabili. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La modularità del disegno dell&#39;MQD consente una maggiore flessibilità sperimentale. Ad esempio, una varietà di MQDS può essere rapidamente preparato in colori unici consentano imaging simultaneo di più bersagli. La sequenza di targeting ssDNA può dirigere MQDS alle proteine, zuccheri, lipidi e 12 superfici 13. Un certo numero di tag enzimatiche sono disponibili con reattività ortogonali, consentendo a più obiettivi da essere ripreso in contemporanea con MQDS differenziale mirati. Oltre al targeting con il tag SNAP, l&#39;etichettatura delle proteine ​​bersaglio con MQDS utilizzando il tag CLIP, il tag HALO, e proteine ​​biotinilati era anche successo. Questo protocollo dimostra la marcatura specifica di un recettore di superficie su cellule vive con questi MQDS, ma il protocollo può essere facilmente adattato a diversi contesti differenti. L&#39;intuizione metodologica significativo nella produzione MQDS con valenza definita è che ~ 50 fosforotioato-linkedle basi sono tenuti ad avvolgere i QD (e quindi evitare che due molecole di legarsi contemporaneamente). Una poli-Una sequenza S 50 riproducibile e stabilmente vincolata 605 nm QD da Life Technologies. Anche se questo prodotto è fuori produzione, la strategia di esclusione sterica è generalizzabile a prodotti simili di altri produttori che hanno diverse dimensioni, forme, le proprietà spettrali. L&#39;efficienza e la stabilità dei QD ptDNA-avvolto dipende in modo critico dalla chimica di superficie e la struttura dei QD. Pertanto, il successo di un protocollo dipenderà dalla struttura sorgente e la chimica commerciale dei QD. Ai fini del presente protocollo, tre grandi punti di differenza esiste tra le varie fonti commerciali di QD: una differenza nelle condizioni necessarie per il trasferimento di fase; una differenza nella forza di iniziale PEG-tiolo-ligando vincolante, eventualmente ostacolare lo spostamento dal ptDNA; e una differenza nella quantità di nucleo CdSe esposto, che può leannuncio a la tempra del QD dalle condizioni di trasferimento di fase tiolo Mpeg. Come di pubblicazione, QD con la migliore struttura per la produzione di MQDS sono 4-10 nm QD CdSe / ZnS nucleo / guscio acquistati da Life Technologies con spettri di emissione a 545, 585, 605 e 625 nm (Figura 2A). QD basati sulla formulazione &#39;Vivid&#39; (545, 605, ecc) estinguono dopo l&#39;aggiunta di mPEG tiolo e non sono adatti per questa applicazione. QD da Aldrich e Ocean Nanotech funzionano bene, ma richiedono il trasferimento gradini e pre-trattamento con ossido trioctylphosphine fase più lunga. Questo protocollo è stato ottimizzato per QD da Life Technologies. La sequenza poly-A fosforotioato utilizzato per avvolgere i QD termina con una coda di DNA di 20-mer nativo contenente la sequenza di (ACTG) 5 a cui un filamento di targeting può ibridare. Questa sequenza è conveniente, in quanto ha poca o nessuna struttura secondaria, e rimarrà hybridized a 37 ° C in PBS. Se vi è l&#39;accesso a un sintetizzatore di DNA, il ptDNA può venire sintetizzato e poi purificato per cromatografia in fase inversa liquida ad alta prestazione (HPLC) utilizzando una colonna C 8. Il ptDNA si eluire in seguito alla HPLC di oligonucleotidi equivalenti con una spina dorsale nativo. Noi di solito lasciamo il 5 &#39;DMT gruppo protettivo sui nostri oligonucleotidi fosforotioati dopo la purificazione. Passivazione dei QD ptDNA-avvolto è di solito necessario per migliorare la stabilità colloidale del QD e ridurre