Analisi Specificità di proteine ​​lisina metiltransferasi Utilizzando SPOT Peptide Array

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare la specificità del substrato delle proteine lisina metiltransferasi o PK mts. Ciò si ottiene mediante l'identificazione di un substrato iniziale e la preparazione di array di peptidi con diverse varianti di questo substrato contenenti singoli scambi di amminoacidi in diverse posizioni. In una seconda fase, l'array peptidico viene incubato con PKMT in presenza di un donatore di gruppo metilico radioattivo, che consente il rilevamento della metilazione del peptide mediante trasferimento della radioattività al punto peptidico corrispondente.

Successivamente, l'array viene esposto a una pellicola di raggi X e analizzato quantitativamente al fine di determinare l'attività di metilazione in ciascuno dei peptidi. E per definire il profilo di specificità del PKMT, i risultati mostrano quali amminoacidi nel peptide substrato sono critici per la sua metilazione da parte del PKMT. Il vantaggio principale di questa tecnica o di metodi esistenti come la metilazione di singoli peptidi è che un certo numero di peptidi diversi può essere testato in un unico esperimento in modo efficiente in termini di costi.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della metilazione della lima proteica, come la specificazione di nuovi substrati precedentemente sconosciuti di PK mtss. Quindi questo metodo può fornire informazioni sulla specificità delle PK mts. Può anche essere applicato ad altri sistemi come le protein chinasi, altri metodi proteici, le transferasi o aggiungere alle transferasi.

Ho avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando ho acquisito familiarità con la possibilità di preparare grandi array di peptidi personalizzati a costi ragionevoli utilizzando la sintesi spot di peptidi Per iniziare questa procedura, progettare sequenze peptidiche per la sintesi utilizzando il software multi pep spotter. Inserisci le sequenze peptidiche come un codice di una singola lettera con ogni lettera che definisce l'amminoacido specifico dopo questo pre-rigonfiamento, il peg amminico ha funzionalizzato la membrana spot all'estremità, all'estremità della dimetilformammide o al DMF per 10 minuti. Al termine, posizionare la membrana bagnata sul telaio del sintetizzatore spot senza bolle d'aria o rughe.

Asciugare completamente la membrana per almeno 10 minuti prima di iniziare il programma di sintesi. Lavare la membrana tre volte con etanolo al 100% per generare il legame ammidico con il gruppo amminico libero sulla membrana. Attivare il gruppo carbossilico dell'amminoacido in ingresso aggiungendo DIC e etilidrossiamino sino acetato al derivato dell'amminoacido.

Dopo l'attivazione, individuare i volumi desiderati di amminoacidi attivati sulla membrana funzionalizzata con il peg amminico utilizzando il robot programmabile. Ripetere il passaggio precedente tre volte per garantire un migliore accoppiamento del primo amminoacido attivato. Dopo aver incubato la membrana per 20 minuti, lavarla con DMF per rimuovere gli amminoacidi disaccoppiati dopo l'essiccazione e bloccare i gruppi amminici liberi.

Lavare la membrana con DMF quattro volte e poi incubare con il 20% di piperina in DMF per 20 minuti per rimuovere il gruppo protettivo FM. Dopo aver lavato e asciugato la membrana, ripetere le fasi di spotting e rimozione F MOC fino a raggiungere la lunghezza del peptide desiderata. Dopo l'ultima protezione F MOC gruppo D, lavare la membrana con DMF ed etanolo al 100%.

Quindi trattare la membrana con 0,02% di blu fenolo brom in DMF per un minimo di cinque minuti fino a quando non diventa completamente blu. Dopo aver lavato e asciugato la membrana, rimuoverla dal sintetizzatore e riporla in una scatola resistente agli agenti chimici. Trattalo con 20-25 millilitri di una miscela di protezione della catena laterale D, composta dal 95% di acido tricloroacetico per scindere i gruppi di protezione della catena laterale e reagenti scavenger per proteggere le catene laterali degli aminoacidi dalla modifica.

Dopo esserti assicurato che la miscela di protezione profonda copra la membrana, chiudi completamente la scatola e incubala per una o due ore, agitando delicatamente dopo l'incubazione. Lavare la membrana sei volte con 20-25 millilitri di clorometano per due minuti ciascuna. Dopo aver lavato due volte con etanolo al 100%, asciugare la membrana in un essiccante per una notte.

Successivamente, pre-incubare la membrana dell'array di peptidi in un sacchetto di plastica sigillato contenente il rispettivo tampone di metilazione senza enzima e incontrarlo con un gruppo metilico marcato radioattivamente Per 10 minuti, scartare il tampone di pre-incubazione e incubare la membrana in otto millilitri di tampone di metilazione contenente il rispettivo PKMT per una o due ore. Successivamente, scartare il tampone di metilazione in un contenitore per rifiuti radioattivi e lavare gli array di peptidi cinque volte con 20 millilitri di tampone contenente 100 millimolari di bicarbonato di ammonio e 1% STS per cinque minuti per rimuovere la proteina legata. Dopo aver gettato l'ultimo tampone di lavaggio nel contenitore delle scorie radioattive, incubare la membrana per cinque minuti in 10 millilitri di soluzione amplificante.

Quindi scartare la soluzione di amplificazione nel contenitore dei rifiuti radioattivi per solventi organici. Sigillare l'array di peptidi in un sacchetto di plastica e metterlo in una cassetta per autoradiografia. Posizionare la pellicola per autoradiografia sul peptide in una stanza buia.

Quindi chiudere con cura la cassetta. Dopo aver esposto la pellicola a meno 80 gradi Celsius, svilupparla per analizzare i risultati. Infine, catturare l'immagine un paio di volte con tempi di esposizione diversi per evitare la saturazione di substrati peptidici fortemente metilati.

Un esempio di reazione di metilazione di un array di peptidi con NSD one è mostrato qui. L'asse orizzontale rappresenta la sequenza del peptide e in direzione verticale. L'amminoacido alterato è indicato metilazione con nsd, uno mostra che agisce specificamente su H tre K 36 e riconosce da tre a quattro residui di amminoacidi su entrambi i lati del consolidamento della lisina bersaglio dei tre esperimenti di array peptidico di NSD uno è mostrato qui.

Circa l'85% dei peptidi mostra deviazioni standard inferiori a più o meno il 20% e più del 97% dei peptidi mostra deviazioni standard inferiori a più o meno il 30%I dati calcolati sul fattore di discriminazione mostrano che NSD uno preferisce i residui aromatici nella posizione meno due. Nei siti meno uno e più due, predilige i residui atici idrofobici. E nel sito più uno, c'è una preferenza per arginina, lisina, glutammina o asparagina.

Potenziali nuovi substrati peptidici possono essere trovati mediante ricerche nel database del proteoma umano. La forte metilazione di alcuni di questi peptidi con altri conferma la loro identità come nuovi substrati peptidici NSD one. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di utilizzare il substrato iniziale più appropriato Seguendo questa procedura.

Altri metodi come la metilazione delle proteine corrispondenti in vitro e nelle cellule possono essere eseguiti per scoprire se le proteine sono accettate come substrati, così come dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della mesilazione della lisina proteica, per definire la specificità del substrato di molte PK mts e identificare diversi nuovi substrati. Ciò ha aiutato a comprendere l'importante funzione biologica dei PK mts.

Non dimenticare che si può affermare di lavorare con la radioattività e i solventi organici nella sintesi dei peptidi e che è necessario prendere sempre le dovute precauzioni durante l'esecuzione di questa procedura.