vincolante per le applicazioni più sperimentali sfondo. Il protocollo utilizza un PEG-livello per passivare le QD. Carboxy PEG tiolo alcano con unità aggiuntive PEG ((CO 2 H) CH 2 O (CH 2 CH 2 O) 12 C 11 H 23 SH, carbossi-PEG12 alcano tiolo) fornisce significativamente ridotto sfondo, anche se i PEG più lunghi sono entrambi più grandi, e generalmente più costosi. MQDS rivestiti con carbossi PEG alkaleganti tiolici ne sono altamente stabili nel buffer fisiologici come fosfato tamponata saline e terreni di coltura. Stoccaggio a lungo termine (&gt; 8 mesi) di MQDS a 4 ° C non ha mostrato alcuna significativa aggregazione o ptDNA distacco 11. A seconda l&#39;esperimento, PEG passivazione dei QD da sola non sempre sufficiente a ridurre legame non specifico delle MQDS. Incubare entrambe le cellule e MQDS in tampone fosfato salino (PBS) contenente il 3% di BSA per 20 minuti prima dell&#39;uso sostanzialmente riduce legame non specifico per le cellule, anche se non aumentare il raggio idrodinamico apparente delle MQDS da ~ 50%. Passivazione con 0,5% di caseina riduce il legame non specifico ulteriormente ma aumenta la dimensione apparente in misura maggiore di BSA. L&#39;estremità 5 &#39;di un filamento di DNA complementare ai MQDS può essere modificato per consentire il targeting di diverse biomolecole. Ci sono un certo numero di tecniche consolidate disponibili per modificare covalentemente proteine, lipids e zuccheri con DNA a singolo filamento (ssDNA). Finché il ssDNA viene presentato extracellulare, è accessibile a MQDS solubili. MQDS con le sequenze di cui sopra saranno rapidamente ibridare con il loro filamento di DNA complementare in condizioni di coltura cellulare. A 10-20x poli (CT) distanziale tra il ptDNA e la sequenza di targeting può essere richiesto per il targeting efficiente in modo da elevare la sequenza di legame sopra il glicocalice della cellula spessa e carica negativa. Per questo protocollo abbiamo scelto di produrre un BG-DNA con una sequenza complementare di (CAGT) 5 che sia ibridato ai MQDS e covalente si collegherà ad una proteina SNAP-tag per l&#39;etichettatura rapida e specifica. A funzioni di protocollo simili anche per l&#39;accoppiamento altre NHS-esteri di oligonucleotidi aminoacidi modificati. Per l&#39;imaging singola molecola, una bassa densità di etichettatura è in genere necessario per risolvere singole molecole. Una concentrazione finale MQD di ~ 0,5 nM in PBS con l&#39;agente passivanteè un buon obiettivo. Tuttavia, queste diluizioni elevate talvolta portato a sotto-etichettatura delle cellule. In questo caso, ulteriore MQD possono essere aggiunti fino a quando si osserva una densità ottimale di etichettatura. Nel caso di SNAP-tag Notch1 umano, concentrazioni&gt; 10 nM MQD prodotte cellule di etichettatura dense mentre 0,5 nM MQD portato l&#39;attaccamento di ~ 20 MQDS sulla superficie basale della cellula bersaglio (vedi Figura 4B). Etichettatura delle cellule con MQDS era altamente dipendente dalla confluenza delle cellule placcato. Eccessivamente cellule confluenti non etichettare a loro superfici basali. In sintesi, un metodo semplice per generare monovalenti e QD modulari è stato descritto. Questi MQDS trovano utilità in un&#39;ampia gamma di applicazioni di imaging cellulare dal vivo, come dimostra l&#39;imaging del recettore Notch sulle cellule U2OS dal vivo. Applicabilità MQDS non è limitata a questo caso specifico, ma può essere potenzialmente estesa per altri bersagli cellulari come altre proteine, acidi nucleici, ed enzimi.

La dinamica di singole molecole sulle cellule vive contribuisce alla loro funzione biologica. Singola molecola di imaging di fluorescenza è un metodo popolare per studiare la dinamica di singola molecola sulla superficie cellulare 1,2,3. Tuttavia, le sonde di imaging più comunemente utilizzati in questi studi hanno diversi svantaggi importanti. Ad esempio, coloranti organici convenzionali e proteine ​​fluorescenti garantiscono luminosità moderata, circa 10 5 -10 6 M -1 cm -1, ma sono fotochimica instabili, sbiancamento dopo l&#39;emissione di circa 10 5 -10 6 fotoni in tipiche condizioni di imaging live-cell 4,5. Al contrario, le nanoparticelle di semiconduttori, spesso chiamati punti quantici (QD), sono significativamente più luminoso e più stabile, con coefficienti di estinzione nel range di 10 6 -10 7 M -1 cm -1 e superiore a 10 7 -10 8 fotoni emessi prima photoblNSEGNARE 5. La luminosità migliorata e fotostabilità di QD oltre fluorofori organici consente l&#39;osservazione delle singole molecole a frame rate notevolmente più veloci e più ancora a lungo traiettorie 6. Nonostante i loro vantaggi e disponibilità commerciale, alcune passività rimangono per questi potenti agenti di imaging. In primo luogo, essi hanno mal definito il targeting di valenza, che può provocare la reticolazione di biomolecole mirati 6. In secondo luogo, in genere hanno una grande dimensione idrodinamica (&gt; 20 nm) che limita l&#39;accessibilità per determinati ambienti affollati cellulari 7. In terzo luogo, essi hanno limitato il targeting modularità 7. Diverse strategie hanno tentato di affrontare questi problemi 8,9,10, ma in genere richiedono conoscenze e reagenti speciali implementare. Per affrontare questi problemi, abbiamo recentemente riportato una strategia di &quot;esclusione sterica&quot; ​​per la preparazione monovalente, piccolo, emodulari QD 11. I QD sono avvolti con un unico lungo DNA fosforotioato (ptDNA) polimero. Il ptDNA si lega alla superficie QD attraverso molteplici interazioni Zn-S tra gli atomi di Zn-superficie esposta ei gruppi fosforotioati del polimero ptDNA. Un unico polimero legato stericamente e elettrostaticamente esclude il legame di equivalenti aggiuntivi del polimero senza aumentare significativamente la dimensione complessiva della particella (circa 2 nm). Tutti i reagenti sono disponibili in commercio, i prodotti si formano in alto rendimento, e il processo richiede pochi passi dissalazione per la purificazione. Una volta etichettato, QD avvolto con un unico ptDNA (MQDS) si legano ai filamenti di DNA complementari recanti domini di targeting (ad esempio, benzylguanine (BG), benzylcytosine, o alkylhalides). Queste funzionalità di mira i MQDS specificamente per tag enzimatici come la SNAP, CLIP &amp; HALO che sono geneticamente fuse alla proteina di interesse. Questo è un protocollo per la sintesi, Targeting e live-cell imaging di MQDS prodotti per esclusione sterica.

<table><tbody><tr><td colspan="4">mQD Produzione</td></tr><tr><td>Phosphorothioate DNA:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(A*)x50-(ACTG)x5</td><td>IDT</td><td></td><td>La maggior parte delle aziende di sintesi di DNA</td></tr><tr><td>Punti quantici:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QDots 525, 585, 605 & 625</td><td>Invitrogen</td><td>Q21791MP (545), Q21711MP (585), Q21701MP (605)</td><td>Sintesi QD personalizzata per QD625.</td></tr><tr><td>QD610</td><td>Oceano Nanotech</td><td>QSP-610-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QD 610 lamda</td><td>Aldrich</td><td>731854</td><td></td></tr><tr><td>cloroformio, 99,8%</td> <td>ACROS</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>bromuro di tetrabutilammonio, 98,0%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>426288</td><td></td></tr><tr><td>tiolo mPEG [2,5,8,11,14,17,20-eptaoxadocosano-22-tiolo], MW 354,5, 95%</td> <td>Polypure</td><td>11156-0695</td><td></td></tr><tr><td>HSC11EG6CO2H&nbsp; [HS-(CH2)11-(OCH2CH2)6-OCH2CO2H]</td><td>ProChimia</td><td>TH 003-m11.n6-0.1</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico, 99,5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio, 99,0%</td> <td>ACROS</td><td>S/4845</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio, 98%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>310166</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio Le</td><td>Fonti biotecnologiche</td><td>statunitensi G02PD-125</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459828</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">BG-DNA Production</td></tr><tr><td colspan="4">Ammina DNA:</td></tr><tr><td>(CAGT)5-NH2</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>La maggior parte delle aziende di sintesi del DNA</td></tr> <tr><td>(CAGT)5(T)40-NH2</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>La maggior parte delle aziende di sintesi del DNA</td></tr><tr><td>NHS-GLA-Benzilguanina</td><td>New England Biosciences</td><td>S9151</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8428</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>NAP5 Colonna</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0853-01</td><td></td></tr><tr><td>C18 Colonna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Coltura cellulare di mammifero & Imaging</td></tr><tr><td>Linea cellulare che esprime la proteina marcata SNAP</td><td>New England Biosciences</td><td>E9100S</td><td></td></tr><tr><td>McCoys 5A</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td></td><td>Specifico per la coltura U2OS</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td></td><td>Specifico per la coltura U2OS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>UCSF Cell Culture Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek II Chambered Coverglass</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>Piastra matriplate a 96 pozzetti</td><td>Brooks Life Science Systems</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% Caseina solubile in alcali</td><td>EMD Millipore</td><td>70955</td><td>Non tutte le caseine sono uguali</td></tr><tr><td colspan="4">(Opzionale) Reagenti per sintesi del DNA</td></tr><tr><td>5' Modificatore di ammina C6</td><td>Glen Research</td><td>Oct-06</td><td></td></tr><tr><td>dA-Thiophosphoramidite</td><td>Glen Research</td><td>10-700</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software di analisi</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>http://valelab.ucsf.edu/~schindelin/</td> RyTrack.pro http://sun.iwu.edu/~gspaldin/rytrack.html <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracker</td><td></td><td></td><td></td>http://www.gartnerlab.ucsf.edu/more/software</tr></tbody></table>

produzione e targeting di monovalente quantum dots

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

La natura multivalente dei punti quantici commerciali (QD) e le difficoltà associate alla produzione di punti monovalenti hanno limitato le loro applicazioni in biologia, dove il raggruppamento e l'organizzazione spaziale delle biomolecole sono spesso oggetto di studio. Descriviamo qui un protocollo per produrre punti quantici monovalenti (mQD) che può essere realizzato nella maggior parte dei laboratori di ricerca biologica tramite una semplice miscelazione di QD core/shell CdSe/ZnS con DNA fosforotioato (ptDNA) di lunghezza definita. Dopo che un singolo filamento di ptDNA ha avvolto il QD, i filamenti aggiuntivi vengono esclusi dalla superficie. La produzione di mQD in questo modo può essere realizzata su piccola e grande scala, con reagenti commerciali e in passaggi minimi. Questi mQD possono essere specificamente diretti a bersagli biologici mediante ibridazione a un DNA bersaglio complementare a singolo filamento. Dimostriamo l'uso di questi mQD come sonde di imaging marcando i recettori Notch marcati con SNAP su cellule di mammifero vive, bersaglio di mQD con una porzione di benzilguanina.

Il trasferimento di fase dei QD da un organico ad una fase acquosa è critica per la produzione di MQDS, ma può essere sia condizionamento e QD-specifico. Trasferimento di fase nella sezione 1.1 dovrebbe apparire pulito come i primi due flaconcini in Figura 3. Se il trasferimento appare più come fiala 3, allora si dovrebbe cercare di nuovo con condizioni diverse. Una volta che i QD sono rivestite con il DNA caricata negativamente dovrebbero migrare su un gel separatamente dai QD non avvolto. Utilizzando una aliquota di QD da scartare come un controllo, una seconda, fascia più veloce la migrazione dovrebbe apparire sulla aggiunta del ptDNA, come si è visto nel primo gel in figura 2B. Formazione completa a MQDS è dimostrato con la perdita della banda immobile, e la sua caduta nella banda cellulare come visto nell'ultimo gel in Figura 2B. Se una aliquota di prodotto dell'MQD migra come una singola banda separabili dai QD da scartare, quindi i vostri MQDS sono monovalenti e r Eady per essere utilizzato in ulteriori passi. Etichettatura delle cellule dovrebbe essere specifico per il target di vostra scelta e dovrebbe essere dipendente da livelli di espressione di proteine ​​e concentrazione MQD. Ottimizzazione empirica sia di concentrazione MQD e MQD passivazione è spesso necessaria per una determinata applicazione. Figura 4B mostra l'etichettatura delle cellule U2OS che esprimono un recettore Notch SNAP-tag con MQDS che variano in concentrazione da 0,5 Nm a 10 Nm. <img fo:content-width="6in" width="600" alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig1highres.jpg"> Figura 1 modulare il targeting di MQDS. MQDS ibridano a ssDNA funzionalizzati da varie molecole di targeting. Benzylguanine-legata obiettivi DNA MQDS di SNAP-tag proteine ​​di fusione. Altri 5 'modifiche e sequenze di DNA permettono la presa di mira di MQDS a una varietà di altre biomolecole./files/ftp_upload/52198/52198fig1highres.jpg "target =" _blank "&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img fo:content-width="6in" width="600" alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig2highres.jpg"> Figura 2 Schema per la produzione di MQDS. (A) QD Organic-fase vengono trasferite alla fase acquosa mediante trattamento con mPEG tiolo e TBAB, avvolto con ptDNA, e passivato con carbossi PEG6 tiolo alcani. Immagini rappresentative TEM sono QD545 organico, QD585, e QD605 rispettivamente. (B) Un metodo per determinare empiricamente la stechiometria di interazione tra QD e ptDNA al precedente punto due. QD &amp; ptDNA stechiometrie sono empiricamente verificate da densitometria tale che la stechiometria di reazione finale è di 1: 1 (QD: ptDNA). Il numero iniziale di moli di ptDNA è moltiplicato per il rapporto di QD: MQD, e regolata dal af effettivo volume di ter coniugazione di cedere il numero di moli necessari per raggiungere 1:. 1 coniugazione <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52198/52198fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img fo:content-width="6in" width="600" alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig3highres.jpg"> Figura 3. dettagli sperimentali per la produzione di MQDS. (A) foto rappresentative di successo e fallito il trasferimento di fase. QD dovrebbe trasferire visivamente tra la fase organica densa e la fase acquosa meno densa. Separazione di fase incompleta indica scarsa trasferimento. (B) ptDNA può essere sostituito dal alcano-PEG-tiolo. Dati gel di destra è rappresentativo di una reazione in cui una frazione significativa di ptDNA sono stati sfollati dai QD a causa di eccesso di passivazione.ES.jpg "target =" _blank "&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img fo:content-width="6in" width="600" alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52198/52198fig4highres.jpg"> Figura 4 Etichettatura proteine ​​SNAP-tag su cellule vive. (A) Schema che dimostra l'espressione, l'attaccamento e l'etichettatura di un recettore SNAP-tag con un MQD BG-targeting. (B) l'etichettatura Rappresentante di cellule che esprimono una SNAP-Notch-mCherry costruire a varie concentrazioni MQD. MQDS passivato con PEG12 colocalizzano con mCherry indica etichettatura specifica. Densità di etichettatura più bassi (&lt;0,5 nM) sono generalmente preferibili per l'inseguimento singola particella. Barra della scala è di 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52198/52198fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Forniamo istruzioni dettagliate per la preparazione di punti quantici mirati monovalenti (mQD) da DNA fosforotioato di lunghezza definita. L'avvolgimento del DNA avviene ad alta resa e, pertanto, i prodotti non richiedono purificazione. Dimostriamo l'uso del tag SNAP per indirizzare gli mQD ai recettori della superficie cellulare per applicazioni di imaging di cellule vive.

Produzione e Targeting di monovalente Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un protocollo semplice e generalizzabile per la preparazione di punti quantici monovalenti per l'imaging di singole molecole di proteine di membrana bersaglio in cellule vive. Ciò si ottiene introducendo prima una quantità stechiometrica di un lungo ligando oligonucleotidico polifosfocentide in un punto quantico. Il DNA lungo avvolge completamente il punto quantico e impedisce il legame di una seconda molecola di DNA, generando così punti quantici monovalenti in modo esclusivo e quantitativo. Separatamente.Il DNA funzionalizzato con sequenze complementari di benzoghine, è preparato per colpire le proteine di membrana snap taggate espresse su cellule vive. Successivamente, il trattamento sequenziale di cellule vive che esprimono proteine di membrana con snap tagging con benzoghina, DNA, seguito da punti quantici monovalenti, porta alla marcatura selettiva del recettore bersaglio. Il passaggio finale consiste nell'visualizzare la distribuzione della proteina bersaglio e le traiettorie di diffusione tramite microscopia a fluorescenza a singola molecola.In definitiva, vengono estratte informazioni spaziotemporali dinamiche in tempo reale delle proteine bersaglio nelle cellule vive per rivelare come funzionano le molecole bersaglio in vivo. Il vantaggio principale di questo approccio alla sintesi di punti quantici monovalenti è la sua semplicità e accessibilità generale. A differenza di molti altri approcci che richiedono competenze o attrezzature speciali, questo approccio è relativamente semplice.Di conseguenza, dovrebbe essere disponibile per qualsiasi laboratorio e per qualsiasi disciplina. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando Zeva ed io abbiamo iniziato a discutere di come la nostra esperienza sulla sintesi delle nanoparticelle di DNA potesse essere combinata per controllare meglio la reattività delle nanoparticelle. Abbiamo condotto insieme gli esperimenti iniziali sul principio di approvazione durante un fine settimana.Sempre più spesso, la nostra prima prova ha funzionato con successo. In questo video, utilizziamo punti quantici monovalenti per studiare la dinamica delle singole particelle del recettore Notch nelle cellule di mammifero vive. Tuttavia, questi punti quantici monovalenti dovrebbero trovare ampia utilità per tutti gli studi che richiedono il tracciamento di singole particelle.In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non tutti i punti quantici disponibili in commercio sono uguali, sia geometricamente che chimicamente. Pertanto, sarà necessaria una certa ottimizzazione. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per il trasferimento di fase e le fasi di aggiunta del DNA correlate al fosforo I potrebbero intimidire un laboratorio senza esperienza di chimica multisintetica.Per iniziare, diluire 200 microlitri di una soluzione monomolare di punti quantici in fase organica con 400 microlitri di cloroformio in una fiala di vetro da cinque millilitri. Combina questi punti quantici con una miscela di 400 microlitri di soluzione di cloroformio di bromuro di tetra butile ammonio 0,3 molare e 36 microlitri di tiolo pec puro e agitare per una notte. Quindi aggiungere 800 microlitri di una soluzione acquosa di idrossido di sodio 0,2 molare e agitare per 30 secondi.Un trasferimento di fase avviene entro pochi minuti, indicato dal trasferimento delle particelle colorate alla fase acquosa sopra la fase organica più densa. Se le particelle si aggregano in una terza fase tra la fase acquosa e quella organica, aumentare il tempo di incubazione con la manopola pec. Se la fase acquosa rimane limpida, i punti quantici non si sono trasferiti in fase.Aumentare la concentrazione del pettorale per alleviare lo scarso trasferimento di fase. Successivamente, recupera la fase acquosa colorata. Quindi concentrare i punti quantici raccolti con la colonna di spin racon fino a un millilitro.Aggiungere la soluzione concentrata di punti quantici in una colonna cidex NEP 10 pre-bilanciata con tampone tris da 10 millimolari contenente 30 millimolari di cloruro di sodio. pH otto eluire i punti quantici con 1,5 millilitri di tampone di eluizione per gravità. Procedere alla misurazione della concentrazione di punti quantici con spettroscopia di assorbimento a 350 nanometri.Per preparare un acquisto di punti quantici mirati monovalenti o sintetizzare fosfo-otto DNA, preparare un millilitro di soluzione di punti quantici molari da 100 ano molari in tampone tris da 10 millimolari contenente 30 millimolari di cloruro di sodio a pH otto. Quindi, aggiungere 500 microlitri della soluzione di DNA 100 nanomolari fosfofo IO otto. Far cadere la goccia a goccia fino ai punti quantici acquosi per un minuto, mescolando energicamente.Mescolare o mettere il composto su uno shaker per altre nove ore. Rimuovere circa 10 microlitri della miscela di punti quantici per farla funzionare su un gel agros analitico. Inoltre, rimuovere una concentrazione simile di punti quantici non coniugati in fase acquosa.Quindi a circa due microlitri di sei x fi chiamare il tampone di caricamento per aumentare la densità della soluzione. Analizza questi due campioni insieme su un gel AROS allo 0,8% in volume di peso in tampone di bide di sodio per 15 minuti a 150 volt. Il risultato dovrebbe essere una singola banda nella corsia di controllo non coniugata che migra vicino al pozzo e due bande nella corsia con punti quantici coniugati.Calcola la frazione di punti quantici non coniugati utilizzando l'intensità relativa delle due bande. Quindi utilizzare quella frazione per calcolare il volume aggiuntivo di 100 nanomolari di soluzione di fosfo-otto DNA necessaria per abbinare il numero di punti quantici quantistici. Ripetere la procedura ancora una volta con questo volume calcolato o fino a quando i punti quantici coniugati collassano in una singola banda sul gel, indicando la completa coniugazione di tutti i punti quantici.Quindi, aggiungere 100 microlitri di carbossi 10 millimolare. Agganciare sei tioli alcani ai punti quantici monovalenti coniugati mirati e agitare per 10 minuti. Per rimuovere l'eccesso di alcano pegol, aggiungere 0,5 millilitri della soluzione di punti quantici ad ACE fitex knap a cinque colonne pre equilibrate con tampone eluciano.Quindi raccogliere i punti quantici mirati monovalenti con un millilitro di tampone elu mediante flusso di gravità. Concentrare i punti quantici raccolti con una colonna di spin con centrica. Questi punti quantici monovalenti mirati possono essere conservati a quattro gradi Celsius al mese, mangiati i punti quantici monovalenti appena prima di un esperimento di imaging utilizzando reagenti come caseina o cellule di piastra di albumina sierica bovina che esprimono la proteina snap tagg su riflessione interna totale, fluorescenza o vetro di qualità per tappeto erboso.In questo particolare esperimento, utilizziamo una linea cellulare U2 OS che esprime un recettore con tacca a scatto e superfici di vetro di alta qualità dopo che le cellule si sono attaccate al vetro, rimuoviamo il terreno di coltura e laviamo con soluzione salina tamponata con fosfato o PBS. Quindi incubare le cellule per 10-30 minuti a temperatura ambiente in PBS o terreni cellulari contenenti benzoile Guinea DNA, preparati come dettagliato nel protocollo di testo dopo l'incubazione con benzo Guin, DNA, lavare accuratamente le cellule con PBS o terreni cellulari, quindi incubare le cellule per circa 5-10 minuti con i punti quantici monovalenti. Lavare i punti quantici monovalenti non legati e riportare le cellule in un tampone o terreno adatto sia per l'imaging che per l'immagine di coltura.Le cellule che utilizzano un microscopio per tappeti erbosi a causa della luminosità dei punti quantici monovalenti raccolgono immagini ad alti frame rate nel tappeto erboso mentre riproducono il lato basale di una cellula viva. Una volta che i punti quantici sono rivestiti con il DNA caricato negativamente, dovrebbero migrare su un gel separatamente dai punti quantici non rappati utilizzando un'aliquota di punti quantici non avvolti come controllo. Una seconda banda di migrazione più veloce dovrebbe apparire con l'aggiunta del Phosphol IO otto DN. Una formazione completa dei punti quantici monovalenti è dimostrata con la perdita della banda immobile e il suo collasso nella banda mobile.Se un'aliquota del prodotto dei punti quantici monovalenti migra come una singola banda separabile dai punti quantici non avvolti, allora i punti quantici sono effettivamente monovalenti e pronti per essere utilizzati nelle fasi successive. Qui viene mostrata la marcatura rappresentativa delle cellule che esprimono un costrutto di ciliegia M con tacca a scatto a varie concentrazioni di punti quantici monovalenti. Punti quantici monovalenti passivati con PEG 12 co-localizzati con ciliegia M che indicano un'etichettatura specifica.Densità di marcatura più basse sono generalmente preferibili per il tracciamento di singole particelle. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare una nanoparticella fluorescente che è monovalente modulare brillante e mirata Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due preparazione dei dati dei punti quantici monovalenti e un'ora di etichettatura delle fotocellule se viene eseguita correttamente. È importante ricordare che utilizzando i reagenti di partenza disponibili in commercio, possiamo produrre punti quantici monovalenti con eccellenti proprietà fotofisiche che possono essere utilizzati per lunghi esperimenti di tracciamento di singole particelle.Seguendo questa procedura, altre proteine possono essere marcate con fusioni di snap tag per seguire le loro dinamiche molecolari su cellule vive. Lavorare con il punto quantico può essere estremamente difficile da spolverare, quindi non dimenticare di indossare guanti protettivi e camici da laboratorio durante l'esecuzione di questa procedura.

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Nanoparticelle quali punti quantici di semiconduttori (QD) può essere utilizzato per creare agenti fotoattivabili per applicazioni anti-microbici o anti-cancro. Questa tecnica mostra come acqua, solubilizzazione di tellururo di cadmio (CdTe) QDs, coniugato ad un antibiotico, ed eseguire un test di inibizione batterica basata su curve di crescita e conta in piastra.

Solubilizzazione e Bio-coniugazione dei punti quantici e test di tossicità batterica curva di crescita e conta in piastra

Si descrive la preparazione di punti quantici colloidali con minimizzata dimensione idrodinamica per singola molecola imaging di fluorescenza. Rispetto ai tradizionali punti quantici, queste nanoparticelle sono di dimensioni simili alle proteine ​​globulari e sono ottimizzati per singola molecola luminosità, stabilità contro la fotodegradazione, e resistenza al legame non specifico a proteine ​​e cellule.

Compact Quantum Dots per singola molecola Imaging

Questo articolo presenta un protocollo di fabbricazione dettagliato per cancelli definiti punti quantici di semiconduttori laterali su eterostrutture di arseniuro di gallio. Questi dispositivi in ​​nanoscala sono utilizzati per intrappolare alcuni elettroni per l'uso come bit quantici in elaborazione quantistica o per altri esperimenti mesoscopiche quali misure di conduttanza coerenti.

Nanofabbricazione di Porta definiti-GaAs / AlGaAs laterali Quantum Dots

Vengono discussi il processo di fabbricazione e le tecniche di caratterizzazione sperimentale relative alle pompe a singolo elettrone basate su punti quantici di silicio metallo-ossido-semiconduttore.

Silicio metallico-ossido-semiconduttore Quantum Dots per singolo elettrone di pompaggio

In questo protocollo, la sintesi di punti quantici (QD) InP/ZnS privi di Cd è dettagliata. I QD basati su InP stanno guadagnando popolarità a causa della tossicità degli ioni Cd2+ che possono essere rilasciati attraverso la degradazione delle nanoparticelle. Dopo la sintesi, i QD vengono solubilizzati in acqua utilizzando un polimero anfifilico per l'uso in applicazioni biomediche.

Sintesi di Cd-libera InP / ZnS Quantum Dots adatto per applicazioni biomediche

Viene descritto un metodo in base al quale le nanoparticelle di punti quantici (QD) possono essere utilizzate per studi immunocitochimici correlati di tessuto patologico umano incorporato in resina epossidica. Utilizziamo QD coniugati con frammenti di anticorpi commerciali che vengono visualizzati mediante microscopia ottica a fluorescenza a campo largo e microscopia elettronica a trasmissione.

Correlativo luce e microscopia elettronica Utilizzando Quantum Dot nanoparticelle

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Fluorescenza di risonanza di un puntino di InGaAs Quantum in una cavità planare usando rilevazione ed eccitazione ortogonale

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Iniezione di elettroni avanzata e confinamento eccitone per diodi emettitori di luce pura blu Quantum-Dot introducendo parzialmente ossidato catodo in alluminio

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Sintesi di in37P20(O2CR)51 cluster e la loro conversione in INP Quantum Dots

Il presente protocollo descrive un metodo di immuno-marcatura di una proteina nelle sezioni del tessuto cardiaco utilizzando punti quantici. Questa tecnica fornisce uno strumento utile per visualizzare la localizzazione e l'espressione subcellulare di qualsiasi proteina a livello ultrastrutturale.

Visualizzazione della localizzazione subcellulare di una proteina nel cuore utilizzando l'immuno-marcatura mediata da punti quantici seguita da microscopia elettronica a trasmissione

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Immunodosaggio fluorescente a flusso laterale basato su nanosfere di punti quantici

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